Hücre Haberleşme Analizi İçin Tek hücreli Mikroenjeksiyon

Merhaba, benim adım Anael. Oswaldo Cruz Vakfı'nda Hücresel İletişim Laboratuvarı'nda çalışıyorum. Biz burada bağışıklık sistemi ve karaciğer bağlamında P2 Reseptörleri ve boşluk enjeksiyonunu inceliyoruz.

Bugün sizlere hücre mikroenjeksiyonunu sunacağım. Boşluk enjeksiyonları, sinaps iletimi, kalp kasılmaları ve diğerleri gibi bazı fizyolojik roller oynar. Bu teknik için boşluk enjeksiyonlarının fonksiyonel olup olmadığını inceleyebiliriz.

Tamam, mikroenjeksiyon kurulumunun temel bileşenlerini görelim. Burada hücreleri göreceğimiz ters çevrilmiş floresan mikroskobu var. Bu, sonuçları kaydetmek için bir CCD kameradır.

Burada boyayı hücreye sokacağımız akım jeneratörü var. Daha sonra mikroelektrotun bağlı olduğu tutucuya sahibiz. Ve tutucuya bağlı olan ve mikroelektrotun Z, Y ve X olmak üzere üç eksende hareketine izin veren mikro manipülatör. Deneye başlamadan önce mikroelektrotu yapmalıyız.

Bu borosilikat cam kılcal damarı ve polar adı verilen bu ekipmanı kullanıyoruz. Borosilikat kılcal damarı buraya takıyoruz. Bu tungsten filamanı iki mikroelektrot yapmak için ısıtacağız.

Şimdi tungsten filamanın ısınması ve buradaki dalga, iki mikroelektrot yapmak için aşağı çekeceğiz. Kolay. İlk adımımız mikroelektrodu boya ile doldurmaktır. Buradaki bir ipucu, deneyi yapmak için sadece ucu birkaç mikrolitre ile doldurmanız gerektiğidir.

Her şeyi doldurmak gerekli değildir. Daha fazla ayrıntı içeren not. Sadece ucu doldurun.

Bir deney başlatalım. Burada petri kabındaki hücreler var, bir sodyum çözeltisi içinde. Akım jeneratörüne bağlı gümüş tel.

Şimdi mikroelektrotları kafa aşamasına takmamız gerekiyor. Burada baş aşamasında, akım jeneratörüne de bağlı başka bir gümüş telimiz var. Mikroelektrot takıldıktan sonra, banyonun içine koyabiliriz.

Pipetin ucunun banyoya dikkatlice temas ettiğine dikkat edin. Bu prosedür, petri kabının dibindeki ucun çarpmasını önlemek için çok dikkatli bir şekilde yapılır. Banyonun içine girdikten sonra, mikropipetin gölgesini aramak için mikroskoba gidebiliriz.

Büyütme merceğine bakmaya başlamamızı öneririz. Pipetin gölgesini bulduğumuzda, mikromanipülatörü kullanarak mikroelektrodu hücreye doğru hareket ettirebiliriz. Hücreye çok yakın olduğunda, mikroelektrotun engellenip engellenmediğini doğrulamak için bir test noktası yapabiliriz.

Bundan sonra nasıl göreceğiz. Burada mikropipeti görüyoruz ve hücreye çok yakın bir yerde mikropipeti ayarlıyoruz. Sağda ve solda hücre hareketini görebiliriz.

Sonra filtreye, floresan filtresine geçiyoruz. Pipetin ucunun tıkalı olup olmadığını test etmek için hiperpolarize edici darbe uygulayabiliriz. Mikropipet hücrenin içinde olduğundan, hücreye boya yüklemek için hiperpolarize edici darbe uygulayabiliriz.

Burada gevşek serbest sarı boyayı kullanıyoruz. Hücreyi boya ile yükledikten sonra, komşu hücreler boşluk enjeksiyonları ile bağlanırsa, birkaç dakika bekleriz ve bu boşluk enjeksiyonları ile boyanın difüzyonu ile komşu hücrelerin parladığını görürüz. Deneyimizde, floresan gösteren yıldızlarla işaretlenmiş beş hücre görebiliriz.

Burada, timik epitel hücrelerinde mikroenjeksiyon deneyinin iyi bir örneği var, A ve B.In şekiller C ve D'de, gevşek serbest sarı timik inert hücrede bir mikroenjeksiyon ve ekte gösterilen boşluk enjeksiyonuna geçirgen olmayan başka bir boya gösterilmektedir. Şekil E ve F timik epitel hücre hattı, gevşek serbest sarı ile mikroenjekte edildi ve ekte gevşek serbest sarı ve bir boşluk enjeksiyon bloğu ile mikroenjekte edildi. Sonuçlar, gevşek serbest sarının komşu hücrelere yayılmadığını göstermektedir.

Daha sonra, deksametazon varlığında timik epitel hücrelerinde bir mikroenjeksiyon görüyoruz ve B.Deksametazondaki kantitasyon, şekil B'de gösterildiği gibi eşleşme derecesini arttırdı. 100 enjeksiyondan, bağlı üç veya dört hücre sayısı bu ilacın varlığında daha sık görüldü. Umarım yeni başlayanlara hücresel iletişim çalışması için bu önemli tekniği yapmalarında yardımcı olabilirim. Teşekkürler ve güle güle.