Hücre Haberleşme Analizi İçin Tek hücreli Mikroenjeksiyon
February 26th, 2017
Biz canlı hücrelerin boşluk bağlantıları aracılığıyla hücresel iletişim görselleştirmek için Lucifer Sarı bir tek hücreli mikroenjeksiyon gerçekleştirin ve bazı yararlı ipuçları sağlamak için nasıl burada açıklamak. Biz bu kağıt nedeniyle fonksiyonel gap junction hücresel bağlantı derecesini değerlendirmek için herkese yardımcı olacağını bekliyoruz. Burada tarif edilen her şey 1,000 Dalton altında molekül ağırlığına sahip diğer floresan boyalar için uyarlanmış, ilke olarak, olabilir.
Merhaba, benim adım Anael. Oswaldo Cruz Vakfı'nda Hücresel İletişim Laboratuvarı'nda çalışıyorum. Biz burada bağışıklık sistemi ve karaciğer bağlamında P2 Reseptörleri ve boşluk enjeksiyonunu inceliyoruz.
Bugün sizlere hücre mikroenjeksiyonunu sunacağım. Boşluk enjeksiyonları, sinaps iletimi, kalp kasılmaları ve diğerleri gibi bazı fizyolojik roller oynar. Bu teknik için boşluk enjeksiyonlarının fonksiyonel olup olmadığını inceleyebiliriz.
Tamam, mikroenjeksiyon kurulumunun temel bileşenlerini görelim. Burada hücreleri göreceğimiz ters çevrilmiş floresan mikroskobu var. Bu, sonuçları kaydetmek için bir CCD kameradır.
Burada boyayı hücreye sokacağımız akım jeneratörü var. Daha sonra mikroelektrotun bağlı olduğu tutucuya sahibiz. Ve tutucuya bağlı olan ve mikroelektrotun Z, Y ve X olmak üzere üç eksende hareketine izin veren mikro manipülatör. Deneye başlamadan önce mikroelektrotu yapmalıyız.
Bu borosilikat cam kılcal damarı ve polar adı verilen bu ekipmanı kullanıyoruz. Borosilikat kılcal damarı buraya takıyoruz. Bu tungsten filamanı iki mikroelektrot yapmak için ısıtacağız.
Şimdi tungsten filamanın ısınması ve buradaki dalga, iki mikroelektrot yapmak için aşağı çekeceğiz. Kolay. İlk adımımız mikroelektrodu boya ile doldurmaktır. Buradaki bir ipucu, deneyi yapmak için sadece ucu birkaç mikrolitre ile doldurmanız gerektiğidir.
Her şeyi doldurmak gerekli değildir. Daha fazla ayrıntı içeren not. Sadece ucu doldurun.
Bir deney başlatalım. Burada petri kabındaki hücreler var, bir sodyum çözeltisi içinde. Akım jeneratörüne bağlı gümüş tel.
Şimdi mikroelektrotları kafa aşamasına takmamız gerekiyor. Burada baş aşamasında, akım jeneratörüne de bağlı başka bir gümüş telimiz var. Mikroelektrot takıldıktan sonra, banyonun içine koyabiliriz.
Pipetin ucunun banyoya dikkatlice temas ettiğine dikkat edin. Bu prosedür, petri kabının dibindeki ucun çarpmasını önlemek için çok dikkatli bir şekilde yapılır. Banyonun içine girdikten sonra, mikropipetin gölgesini aramak için mikroskoba gidebiliriz.
Büyütme merceğine bakmaya başlamamızı öneririz. Pipetin gölgesini bulduğumuzda, mikromanipülatörü kullanarak mikroelektrodu hücreye doğru hareket ettirebiliriz. Hücreye çok yakın olduğunda, mikroelektrotun engellenip engellenmediğini doğrulamak için bir test noktası yapabiliriz.
Bundan sonra nasıl göreceğiz. Burada mikropipeti görüyoruz ve hücreye çok yakın bir yerde mikropipeti ayarlıyoruz. Sağda ve solda hücre hareketini görebiliriz.
Sonra filtreye, floresan filtresine geçiyoruz. Pipetin ucunun tıkalı olup olmadığını test etmek için hiperpolarize edici darbe uygulayabiliriz. Mikropipet hücrenin içinde olduğundan, hücreye boya yüklemek için hiperpolarize edici darbe uygulayabiliriz.
Burada gevşek serbest sarı boyayı kullanıyoruz. Hücreyi boya ile yükledikten sonra, komşu hücreler boşluk enjeksiyonları ile bağlanırsa, birkaç dakika bekleriz ve bu boşluk enjeksiyonları ile boyanın difüzyonu ile komşu hücrelerin parladığını görürüz. Deneyimizde, floresan gösteren yıldızlarla işaretlenmiş beş hücre görebiliriz.
Burada, timik epitel hücrelerinde mikroenjeksiyon deneyinin iyi bir örneği var, A ve B.In şekiller C ve D'de, gevşek serbest sarı timik inert hücrede bir mikroenjeksiyon ve ekte gösterilen boşluk enjeksiyonuna geçirgen olmayan başka bir boya gösterilmektedir. Şekil E ve F timik epitel hücre hattı, gevşek serbest sarı ile mikroenjekte edildi ve ekte gevşek serbest sarı ve bir boşluk enjeksiyon bloğu ile mikroenjekte edildi. Sonuçlar, gevşek serbest sarının komşu hücrelere yayılmadığını göstermektedir.
Daha sonra, deksametazon varlığında timik epitel hücrelerinde bir mikroenjeksiyon görüyoruz ve B.Deksametazondaki kantitasyon, şekil B'de gösterildiği gibi eşleşme derecesini arttırdı. 100 enjeksiyondan, bağlı üç veya dört hücre sayısı bu ilacın varlığında daha sık görüldü. Umarım yeni başlayanlara hücresel iletişim çalışması için bu önemli tekniği yapmalarında yardımcı olabilirim. Teşekkürler ve güle güle.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, canlı hücrelerdeki boşluk bağlantıları aracılığıyla hücresel iletişimin görselleştirilmesi için Lucifer Yellow tek hücreli mikroenjeksiyonu tekniğini açıklar. Fonksiyonel boşluk bağlantılarına bağlı hücresel bağlanmayı değerlendirmek için araştırmacılara pratik ipuçları sunar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücresel İletişim
- Nörobilim
- Immunoloji
Arka Plan
- Boşluk bağlantıları fizyolojik süreçlerde kritik roller oynar.
- Sinaptik iletim ve kalp kasılmalarında yer alırlar.
- Çeşitli biyolojik çalışmalar için işlevlerini anlamak esastır.
- Lucifer Yellow, görselleştirme için kullanılan bir floresan boyadır.
Çalışmanın Amacı
- Boşluk bağlantılarını incelemek için mikroenjeksiyonu tekniğini göstermek.
- Canlı hücrelerdeki hücresel bağlanma derecesini değerlendirmek.
- Boşluk bağlantılarının işlevselliği hakkında bilgiler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Lucifer Yellow'ın tek hücreli mikroenjeksiyonu.
- Hücresel iletişimin görselleştirilmesi.
- Fonksiyonel boşluk bağlantılarının değerlendirilmesi.
- Tekniğin diğer floresan boyalar için uyarlanması.
Ana Sonuçlar
- Boşluk bağlantıları aracılığıyla hücresel iletişimin başarılı görselleştirilmesi.
- Hücresel bağlanmanın değerlendirilmesi gösterildi.
- Teknik, 1.000 Dalton altındaki çeşitli floresan boyalar için uygulanabilir.
- Boşluk bağlantılarının fizyolojik rolleri hakkında bilgiler sağlandı.
Sonuçlar
- Mikroenjeksiyonu tekniği, boşluk bağlantılarını incelemek için etkilidir.
- Lucifer Yellow, görselleştirme için yararlı bir araçtır.
- Bulgular, canlı sistemlerde hücresel iletişimin anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Single-cell microinjection enables direct assessment of gap junction functionality, a key mechanism in cellular communication relevant to drug target validation in neuroscience, immunology, and tissue engineering. By visualizing real-time dye diffusion, researchers can evaluate compound effects on intercellular coupling, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides quantitative, functional readouts that improve target confidence and inform go/no-go decisions in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether a target modulates gap junction-mediated communication.
- Operational Value: Enables functional validation of connexin or hemichannel targets in live cells.
- Predictive Value: Supports pathway clarification and biological de-risking through direct observation of dye transfer.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated cellular systems for compound screening by establishing baseline coupling.
- Quantitative Output: Measures diffusion kinetics as a functional readout for assay standardization.
- Scalability: Adaptable to high-content imaging platforms for multi-condition comparison.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models physiological processes like synaptic transmission and heart contraction where gap junctions are implicated.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to preclinical models by confirming functional coupling in relevant cell types.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement based on evidence of target engagement in cellular networks.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to assess target effects on cellular communication before progressing to phenotypic screening or lead optimization.
- Discovery Biology: Tests hypothesis that a compound or genetic modulator alters intercellular signaling via gap junctions.
- Screening: Generates reproducible, quantitative fluorescence data to compare treatment conditions.
- Analytics: Provides measurable diffusion metrics that enable statistical comparison of coupling efficiency.
- Translational Research: Uses epithelial and immune-relevant cell lines to model tissue-level communication.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating connexin-targeting compounds across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by confirming functional target modulation in a native cellular context.
- Operational Value: Standardizes microinjection and imaging protocols for reproducible results across labs.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by identifying ineffective modulators of cellular coupling early.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of compounds demonstrating gap junction modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, fluorescence microscopy, and dye handling.
- Depends on micromanipulator stability, electrode preparation, and intracellular injection precision.
- Necessitates standardized cell preparation and bath conditions to ensure consistent results.
- Must account for cell type variability in connexin expression and baseline coupling.
- Limited to dyes under ~1,000 Da that can pass through gap junctions, as larger molecules remain cell-autonomous.
