İnsan DNA Onarım Proteinler Genetik Araştırmalar Maya Model Sistemi olarak kullanma

WRN plazmidleri, Cel I ve Mlu I restriksiyon endonükleazları ile sindirilir ve fragmanlar jelden saflaştırılır. Cel I ve Mlu I ile sindirilmiş bu ekspresyon vektörü WRN fragmanları, ardından maya vektörünün Cel I ve Mlu I bölgelerine ligasyonla aktarılır. Çok kopya plazmid ayrıca bir TRP 1 seçilebilir marka geni içermektedir.

W Rrn konstrüktleri standart protokoller izlenerek mayaya transforme edilir ve transformantlar triptofan içermeyen sentetik tamamlayıcı glikoz besiyerlerinde seçilir. Ardından, münferit transformantlar triptofan içermeyen sentetik tamamlayıcı glikoz besiyerlerine çizilir ve plaklar ana plaktan itibaren inkübe edilir. WRN transforme edilmiş SGS1 top üç çift mutant suşu transformantlarında yavaş büyüme fenotipinin restorasyonunu analiz etmek için, transformantlar glikoz veya galaktoz içeren plakalara çizilir.

WRN ekspresyonunun HU ve MMS hassasiyeti üzerindeki etkisini analiz etmek amacıyla, WRN eksprese eden maya hücrelerinin hücre döngüsü dağılımını belirlemek için spotlama yapılır. DAPI boyaması gerçekleştirilir. WRN'nin heterolog konaktaki ekspresyonu, Western Blot analizi ile analiz edilir.

Merhaba, ben Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin enstitülerinden biri olan Ulusal Yaşlanma Enstitüsü'ndeki moleküler gerontoloji laboratuvarının DNA helikazlar bölümünden Robert Broch. Merhaba, ben de Ulusal Yaşlanma Enstitüsü'ndeki moleküler gerontoloji laboratuvarının DNA helikazlar bölümünden Monica Agarwal. İnsan DNA onarım proteinlerinin ve genetik yolların rollerini anlamak, birçok araştırmacı için zorlu bir süreçtir.

Memeli sistemlerdeki genetik çalışmalar; mutant genetik hücre hatları, düzenleyici ekspresyon sistemleri ve uygun seçilebilir markörler gibi kolayca erişilebilir araçların eksikliği nedeniyle sınırlı kalmıştır. Bugün size, erken yaşlanmanın önlenmesinde helikaz olarak bilinen bir DNA sarmal çözücü enzimin moleküler ve hücresel fonksiyonlarını araştırmak için model sistem olarak mayanın kullanıldığı prosedürleri göstereceğiz. Bu prosedürleri laboratuvarımızda, erken yaşlanma bozukluğunda DNA onarımı ve genomik stabilitenin korunmasında kusurlu olan insan burner gen ürününün rolünü genetik olarak karakterize etmek için kullanıyoruz.

Werner Sendromu, mayadaki beş insan req ailesi helikaz vakasından biridir. İnsan Werner'in replikasyon stres yanıtındaki rolünü incelemek için isimlendirilmiş tek bir sgs birimi bulunmaktadır. Werner ekspresyonunun mayadaki mutant arka planında çeşitli biyolojik son noktalar üzerindeki etkisini inceledik.

Öyleyse hadi başlayalım. Heterolog konakçı olarak maya kullanacağımız için ilk adımımız, insan Werner genini veya varyantını bir maya vektörüne klonlamak olacaktır. Werner plazmidleri SalI ve MluI restriksiyon endonükleazları ile sindirilmiş ve saflaştırılan fragmanlar, galaktozla indüklenebilir bir promotörün düzenlemesi altındaki maya ekspresyon vektörünün SalI ve MluI bölgelerine ligat edilmiştir.

Çok kopya plazmit, ayrıca bir TRP1 seçilebilir belirteç içermektedir. Bu Werner ekspresyon plazmitleri daha sonra bu çalışmada kullanılan uygun triptofan trofik maya suşlarına transforme edilir. Transformantlar, süspansiyonun sentetik komple glikoz besiyerine ekilmesiyle seçilir.

Triptofan içermeyen plakalarda, koloniler görünene kadar 30 °C'de üç ila dört gün boyunca inkübe edin. Koloniler büyüdüğünde, tekil transformantları sentetik komple glikoz besiyerine ekim yapın ve plakaları 30 °C'de iki ila üç gün inkübe edin. İnsan weer geni ve varyantlarını eksprese eden mutant maya suşlarının hücresel fenotipleri, sonraki bölümlerde gösterilen tekniklerle incelenir.

En üstteki üç mutant ciddi bir büyüme kusuru göstermektedir. Bununla birlikte, SGS1 genindeki mutasyon, en üstteki üç mutantın yavaş büyüme fenotipini baskılamaktadır. Werner ekspresyonunun wild type SGS1 veya SGS1 en üstteki üç suşun büyümesi üzerindeki etkisini incelemek için, ilgili suşları vektör veya Werner ekspresyon plazmidi ile birlikte, triptofan içermeyen ancak pozitif kontrol olarak %2 glikoz veya %2 galaktoz içeren sentetik komplet besiyeri plaklarına ekim yapın. SGS1 ekspresyonunun etkisi belirlendi. Plakları 30 °C'de iki gün boyunca inkübe edin.

Vektör veya Werner ile transforme edilmiş vahşi tip ve SGS one mutant suşlarının büyüme modellerinde herhangi bir fark görülmemektedir. Buna karşın, Werner transforme edilmiş SGS one top three çift mutant suşu, Werner'in yavaş büyüme fenotipini geri döndürmek için gereken fonksiyonel gereksinimleri değerlendirmek amacıyla, vektörle transforme edilmiş S GS one top three çift mutant suşuna göre önemli ölçüde daha yavaş büyümektedir. sgsone top three arka planında, Werner katalitik domain mutantları ile transforme edilmiş sgs one top three suşları, iki gün sonra %2 glikoz veya %2 galaktoz içeren triptofan eksik sentetik komple plakalara ekilmiştir.

E 84 A olarak belirtilen Werner Eksonükleaz mutantının inkübasyonu, Werner'e benzer şekilde yavaş büyüme fenotipini geri kazandırır; bu durum, en üstteki üç yavaş büyüme fenotipinin restorasyonu için eksonükleaz aktivitesinin gerekli olmadığını göstermektedir. Werner Helikaz mutantı ise iyi büyür; bu da en üstteki üç yavaş büyüme fenotipinin restorasyonu için Werner helikaz aktivitesinin gerekli olduğunu kanıtlar. Werner'in sgs'lerin büyüme hızını etkileme kapasitesini belirlemek için.

Protein ekspresyonunun düşük seviyelerde olduğu bir top three suşunu, Werner vektörü veya sgs1 ile transforme edilmiş bir top three suşu ile birlikte; triptofan içermeyen ancak artan konsantrasyonlarda galaktoz içeren sentetik tam plakalara ekim yapın. Tüm plakaları 30 °C'de iki gün boyunca inkübe edin. Werner ve Werner ekzonükleaz mutantları, tüm galaktoz seviyelerinde top three slope fenotipini geri kazandırır.

Buna karşın, Werner Helikaz mutantlarında bu durum görülmez. SGS1 top3 çift mutantının, DNA alkilleyici ajan metil metan sülfonat (MMS) veya replikasyon inhibitörü hidroksiüreye (HU) karşı, top3 tek mutantına göre daha az hassas olduğu gösterilmiştir; Werner ekspresyonunun SGS1 veya SGS1 top3 suşlarının MMS ve HU hassasiyeti üzerindeki etkisini belirlemek için, kontrol grubu olarak vektör veya Werner ile transforme edilmiş maya suşlarını, triptofan içermeyen sentetik komplet rafinoz besiyerinde 30 °C'de büyütün.

Vektörle transforme edilmiş vahşi tip bir parental suş kullanarak, tüm kültürleri triptofan içermeyen sentetik tamamlayıcı rafinoz ortamına yeniden ekleyin ve 30 °C'de erken log fazına kadar büyütün. Kültürler erken log fazındayken, triptofan içermeyen sentetik tamamlayıcı ortam kullanarak bu suşların 10.000 katına kadar on katlı seri dilüsyonlarını hazırlayın; her bir dilüsyondan dört µL'yi, 10 mM HU veya 0,0025% MMS içeren triptofan eksik sentetik tamamlayıcı GAL ortamlı plakalara damlatın ve plakaları 30 °C'de dört gün boyunca inkübe edin. Vahşi tip sgs ile transforme edilmiş bir SGS1 top3 çift mutantı.

Sgs1'in eksikliği, hücre döngüsünün geç SG iki fazında gecikmeye yol açarak dambıl şeklinde bir morfolojiyle sonuçlanır. Buna karşılık, vahşi tip mayalar hücre bölünmesini tamamlar; bu durum, Werner transformasyonlu sgs1Δ3 suşunun hücre döngüsü dağılımını incelemek için daha az dambıl şeklinde hücre bırakır. Öncelikle, aşağıdaki suşların triptofan içermeyen sentetik kompleks RAF ortamındaki logaritmik büyüme aşamasındaki kültürlerini 30 °C'de gece boyunca büyütün.

SGS one top three'ü Werner vektörü veya SGS one ve vektör ile transforme edilmiş yabanı tip ebeveyn suşu ile OD 0,05'te yeniden inoküle edin. Yeniden inokülasyon sonrası, kültürleri OD 0,5'e ulaşana kadar büyütün ve santrifüjle hasat edin. Ardından, %2 konsantrasyonda gala laktoz ekleyerek Werner ekspresyonunu indükleyin. Kültürlerin 30 °C'de altı saat boyunca büyümesine izin verin.

Altı saat sonra kültürleri hasat edin ve santrifüjasyonla hücreleri toplayın. Santrifüjasyonun ardından kültürleri mikro santrifüj tüplerine aktarın ve hücreleri bir kez PBS ile yıkayın. Ardından hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca %70 etanol ile fikse edin; fikse edilen hücreleri iki kez PBS ile yıkadıktan sonra hücreleri bir miktar XPBS içinde yeniden süspande edin.

Hücre süspansiyonunu bir lam üzerine yerleştirin ve 1 µg/mL konsantrasyonda DAPI içeren vector shield montaj medyumu ekleyin. Hücre döngüsünün S/G2 evresindeki maya hücrelerinin karakteristik özelliği olan dambıl şeklinde çekirdeğe sahip hücreleri görmek için lamları bir XI Saxo vert mikroskobunda inceleyin.

Transforme edilmiş SGS one veya SGS one ilk üç maya suşlarında Werner proteininin ekspresyonunu veya varyasyonunu belirlemek için; öncelikle, Werner proteininin ekspresyonunu indüklemek amacıyla suşları galaktoz içeren besiyerinde altı saat boyunca büyütün. Hücreleri santrifüj ile topladıktan sonra, PBS ile yıkayın ve yeniden süspande edin.

Alkali liziz tamponu. Hücreleri beş dakika boyunca kaynatın, ardından santrifügasyonla berraklaştırın ve bir molar hidroklorik asit ile nötralize edin. Bu lizatlar, farklı galaktoz konsantrasyonlarının etkisi altında Warner proteininin ekspresyon seviyesini belirlemek üzere %8 ila 16'lık poliakrilamid SDS jellerinde elektroforeze hazır hale gelmiştir.

Öncelikle, kültürleri altı saat boyunca farklı galaktoz konsantrasyonlarıyla indükleyin. Ardından hücreleri santrifüjasyonla hasat edin ve proteaz inhibitörleri içeren tampon çözelti içerisinde yeniden süspanse edin. Karışıma 425 ila 600 mikron boyutunda cam boncuklar ekleyin ve hücreleri bir dakika boyunca yüksek hızda vorteksleyerek parçalayın, ardından bir dakika boyunca buz üzerinde bekletin.

Toplam sekiz kez tekrarlayın. Ardından, elde edilen homojenatı 15,000 Gs'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatant fraksiyonunu toplayın. Lizat fraksiyonlarındaki protein miktarını Bradford Yöntemi ile ölçtükten sonra, eşit protein konsantrasyonlarını %8 ila %16'lık Poliakrilamid SDS jellerinde ayırın; Werner ekspresyonu daha sonra Western blot ile sgs'lerdeki Werner ekspresyonu belirlenir.

Bu fotoğraflarda gösterildiği gibi, sgs1-top3, sgs1-top3'ün yavaş büyüme fenotipini geri kazandırır. Vektör Werner ile transforme edilmiş sgs1-top3 suşları veya sgs1 suşları, %2 glukoz veya %2 galaktoz içeren bir SC triptofan plağına ekilir. Galaktoz ile indüklenen Werner ekspresyonu, sgs1-top3 suşunun daha yavaş büyümesine neden olur.

Buna karşılık, yabani tip ebeveyn suşu veya Werner ile transforme edilmiş SGS one suşu büyüme açısından etkilenmemiştir; bu durum, Werner tarafından sağlanan yavaş büyümenin sgs. One top three arka planına özgü olduğunu göstermektedir. Werner varyantları ile transforme edilmiş SGS one top three suşları, yalnızca %2 glikoz veya %2 galaktoz içeren SC triptofan plaklarına ekildiğinde.

Eksonükleaz aktivitesi olmayan Werner, yavaş büyüme fenotipini hâlâ geri döndürebildi. Bu durum, top three'nin yavaş büyüme fenotipini geri döndürmek için Werner'in eksonükleaz aktivitesinin değil, ATPase helikaz aktivitesinin gerekli olduğunu göstermektedir. Bir SGS one top three arka planında Werner, GAL konsantrasyon aralığı boyunca SGS one top three'nin yavaş büyüme fenotipini geri döndürdü.

Bu sonuçlar, sgs1-top3 mutant arka planında yavaş büyüme fenotipinin geri kazanımının, düşük Werner protein ekspresyon seviyelerinde gerçekleştiğini göstermektedir. Werner veya varyantları ile transforme edilmiş sgs1-top3 suşlarının logaritmik olarak büyüyen kültürleri; glukoz veya galaktozun yanı sıra MMS veya HU içeren SC triptofan plaklarına on katlık seri dilüsyonlar halinde damlatılmıştır. Werner ekspresyonunun, sgs1-top3 suşunun MMS ve HU duyarlılığını artırdığını gözlemledik. Ayrıca, sgs1-top3 arka planındaki bu MMS ve HU duyarlılığı etkisi, Werner'in ATP helikaz aktivitesini gerektirmekte, ancak eksonükleaz aktivitesini gerektirmemektedir.

Son olarak, Werner ekspresyonu, büyük uçlu hücrelerin artmış popülasyonu ile belirtildiği üzere, top three'nin karakteristik SG two gecikmesini de geri kazandırmaktadır. Werner eksprese eden sgs one top three mutant hücreleri, vektör ile transforme edilmiş sgs one top three hücreleri ile karşılaştırmalı olarak Dabi ile boyanmıştır.

Çekirdekleri görselleştirmek için ve oklar bölünmemiş çekirdeklerdeki Werner ekspresyonunu göstermektedir. Transforme edilmiş sgs'lerde, en üstteki üç hücre belirtilen galaktoz konsantrasyonları eklenerek indüklendi ve hücreler indükksiyondan altı saat sonra toplandı. Eşit miktarlarda toplam hücre lizatı %8 ila %16'lık poliakrilamid SDS jellerine yüklendi ve ardından anti-Warner antikoru kullanılarak western blot deteksiyonu yapıldı.

İnsan öğrenici geninin katalitik aktiviteleri ve protein etkileşimleri aracılığıyla yürütülen hücresel ve moleküler fonksiyonlarını aydınlatmak için, tanımlanmış maya mutant arka planları ile ilişkili hücresel fenotiplerin nasıl inceleneceğini gösterdik. Maya, genin tanımlanmış yolaklardaki fonksiyonlarını çalışmak için model bir organizma olarak kullanılabilir. Bu prosedürleri uygularken, incelenen genin tanımlanmış yolaklardaki rolünü ayırt edebilmek için uygun bir maya mutant arka planı seçmek önemlidir.

İşte hepsi. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.