Morfogenetik dinamiklerini analiz ve hücre iskeleti düzenleyiciler ciro sağlayan Embriyolardan teknikleri

Mikromanipülasyon ve FRAP ve fotoaktivasyon gibi ışık mikroskobu tekniklerinin bir kombinasyonunu kullanmanın genel amacı, hücre iskeleti regülasyonu ve göçünde yer alan proteinlerin pakiyotemporal dinamiklerini farklı koşullarda veya sinyal yoluna bağlı bir şekilde izlemektir. Burada tartışılan mikromanipülasyon yöntemleri, herhangi bir molekül tipinin hücrelere doğrudan verilmesi ve ayrıca tanımlanmış hücre altı konumlarda protein aktivitesinin ışık kaynaklı manipülasyonu için yararlıdır. Dolayısıyla burada sunulan tekniklerin temel avantajı, proteinlerin hücreler üzerinde uyguladığı anlık etkilerin belirlenmesine ve hücre boyunca hareketliliklerinin izlenmesine izin vermesidir.

Bu işleme başlamak için, daha önce yetiştirilmiş B16-F1 hücrelerini bir ila beş oranında üç santimetrelik plastik bir tabağa geçirin. Hücre kültürü ortamını aspire edin. Hücreleri PBS ile yıkayın, PBS'yi aspire edin ve hücreleri ayırmak için Tripsin EDTA ekleyin.

Tripsinizlenmiş hücrelere hücre kültürü ortamı ekleyin. Bu santrifüjden sonra 1000 rpm'de üç ila beş dakika boyunca hücreleri yeniden askıya alın ve şahin tüplerine aktarın. B16-F1 hücrelerini üç santimetrelik bir tabağa oturttuktan ve en az altı saat yayılmalarına izin verdikten sonra, 150 milimolar sodyum klorür içeren bir çözelti içinde 500 nanogram DNA yapısı ve bir mikrolitre transfeksiyon reaktifi karışımı ekleyerek B16-F1 hücrelerini transfekte edin.

B16-F1 hücreleri için, 15 milimetrelik kapak fişlerini 150 mikrolitre laminin çözeltisi ile kaplayın ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. NIH için, 3T3 hücreleri kapak kızaklarını fibronektin çözeltisi ile kaplar ve oda sıcaklığında bir saat inkübe eder. İnkübasyondan sonra, laminin ve fibronektin inkübe edilmiş örtü fişlerini PBS ile yıkayın ve ardından PBS'yi aspire edin.

İki mililitre NIH 3T3 fibroblastını birleşik bir tabaktan fibronektin kaplı örtü fişlerine bir ila 20 oranında tohumlayın. Transfekte edilmiş B16-F1 hücrelerinin iki mililitresini birleşik bir tabaktan bir ila 30 oranında laminin kaplı lamellere pipetleyin. Bunu takiben, hücrelerin mikroskopiden önce 37 santigrat derecede bir doku kültürü inkübatöründe gece boyunca laminin ve fibronektin kaplı örtü kaymaları üzerinde yayılmasına izin verin.

Kapak camını, hücreler yukarı bakacak şekilde ısı iletken bir RC-26 alüminyum görüntüleme odasına yerleştirin. Ardından, kapak kızağı ile hazne arasında güvenli bir sızdırmazlık sağlamak için kapak camının üzerine plastik bir sızdırmazlık maddesi yerleştirin, ortamın sızmasını önlemek için plastik sızdırmazlık maddesini haznenin sürgülü kelepçeleriyle vidalayarak sabitleyin. Şimdi, 37 santigrat derece önceden ısıtılmış mikroskopi ortamını merkezi alana pipetleyin.

Isı dedektörünü odanın belirlenen yuvasına yerleştirin ve odanın elektrotlarını 37 santigrat derece sabit bir sıcaklık sağlayarak bir TC-324B otomatik sıcaklık kontrol cihazına bağlayın. Mikroenjeksiyon kılcal damarında mevcutsa iğne tıkanmasına yol açabilecek protein agregatlarını çıkarmak için önceden çözülmüş bir protein çözeltisini 10.000G'de en az 30 dakika santrifüjleyin. Esnek bir pipet ucu kullanarak, arka taraftan bir mikrolitre protein çözeltisi içeren bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin.

İğne ucunda hava kabarcıkları varsa, bunları çıkarmak için iğne tabanına hafifçe vurun. Ardından, mikromanipülasyon cihazındaki iğne tutucuyu dikkatlice ayarlayın. Mikroenjeksiyon iğnesini iğne tutucuya vidaladıktan sonra, iğne ucunu hücre kültürü ortamına aktarmadan önce bir mikroenjeksiyon basınç cihazı kullanarak iğneye basınç uygulayın.

Ardından, düşük büyütme hedefi kullanarak iğneyi görüş alanına yerleştirin, ardından ilgilendiğiniz bir hücreyi bulun ve iğneyi kademeli olarak hücrenin üzerine indirin. Mikroenjeksiyon için, hücrenin plazma zarına hafifçe dokunun, bu hücreye nüfuz etmek için yeterli olabilir veya mikroskop kurulumuna çok hafif bir dokunuşla geçici zar yırtılmasına yardımcı olabilir. İğne ucunu ortama doğru hareket ettirerek hücreye akış görünür görünmez enjeksiyon işlemini durdurun.

Lazeri tetiklemeden önce GFP kanalına geçin ve zaman atlamalı görüntü alımını başlatın. Bunu takiben, ekranı görüntülerken GFP kanalında foto ağartılacak bölgeyi manuel olarak çizin. Görüntü alımının başlamasından en az üç ila dört kare sonra 405 nanometre lazerin manuel tetiklemesiyle foto ağartmayı başlatın.

Yazılımdaki GFP 488 nanometre görüntü alımını 500 milisaniye pozlama ve 1500 milisaniye zaman aralığına ayarlayın. Ardından, dalga boyu serisi karesini işaretleyerek ve dalga boyu alma menüsünde istenen kanal sayısını seçerek çift kanallı veya üç kanallı zaman atlamalı filmler almak için yazılım ayarlarını yapın. Lazeri tetiklemeden önce, zaman atlamalı görüntü alımını başlatın ve ekrana bakarken faz kontrast kanalında fotoaktif hale getirilecek bölgeyi manuel olarak çizin.

Bunu takiben, görüntü alımının başlamasından en az üç ila dört kare sonra 405 nanometre lazerin manuel tetiği ile fotoaktivasyonu başlatın. FRAP sonuçlarının analizi için, VisiView'dan türetilen zaman atlamalı filmleri MetaMorph yazılımında açın. MetaMorph kullanarak ilgili bölgeleri manuel olarak çizerek floresan geri kazanımının her bir zaman noktası için foto-ağartılmış bölgelerin yoğunluk değerlerini türetin.

Lamellipodyumun ucuna, foto ağartılmış alanın tamamını veya bir kısmını kaplayan bir şekil çizin ve ilerleyen ucun yer değiştirmesi sırasında zaman içinde ilgili bölgenin lamellipodial yoğunluklarındaki değişiklikleri izlemek için gerekirse sonraki karelerdeki konumunu manuel olarak ayarlayın. Arka planın düzeltilmesi ve foto ağartma edinimi için sırasıyla hücrelerin dışındaki ve içindeki bölgeleri analiz edin. İlgilenilen bir bölge seçildikten sonra, menü ölçüm bölgesi ölçümlerini kullanarak MetaMorph'ta yoğunluk değerlerini çıkarın.

Yapılandır menüsünde geçen süre ve ortalama yoğunluk seçeneklerinin seçili olduğundan emin olun. Günlüğü aç'a tıklayın ve dinamik veri alışverişini seçin. Ardından bir excel elektronik tablosunu açmak için Tamam'ı tıklayın ve MetaMorph değerlerini excel'e yapıştırmak için günlüğü aç düğmesini tekrar tıklayın.

Yoğunluk değerlerini uygun formüller içeren bir excel elektronik tablosuna yapıştırarak FRAP floresan geri kazanım eğrilerini hesaplamak için MetaMorph'tan türetilen yoğunluk değerlerini kullanın. Foto-ağartılmış bölgenin floresan geri kazanımı, arka plan ve iç bölgelere normalize edilir. Floresan geri kazanımının yarı süresini hesaplamak için, floresan geri kazanım eğrilerinin değerlerini karşılık gelen sürelerle SigmaPlot'a yapıştırın, ardından en iyi eğri uyumuna bağlı olarak mono veya iki üstel fonksiyonu seçerek dinamik uyum sihirbazı üstel yükseliş aracını kullanarak bir eğri uyumu gerçekleştirin.

Seçilen fonksiyonun çözülmesiyle elde edilen parametreler, ilgili kurtarma yarı zamanının saniye cinsinden hesaplanmasına izin veren uygun formülü içeren bir excel elektronik tablosuna yapıştırılabilir. Fotoaktive edilebilir aktinin aktivasyon üzerine difüzyonunun yanı sıra lamellipodium gibi belirli bir bölge içindeki birikimini ölçmek için, normalizasyon için arka plan floresansını belirlemek amacıyla ilgili bölgelerde ve hücre dışında zaman içindeki yoğunlukları belirlemek için MetaMorph kullanın. Fotoaktifleştirilebilir aktinin aktivasyon bölgesinden uzağa doğru yer değiştirme oranını veya lamellipodyum içindeki dahil edilme oranını incelemek için, daha önce MetaMorph'tan türetilen verilerden floresan eğrileri oluşturun.

Normalizasyon için kullanılan arka plan bölgesi, fotoaktif sitozolik bölge veya araştırılacak lamellipodial bölge için yoğunluk değerlerini uygun formülleri içeren bir excel elektronik tablosuna yapıştırın. Küçük GTPase Rac1'in mikroenjeksiyonundan önce ve sonra bir NIH 3T3 fibroblast hücresinin yüz kontrast görüntüleri burada gösterilmektedir. Mikroenjeksiyondan yaklaşık 12 dakika sonra, hücre morfolojisini değiştirdi, bu da enjeksiyonun başarılı olduğunu gösteriyor.

Ağartılmış EGFP VASP'ın lamellipodium ucunda ağartılmamış moleküller tarafından geri dönüşümü burada gösterilmektedir. Bu özel örnekte, ağartma öncesi floresansın yaklaşık %80'inde geri kazanım floresan platoları. Fotoaktivasyon üzerine, fotoaktif GFP aktini sitozolik bölgeden hızla yayılır.

Fotoaktif aktin monomerlerinin bir kısmı, lamellipodia içinde hızlı bir floresan patlaması yaratarak öne doğru yer değiştirir. Fotoaktif aktin monomerlerinin fraksiyonu, sitozol boyunca yolculukları sırasında aktive edilmemiş monomerlerle seyreltildiğinden, fotoaktif bölgeye uzak lamellipodia'da floresanın dahil edilmesi nefis bir şekilde daha düşüktür. Fotoaktif GFP aktin zamanla fotoaktif bölgeden yayıldığında, sürekli olarak fotoaktif olmayan floresan olmayan aktin ile değiştirilir.

Sonuç olarak, bu bölgenin floresan yoğunluğunda kademeli bir azalma gözlenir. Zamanla, sitozolik aktivasyon bölgesine yakın lamellipodia hızla floresan aktin içerir. Floresandaki bir sonraki düşüş, basitçe aktin depolimerizasyonu ve lamellipodyumdan uzakta monomer difüzyonundan kaynaklanmaktadır.

Bu nedenle, deneyler tek bir mikroskopi sistemi üzerinde gerçekleştirildiğinde, mikroenjeksiyon ve FRAP veya fotoaktivasyon tekniklerinin kombinasyonu, araştırılan proteinlerin doğasına bağlı olarak birkaç dakika içinde gerçekçi bir şekilde gerçekleştirilebilir. Mikromanipülasyon öncesinde, sırasında ve sonrasında veya lazer ışığına maruz kaldıktan sonra kendinizi her zaman mutlu etmeyi unutmayın. FRAP ve fotoaktivasyon için, seçilen bölgenin film süresi boyunca yapısal bütünlüğünü koruması özellikle önemlidir.

Mikroenjeksiyon prosedürü, verilen tedavilerin subselüler düzeyde ani sonuçlarını ele almak için plazma zarı geçirgen ilaçların veya hücre iskeleti inhibitörlerinin lokal uygulaması ile tamamlanabilir. Mikromanipülasyon teknikleri, hücre iskeleti bileşenlerinin ve komplekslerinin difüzyon özelliklerini ve hücre altı dinamiklerini keşfetmenin ve hücresel morfogenezi düzenleyen ikinci el yolakları anlamanın yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, sitozolik proteinlerin, hücre iskeleti içindeki eyleme dahil edilen veya farklı hücre altı organellerde bulunan proteinlerin uzay-zamansal dinamiklerini nasıl izleyeceğinizi ve izleyeceğinizi iyi anlamanız ve sonuçta hücre düzenlemesinin kinetiğini çözmeniz gerekir.