Sistematik Analizi In Vitro Hücre Rolling

Aşağıdaki deneyin genel amacı, sıkı bir şekilde kontrol edilen, fizyolojik olarak ilgili bir kesme akışı altında artan verim ile hücre haddeleme çalışmaları gerçekleştirmektir. Bu, özel bir plakadaki bitişik kuyucukların bir mikroakışkan kanal aracılığıyla bağlandığı çok kuyulu bir mikroakışkan sistem kullanılarak elde edilir. Sistemin arayüzü, bir elektro pnömatik pompayı çok kuyulu plakanın tepesine bağlar ve sıvıyı kuyuların içinden mikroakışkan kanallardan tanımlanmış bir akış hızında geçiren bir pnömatik basınç uygular.

Mikroakışkan kanal, istenen substrat veya hücre mono tek tabakası ile kaplandıktan sonra, ilgilenilen hücreler, kaplanmış yüzey ile spesifik yuvarlanma etkileşimlerini keşfetmek için mikroakışkan kanala sokulur, hücrelerin yuvarlanma özellikleri, farklı deneysel koşullar altında substrat veya tek tabaka kaplı yüzey ile etkileşime girdiklerinde daha sonra uygun yazılımla analiz edilebilir. Bu tekniğin paralel plaka akış odası gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bu tekniğin, reaktif ve hücre tüketimini en aza indirirken, hassas bir şekilde kontrol edilen, fizyolojik olarak ilgili tüp akışı altında önemli ölçüde daha yüksek bir verimle gümüş haddeleme özelliklerinin incelenmesini sağlamasıdır. Bu platform, hücre yuvarlama ve hedef arama etkilerini etkilemek için tasarlanmış mühendislik yaklaşımlarının hızlı ve doğru analizine izin vererek eksojen hücre bazlı tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olabilir.

Mikroakışkan bir kanalı bir protein substratı ile kaplamak için, önce girişe 25 ila 50 mikrolitre taze hazırlanmış protein çözeltisi ekleyin. Daha sonra, çözeltiyi kanala perfüze etmek için beş dakika boyunca santimetre kare başına iki dinlik bir kuvvet uygulayın. Çıkışta bir damla sıvı göründüğünde, akışı iyi durdurun, plakayı ilgilenilen protein ile uygun süre boyunca inkübe edin ve ardından çözeltiyi her birinden aspire edin. Kuyu.

Daha sonra, çıkış kuyucuğuna 200 ila 500 mikrolitre PBS ekleyin ve ardından mikroakışkan kanalın içinde bir hücre tek tabakası oluşturmak için kanalı yıkamak için beş dakika boyunca santimetre kare başına iki dinlik bir akış uygulayın. İlgilenilen hücreleri kültür kabından üç dakika boyunca nazikçe tripsin ile başlayın, reaksiyonu iki kat hacimde tam ortamla durdurun ve ardından hücreleri 400 Gs ve rt'de beş dakika santrifüjleyin. Ardından, peleti 10 mililitre tam ortamda yıkayın.

Daha sonra hücreleri bir mililitre taze dolu ortamda yeniden süspanse edin ve sayın, hücre çözeltisini uygun konsantrasyona ayarlayın ve ardından her girişe 25 ila 50 mikrolitre hücre süspansiyonu yerleştirin. Şimdi, plakayı mikroskop sahnesine yerleştirin ve hücrelerin tüm kanalı doldurduğu gözlemlenene kadar hücreleri kanala akıtmak için santimetre kare başına iki dinlik saf akış uygulayın. Akışı durdurduktan sonra, hem çıkış hem de iç kuyuları 200 mikrolitre uygun hücre ortamı ile doldurun ve ardından hücrelerin% 5 CO2'de 37 santigrat derecede yerleşmesine ve yapışmasına izin verin.

Üç saat sonra, bağlanmamış hücreleri çıkarmak için kanalı tam ortamla yıkayın. Hücreler artık tamamen birleşmiş olmalı ve kanallardaki endotel hücrelerinin enflamatuar aktivasyonunu indüklemek için kullanıma hazır olmalıdır. Giriş kuyucuğuna 100 mikrolitre taze hazırlanmış TNF alfa çözeltisi ekleyin ve ardından beş dakika boyunca santimetre kare başına iki dinlik bir akış uygulayarak çözeltiyi kanala verin.

Aktive edilmemiş endotel hücre kanallarının kontrolü için, girişe 100 mikrolitre endotel hücreli bazal ortam ekleyin. Endotel hücre yüzeyindeki P veya E seçicisini bloke etmek için, uygun nötralize edici antikorun mililitresinde beş mikrogram kanala sokun. Ardından, haddeleme testine başlamadan önce kanalları bazal ortamla yıkayın.

Kanalların uygun şekilde kaplandığını doğrulamak için kanalları mikroskop altında dikkatlice inceleyin. Daha sonra HL 60 hücre süspansiyonunu ikinci yıkama sayımından sonra iki kez bazal medya ile yıkayın ve daha sonra IMDM'deki hücreleri mililitre konsantrasyonu başına 10 ila altıncı hücre arasında beş kez yeniden süspanse edin. Çıkışa 25 ila 50 mikrolitre hücre süspansiyonu ekledikten sonra, plakayı 37 santigrat derece sıcaklık kontrollü plaka tutucuya iyice yerleştirin ve plaka tutucuyu mikroskop aşamasına yerleştirin.

Hücreleri mikroakışkan kanala sokun. Çıkıştan girişe akan 10 ila 15 saniye içinde gözlemlenmelidir. Burada, floresan olarak etiketlenmiş HL 60 hücreleri, P select kodlu yüzey ile etkileşime girerek, kayma tepkisini kesme geriliminin bir fonksiyonu olarak incelemek için bir yuvarlanma tepkisi göstererek, kesmeyi santimetre kare başına 0,25 dines'e düşürerek ve istenen her kesmede akış edinme işlevini kullanarak 20 ila 32. video elde ederek gözlemlenebilir, ve kesmeyi kademeli olarak santimetre kare başına 0,25'ten beş dineye çıkararak.

Son olarak, saniyede 11 karelik akış alımıyla tahlilin videosunu elde etmek için bir CCD kamera kullanın. Örneğin, burada, tek katmanlı bir chope hücresi üzerinde yuvarlanan bir HL 60 hücresi gösterilmektedir. Uygun uyumlu yazılımla yuvarlanma yollarını ve hızlarını analiz edin.

HL 60 hücreleri, çok kuyulu plaka mikroakışkan sisteminin yeteneklerini test etmek X.To, yuvarlanma ligandları, P select ve glikoprotein ligandı bir ve CI Lewis dahil olmak üzere çeşitli hedef arama ligandlarını eksprese ettikleri için altın standart silindirler olarak kabul edilir, çok sayıda mikroakışkan kanal aynı anda kaplanmıştır farklı substratlar ve HL 60 hücrelerinin yuvarlanma etkileşimleri. Bu substratlar analiz edildiğinde, hücreler, P select kodlu yüzey üzerinde sağlam bir yuvarlanma davranışı sergiledi ve hücreler ilk olarak akıştan yakalandı, ardından belirgin bir yuvarlanma hareketi izledi. Bu grafikte gösterildiği gibi ve literatürle tutarlı olarak, HL 60 hücreleri, e ve p selektin yüzeylerinde benzer bir yuvarlanma davranışı sergiler, ancak FiberInc kaplı substratlarda değildir.

Uyumlu yazılım aracılığıyla analiz edilen hücre hızı, saniyede bir ila 12 mikron arasında bir ortalama hızla p ve e selektin üzerinde hücrelerin sağlam bir yuvarlanma tepkisini gösteren saf strese karşı çizildi. Bu mikroakışkan sistemin, ilgilenilen hücreler ile yüzeyi kaplayan bir hücre tek tabakası arasındaki etkileşimleri verimli bir şekilde test etmede fizibilitesini değerlendirmek için, burada gösterildiği gibi P'yi stabil bir şekilde eksprese etmek için transfekte edilen, ancak e selektini olmayan CHO P hücreleri kullanıldı. HL 60 hücreleri, HL 60'ın yuvarlanma hareketine gerçekten pektin aracılık edip etmediğini test etmek için bir CHO P hücresi tek tabakası üzerinde önemli bir yuvarlanma tepkisi gösterir.

Tek tabaka, HL 60 hücrelerinin kanala yayılmasından önce P veya E selektini için bloke edici antikorlarla önceden inkübe edildi. Bu grafikte gösterildiği gibi, CHO p tek tabakasının bir P selektin antikoru ile bloke edilmesi, yüzeyde yuvarlanan HL 60 hücrelerinin sayısında önemli bir azalmaya neden oldu, bu da P'nin HL 60 haddelemesini seçtiğini ve gerçekten de aracılık ettiğini gösterdi. Daha önce açıklandığı gibi, çok kuyulu mikroakışkan plaka, çok sayıda ayrı mikroakışkan kanaldan oluşur ve birden fazla farklı koşulun daha yüksek verim testine izin verir.

Bu avantajlı tasarım, enflamatuar koşulları simüle etmek için çeşitli deneysel koşullar altında HL 60 hücreleri ve endotel hücreleri arasındaki etkileşimlerin hızlı analizi için mikroakışkan kanalların içindeki endotel hücrelerini kaplamak için kullanıldı, endotel hücreleri pro-inflamatuar sitokin TNF alfa ile ön işleme tabi tutuldu, bu da E'nin yukarı regülasyonuna neden oldu, ancak endotel hücre yüzeyinde P selektini değil. İlginç bir şekilde, HL 60 hücreleri inaktive edilmiş endotel hücreleri ile etkileşime girmedi ve hücrelerin bu yüzeyde yuvarlandığı gözlenmedi. Aksine, HL 60 hücreleri, HL 60 hücreleri ve aktive edilmiş endotel hücreleri arasındaki yuvarlanma etkileşimlerinde p veya E selektinin katılımını araştırmak için saniyede ortalama beş ila 15 mikron hızla TNF alfa ile aktive edilmiş endotel hücreleri üzerinde sağlam bir yuvarlanma davranışı sergiledi.

TNF alfa ile aktive edilmiş endotel hücreleri, bloke edici antikorlarda P veya E seçimi ile önceden inkübe edildi ve HL 60 hücrelerinin yuvarlanması, TNF alfa endotel hücrelerinde seçilen blokaj grafiğinde gösterildiği gibi analiz edildi ve aktive edilmiş endotel monotabakası üzerindeki yuvarlanan hücrelerin sayısında önemli bir azalma ile sonuçlandı. Buna karşılık, aktive edilmiş endotel hücreleri üzerinde eksprese edilmeyen bir izotop kontrolü veya pektine karşı bir antikor kullanılması, aktive edilmiş endotel tabakası üzerinde HL 60 yuvarlanması üzerinde önemli bir etkiye sahip değildi. Bu veriler, önceki raporlarla tutarlı olarak, TNF alfa ile aktive edilmiş endotel hücreleri üzerinde HL 60 haddelemesinde S selektinin doğrudan katılımını göstermektedir.

Analiz yazılımı, yüzeyle etkileşime girerken tek tek hücrelerin yollarının izlenmesine izin verir. Bu nedenle, tek tek hücrelerin, e seçimi ve antikor blokajı olan veya olmayan TNF alfa ile aktive edilmiş endotel hücreleri ile etkileşime girdiklerinde izledikleri yollar spesifik olarak izlendi Bu şekilde gösterildiği gibi, bloke edilmemiş aktive edilmiş endotel hücreleri üzerindeki yuvarlanan hücrelerin sayısı, seçilmiş ve bloke edilmiş aktive edilmiş endotel hücrelerinden önemli ölçüde daha yüksekti. Ayrıca, HL 60 hücrelerinin bloke edilmemiş endotel hücreleri üzerindeki yuvarlanma hareketinin sürekli ve sağlam olduğu, hücrelerin seçilmiş ve bloke edilmiş endotel hücreleri üzerindeki yuvarlanma yollarının parçalanmış olduğu ortaya çıktı.

Bu bulgu ile tutarlı olarak, HL 60 hücrelerinin bloke edilmemiş TNF alfa aktive edilmiş endotel hücreleri üzerindeki yuvarlanma hızı, e select ve bloke endotel hücrelerindeki yuvarlanma hızından önemli ölçüde daha düşüktü. Bu çalışma, sıkı bir şekilde kontrol edilen tüp akışı altında saatte 10 haddeleme gazına kadar artan verimle hücre haddeleme deneylerini verimli bir şekilde gerçekleştirmek için çoklu bir mikroakışkan sistemin kullanımını göstermektedir. Genel olarak, bu mikroakışkan sistem, hücre çapalamanın önemli bir yönü olan hücre yuvarlamayı incelemek için güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmaktadır.

Örneğin, laboratuvarımız şu anda bu sistemi, terapötik etkilerini iyileştirmek için bir strateji olarak mezenkimal kök hücrelerin hedef kitlesini geliştirmeye yönelik koşulları taramak için kullanıyor.