İnsan DNA Onarım Proteinler Genetik Araştırmalar Maya Model Sistemi olarak kullanma

WRN plazmitleri, restriksiyon endonükleaz hücresi bir ve MLU bir ile sindirilir ve fragmanlar bir jelden saflaştırılır. Birinci hücre ile MLU bir WN fragmanı ile sindirilen bu ekspresyon vektörleri, daha sonra maya vektörünün bir ila MLU bir bölgesine bağlanır. Çok kopyalı plazmid ayrıca bir TRP seçilebilir işaretleyici içerir.

W Rrn yapıları, standart protokoller izlenerek mayaya dönüştürülür ve transformatörler, triptofan içermeyen sentetik tam glikoz ortamı üzerinde seçilir. Bireysel dönüştürücüler daha sonra triptofan içermeyen sentetik tam glikoz ortamı üzerine çizilir ve plakalar ana plakadan inkübe edilir. WRN transforme SGS'deki yavaş büyüme fenotip restorasyonunu analiz etmek için, ilk üç çift mutant suş dönüştürücüsünden biri, glikoz veya galaktoz içeren plakalar üzerine çizilir.

WRN ekspresyonunun HU ve MMS Duyarlılık üzerindeki etkisini analiz etmek için, WRN eksprese eden maya hücrelerinin hücre döngüsü dağılımını belirlemek için duyarlılık lekelemesi yapılır. DAPI boyama yapılır. Heterolog konakta WRN ekspresyonu Western Blood Analysis ile analiz edilir.

Merhaba, ben Robert Broch, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin enstitülerinden biri olan Ulusal Yaşlanma Enstitüsü'ndeki moleküler gerontoloji laboratuvarında DNA hela vakaları ile ilgili bölümden. Merhaba, ben Monica Agarwal, aynı zamanda Ulusal Yaşlanma Enstitüleri'ndeki moleküler genetoloji laboratuvarındaki DNA Heli vakaları bölümünden. İnsan DNA onarım proteinlerinin ve genetik yolaklarının rollerini anlamak, birçok araştırmacı için uygun maliyetli bir zorluktur.

Memeli sistemlerindeki genetik çalışmalar, mutant genetik hücre hatları, düzenleyici ekspresyon sistemleri ve uygun seçilebilir belirteçler dahil olmak üzere hazır araçların bulunmaması nedeniyle sınırlı kalmıştır. Bugün size, erken yaşlanmanın önlenmesinde helikaz olarak bilinen bir DNA çözme enziminin moleküler ve hücresel işlevlerini araştırmak için bir model sistem olarak mayayı içeren prosedürleri göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürleri, erken yaşlanma bozukluğunda DNA onarımı ve genomik stabilitenin korunmasında kusurlu olan insan yakıcı gen ürününün rolünü genetik olarak karakterize etmek için kullanıyoruz.

Werner Sendromu Werner, doğudaki beş insan req ailesi helikopter vakasından biridir. İnsan Werner'in replikasyon stresi tepkisindeki rolünü incelemek için sgs adında tek bir tane var. Doğu mutant arka plandaki Werner ekspresyonunun çeşitli biyolojik uç noktalar üzerindeki etkisini inceledik.

Öyleyse başlayalım, başlayalım. Mayayı heterolog bir konak olarak kullanacağımız için, ilk adımımız insan Werner genini veya varyansını bir maya vektörüne klonlamak olacaktır. Werner plazmitleri, Sal bir ve MLU bir kısıtlama ile sindirildi ve daha sonra saflaştırılmış fragmanlar, bir galon indüklenebilir promotörün regülasyonu altındaki maya ekspresyon vektörünün Sal bir MLU bir bölgesine bağlandı.

Çok kopyalı plazmid ayrıca bir TRP seçilebilir işaretleyici içerir. Bu Werner ekspresyonu plazmidleri daha sonra bu çalışmada kullanılan uygun triptofan tropik maya suşlarına dönüştürülür. Ve dönüştürücüler, süspansiyonun sentetik tam glikoz ortamı üzerine kaplanmasıyla seçilir.

Triptofan eksikliği, koloniler ortaya çıkana kadar plakaları üç ila dört gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe eder. Koloniler çizgi haline geldikten sonra, sentetik tam glikoz ortamı üzerinde bireysel dönüştürücüler ve plakaları iki ila üç gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. İnsan weer genini ve varyantlarını eksprese eden mutant ye suşları daha sonra aşağıdaki bölümlerde gösterilen tekniklerle hücresel fenotipler için araştırılmıştır.

İlk üç mutant ciddi bir büyüme kusuru gösterir. Bununla birlikte, SGS bir genindeki mutasyon, Werner ekspresyonunun vahşi tip S Gs bir veya S Gs bir suşun büyümesi üzerindeki etkisini incelemek için ilk üç mutantın yavaş büyüme fenotipini baskılar, ilk üç suş, vektör veya Werner ekspresyon plazmidi ile karşılık gelen suşları, triptofan içermeyen ancak pozitif bir kontrol olarak %2 glikoz veya %2 gala laktoz içeren sentetik tam ortam plakaları üzerine çizer. SGS bir ekspresyonunun etkisi, plakaları iki gün boyunca 30 derecede inkübe ederek belirlenmiştir.

Yabani tip ve SGS, vektör veya Werner ile dönüştürülmüş bir mutant suş, büyüme modellerinde herhangi bir fark göstermez. Bununla birlikte, Werner, yavaş büyüme fenotipini eski haline getirmek için Warner'ın fonksiyonel gereksinimlerini değerlendirmek için vektörle dönüştürülmüş bir ilk üç çift mutant suşun SGS'den önemli ölçüde daha yavaş büyümesini dönüştürdü. Sgs'de, bir ilk üç arka plan çizgisi sgs, bir ilk üç suş, Warner katalitik alan mutantları ile iki gün sonra% 2 glikoz veya% 2 galaktoz içeren triptofan içermeyen sentetik tam plakalara dönüştürülür.

E 84 A olarak gösterilen inkübasyon Werner Eksonükleaz mutantı, Werner gibi yavaş büyüme fenotipini geri yükler, böylece ilk üç yavaş büyüme fenotipi restorasyonu için eksonükleaz aktivitesinin gerekli olmadığını gösterir. Werner Helikaz mutantı iyi büyür, böylece Werner helikaz aktivitesinin ilk üç yavaş büyüme fenotip restorasyonu için gerekli olduğunu gösterir. Werner'in sgs'nin büyüme hızını etkileme yeteneğini belirlemek.

Daha düşük protein ekspresyon çizgisi seviyelerinde bir ilk üç suş, Werner vektörü ile dönüştürülen bir ilk üç suş veya sgs, biri triptofan içermeyen, ancak artan konsantrasyonlarda galaktoz içeren sentetik tam plakalara dönüştürülür. Tüm plakaları iki gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Warner ve Warner Eksonükleaz mutantı, galaktozun tüm seviyelerinde fenotip ile ilk üç eğimi eski haline getirir.

Ancak, Warner Helicase mutantları yapmaz. Warner ekspresyonunun MMS üzerindeki etkisini belirlemek için SGS bir ilk üç çift mutantın, DNA alkilleyici ajan metil metan SÜLFONAT veya MMS'ye veya replikasyon inhibitörü hidroksiüre veya HU'ya karşı ilk üç tek mutanttan daha az duyarlı olduğu gösterilmiştir. Kontrol olarak 30 santigrat derecede triptofan içermeyen sentetik tam rafinoz ortamında vektör veya Werner ile dönüştürülmüş maya suşlarını büyütün.

Vektör ile dönüştürülmüş vahşi tip bir ebeveyn suşu kullanın, tüm kültürleri tritofan içermeyen sentetik tam rafinoz ortamında yeniden aşılayın ve 30 santigrat derecede erken log fazına kadar büyütün. Kültürler erken log fazındayken, 10 milimolar HU veya% 0.0025 MMS içeren triptofan plakaları içermeyen sentetik tam GAL ortamı üzerine her seyreltmeden dört mikrolitre içeren sentetik tam GAL ortamı kullanarak bu suşların 10.000 katına kadar on kat seri seyreltme hazırlayın, plakaları dört gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Vahşi tip sgs ile dönüştürülen bir SGS ilk üç çift mutant.

Biri, hücre döngüsünün geç SG iki fazında gecikir ve dambıl şeklinde morfoloji ile sonuçlanır. Buna karşılık, yabani tip maya hücre bölünmesini tamamlar ve Werner dönüştürülmüş sgs'nin hücre döngüsü dağılımını incelemek için daha az dambıl şeklinde hücre bırakır. İlk olarak, aşağıdaki suşların logaritmik olarak büyüyen kültürlerini, gece boyunca 30 santigrat derecede triptofan içermeyen sentetik tam RAF ortamında büyütün.

SGS bir ilk üç vektör Werner veya SGS bir ile dönüştürülmüş ve vektör dönüştürülmüş Wildtype ebeveyn suşu kültürleri OD 0.05'te yeniden aşılar. Yeniden aşılandıktan sonra, kültürleri OD 0.5'e büyütün ve santrifüjleme ile hasat edin, Werner ekspresyonu daha sonra% 2 konsantrasyonda gala laktoz eklenerek indüklenir. Kültürlerin altı saat boyunca 30 santigrat derecede büyümesine izin verin.

Altı saat sonra kültürleri hasat edin, hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Santrifüjlemeden sonra kültürleri mikro santrifüj tüplerine aktarın, hücreleri bir kez PBS ile yıkayın. Daha sonra, sabit hücreleri bir XPBS'de PBS yeniden süspansiyon hücreleri ile iki kez yıkadıktan sonra hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 70 etanol içinde sabitleyin.

Hücre süspansiyonunu bir slayta yerleştirin ve vektör kalkanı ekleyin. DAPI ile mililitre konsantrasyonda bir mikrogram montaj ortamı. Hücre döngüsünün SG iki fazındaki maya hücrelerinin karakteristiği olan dambıl şeklindeki çekirdeğe sahip hücreleri aramak için slaytları bir XI Saxo vert mikroskobu altında inceleyin.

Werner proteininin ekspresyonunu veya dönüştürülmüş SGS bir veya SGS bir ilk üç maya suşundaki varyansını belirlemek için. Werner proteininin ekspresyonunu indüklemek için suşları galaktoz içeren ortamda altı saat boyunca büyüterek başlayın. Hücreleri santrifüjleme ile topladıktan sonra, PBS ile yıkayın ve tekrar süspanse edin.

Bir alkali lizis tamponu. Hücreleri beş dakika kaynatın, ardından santrifüjleme ile berraklaştırın ve bir molar hidroklorik asit ile nötralize edin. Bu lizatlar artık, değişen galaktoz konsantrasyonlarının etkisi altında Warner proteininin ekspresyon seviyesini belirlemek için% sekiz ila% 16 poli akrilamid SDS jellerinde elektroforez için hazırdır.

İlk olarak, altı saat boyunca değişen galaktoz konsantrasyonlarına sahip kültürleri indükleyin. Daha sonra hücreleri santrifüjleme ile hasat edin ve bunları proteaz inhibitörleri içeren kirpi balığı içinde yeniden süspanse edin. Karışıma 425 ila 600 mikron arasında cam boncuklar ekleyin ve bir dakika boyunca yüksek hızda girdap yaparak hücreleri kırın, ardından bir dakika boyunca buzlandırın.

Toplam sekiz kez tekrarlayın. Daha sonra, elde edilen homojenatı 15.000 Gs'de beş dakika santrifüjleyin ve süpernatan fraksiyonu toplayın. Bradford Yöntemi ile lizat fraksiyonlarındaki protein miktarını ölçtükten sonra, Werner'in %8 ila %16'lık poli akrilamid SDS jel ekspresyonu üzerinde eşit protein konsantrasyonlarını çözün ve ardından sgs'de Western blot Werner ekspresyonu ile belirlenir.

İlk üçten biri, bu fotoğraflarda gösterildiği gibi ilk üçün yavaş büyüme fenotipini geri yükler. Sgs ilk üç suş vektör Werner ile dönüştürüldüğünde veya sgs% 2 glikoz veya% 2 galaktoz içeren bir SC triptofan plakası üzerinde bir çizgi sgs. Werner'in galaktozun neden olduğu ekspresyonu, SGS'nin ilk üç suşunun daha yavaş büyümesine neden olur.

Buna karşılık, Werner ile dönüştürülen vahşi tip ebeveyn suşu veya SGS bir suşu, büyümesinden etkilenmez, bu da Werner tarafından verilen yavaş büyümenin sgs'ye özgü olduğunu gösterir. Bir ilk üç arka plan. SGS olduğunda, Werner varyantları ile dönüştürülen ilk üç suş, yalnızca %2 glikoz veya %2 galaktoz içeren SC triptofan plakaları üzerinde çizildi.

Eksonükleaz ölüsü Werner, yavaş büyüme fenotipini hala eski haline getirebildi. Bu, ilk üçünün yavaş büyüme fenotipini eski haline getirmek için Werner ATPase helikazının gerekli olduğunu, ancak eksonükleaz aktivitesinin gerekli olmadığını göstermektedir. SGS'nin ilk üçte biri arka planında, Werner, GAL konsantrasyon aralığı boyunca SGS'nin yavaş büyüme fenotipini ilk üçte bir haline getirdi.

Bu sonuçlar, sgs bir üst üç mutant arka plandaki yavaş büyüme fenotipinin restorasyonunun düşük Werner protein ekspresyon seviyelerinde meydana geldiğini göstermektedir. Logaritmik olarak büyüyen sgs kültürleri sırasında, Werner veya varyantları ile dönüştürülen ilk üç suştan biri, glikoz veya galaktoz ve MMS veya HU içeren SC tripofan plakaları üzerine on kat seri seyreltmede tespit edildi. Werner ekspresyonunun MMS'yi arttırdığını ve SGS'nin iki duyarlılığını bir ilk üç suşunda gözlemledik. Ayrıca, SGS'nin ilk üç arka planındaki MMS ve HU duyarlılığı üzerindeki bu etki, Werner ATP'nin helikazını gerektirir, ancak ekzon kleaz aktivitesini gerektirmez.

Son olarak, Werner ekspresyonu, büyük popolu hücrelerin yüksek popülasyonu ile gösterildiği gibi, ilk üçün karakteristik SG iki gecikmesini de geri yükler. Sgs'de Werner'i ifade eden ilk üç mutant hücreden biri. Sgs ile karşılaştırıldığında, vektör hücrelerle dönüştürülen ilk üç hücreden biri Dabi ile boyandı.

Çekirdekleri görselleştirmek için oklar ve oklar bölünmemiş çekirdekleri gösterir Werner ifadesi. Transforme edilmiş sgs'de, belirtilen galaktoz konsantrasyonları eklenerek bir üst üç hücre indüklendi ve hücreler indüksiyondan altı saat sonra toplandı. % sekiz ila% 16 poli akrilamid SDS jellerine eşit miktarlarda toplam hücre lizatı yüklendi, ardından anti Warner antikoru kullanılarak batı kanı tespiti yapıldı.

Katalitik aktiviteleri ve protein etkileşimlerinin aracılık ettiği insan öğrenici geninin hücresel ve moleküler işlevlerini açıklığa kavuşturmak için tanımlanmış maya mutant arka planlarıyla ilişkili hücresel fenotipleri nasıl araştıracağınızı gösterdik. Maya, genin tanımlanmış yollardaki işlevlerini incelemek için bir model organizma olarak kullanılabilir. Bu prosedürleri yaparken, tanımlanmış yollarda araştırılan genin rolünü ayırt etmek için uygun bir maya mutant arka planı seçmek önemlidir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.