Mikrovasküler Endotel Fizyolojik E-selektin aracılığı ile Lökosit Rolling Analizi

Bu video, endotel hücre yüzeylerinde lökosit yuvarlanmasını tetikleyen faktörleri incelemek için paralel plaka akış odası analizini göstermektedir. Endotel hücre tek tabakaları, S selektin ekspresyonunu yukarı regüle etmek için pro-inflamatuar sitokin IL bir beta ile uyarılır. Paralel plaka akış odası daha sonra endotel hücrelerinin üzerine yerleştirilir ve S selektin pozitif lökositler tek tabaka üzerine infüze edilir.

Bu nedenle, odadaki hücresel etkileşimler, kılcal damar sonrası es lökosit yapışmasındakine benzer bir katıksız stres ile verilir. Yuvarlanan olaylar, NIS öğeleri ve E select bağımsızlığı için test kullanılarak yakalanır ve numaralandırılır. Merhaba, ben George Weis, Harvard Tıp Fakültesi Brigman Kadın Hastanesi Dermatoloji Bölümü'nde Dr.Charles de Nitro'nun laboratuvarındayım.

Bugün size, fizyolojik kan akışı koşulları altında insan lökositlerinin insan kemik iliği endotel hücrelerine yapışmasında e selektin, E selektin ligandlarının rolünü analiz etmek için bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda, beyaz kan hücrelerinin veya metastatik kanser hücrelerinin, kan damarlarının iç yüzeyini kaplayan endotel hücrelerine yapışmasını başlatan hücre yüzeyi moleküllerinin rolünü incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Bu yapışkan olay, bir şeritten aşağı yuvarlanan bir bowling topu gibi yuvarlanma davranışı ile karakterize edilir.

Öyleyse başlayalım. Bu prosedürdeki ilk adım, akış odasını kaplayacak endotel hücrelerinin hazırlanmasıdır. Bu protokol, insan kemik iliğinden elde edilen H-B-M-E-C 60 hücrelerini kullanır.

Mikrovasküler kültür kapları, mil başına 20 mikrogram fibronektin içeren PBS ile bu 35 mililitrelik doku kültürü kaplarını hazırlamak için fibronektin ile önceden kaplanmalıdır. Bunlar gece boyunca dört santigrat derecede veya 37 santigrat derecede üç saat inkübe edilebilir. H-B-M-E-C 60 hücreyi ortam 1 99'da askıya alın ve tabak başına 10 ila beşinci hücreye tohumlayın, kültürleri %90'ın üzerine çıkacak şekilde büyütün.

Bu, büyüme ortamını yukarı regüle etmek, seçmek ve eksprese etmek, aspire etmek ve mil başına 50 nanogram IL ile taze ortam eklemek, bir beta inkübe etmek için yaklaşık iki gün sürecektir, dört ila altı saat boyunca inkübe edilir. Hücre tek katmanları artık akış odası tahlili için hazırdır. H-B-M-E-C 60 hücrelerinin ek plakaları, IL bir beta ile uyarılabilir ve 37 santigrat derecede bir saat boyunca mil başına 20 mikrogramda nötralize edici anti-insan e selektin antikoru ile tedavi edilebilir.

Bu, e selektinin fonksiyonel ifadesini kontrol edecektir. Daha sonra, e selektin pozitif lökositleri hazırlayın. Bunlar KG, bir insan hematopoietik progenitör hücreleridir.

Bunlar, RPMI 1640'ta mil başına altı hücreye birleşmek veya eğilim göstermek için süspansiyon halinde büyütülür. KG bir A hücreleri doğrudan kültürden pipetlenebilir ve bir hemo sitometrede sayılabilir. Resus, hücreleri HBSS'de mil başına 10 ila altı hücrede 10 milimolar hep veya iki milimolar kalsiyum klorür içeren HH tamponu ile askıya alır.

Hücreleri tahlil edilene kadar buz üzerinde saklayın. Sonraki adımlar, mikroskobun, paralel plaka akış odasının ve şırınga pompasının hazırlanmasını içerir. Tahlil için mikroskobu ve şırınga pompasını açın.

Mikroskopta 10 x objektifi seçin. Tutucuya 50 mililitrelik konik bir tüp yerleştirin ve iki milimolar kalsiyum klorür içeren HH tamponu ile doldurun. Ardından aşağıdaki tutucuya beş mililitrelik plastik test tüpü yerleştirin.

Ardından, şırınga pompasına 60 mililitrelik bir şırınga koyun. Şırınganın hem pistonunun hem de gövdesinin sağlam olduğundan emin olun. 60 mil şırınganın ucuna üç yollu bir durdurma musluğu ve ardından üç yollu durdurma musluğuna beş mililik bir şırınga takın.

Paralel akış odası aparatını, giriş tüpü sağda, çıkış tüpü solda ve vakum tüpü arkada olacak şekilde mikroskop tablasına yerleştirin. Boru vakuma bağlandıktan sonra, paralel plaka aparatının sahneye yapışmasını sağlamak için hava valfini açın. Bu, akış odasındaki vakum eteğinin hava geçirmez olup olmadığını test edecektir.

Conta onaylandığında, hava valfini kapatın. Şimdi çıkış boru hattını şırıngaya zaten bağlı olan üç yollu durdurma musluğuna takın. Cihaz artık H-B-M-E-C 60 hücrelerinin üzerine yerleştirilmeye hazırdır.

Vakumu açın, akış odası aparatını yavaşça plakanın üzerine indirin ve aparatın aşağı emilmesine izin verin. Hava kaçış sesi olmamalıdır ve bu noktada lastik contayı sıkıştırmak için hazneye baskı uygulamanız gerekebilir. Vakum kurulduktan sonra, giriş tüpünü 50 mililitrelik konik tüpe yerleştirin.

Üç yollu durdurma musluğunu 60 mil şırıngaya açın ve plaka üzerindeki hücreleri kaldırmadan hatlardan havayı çıkarmak için pompayı pompa moduna getirin. Giriş tüpünü doldurmak için dakikada iki mil olarak ayarlanmış şırınga pompasını kullanın. Ardından hızlı bir şekilde dakikada 0,5 mil'e ayarlayın.

Sıvı aparata ulaşmadan hemen önce, kurulumu dikkatli bir şekilde astarlamak ve tek tabakayı plakadan kaldıracak hava kabarcıklarından kaçınmak çok önemlidir. Sıvı 60 mil şırıngaya girdiğinde, akış odası ve şırınga pompası doldurulur. Şimdi, giriş, çıkış ve vakum hatlarının her birinin üzerine bir parça bant ile odadaki akışı sahneye sabitleyin.

Bu, verileri görselleştirirken ve toplarken görüş alanının sabit kalmasını sağlar. Akış odası artık kullanıma hazırdır. Bu adımlar, her hücre giriş çalışması ve her yeni plaka için tekrarlanmalıdır.

Lucas'ın site içi hareketli olaylarını yakalamak için masaüstünde NIS öğelerini açın, canlı bir görüntü için oynat simgesine basın. Otomatik pozlama, plakayı görmenizi ve görüntüyü odaklamanızı sağlar. Mikroskopta odağı manuel olarak ayarlayarak mikroskobun hücre tek tabakasına düzgün şekilde odaklandığından emin olun.

Görüntü netlendikten sonra, pozlamayı saniyede bir kareye sıfırlayın ve mikroskoptaki ışığı ayarlayın. Görüntü bilgisayarda görünmeli ve artık mikroskopta görünmemelidir. Işık histogramı daha sonra ayarlanabilir Arka plan pozlamasını kaldırmak veya hücre netliğini artırmak için, film çekimi için ideal bir görüntü elde etmek üzere ikiye iki bölmeye veya canlı bölmeye tıklayın.

Menü çubuğundaki makroya tıklayın ve sağ bağlantı noktasını seçin, bağlantı noktası com'u seçin ve açın. Bu, şırınga pompası ile koordineli olarak bağlantı noktasını açar. Akış odası artık KG bir A hücresi pipeti, bir mil KG bir A S süspansiyonu ile giriş boru hattının yakınındaki beş mil test tüpüne aşılanmaya hazırdır.

Ardından giriş hattını test tüpünün altına yerleştirin. Menü çubuğuna gidin ve yakalama ve hızlandırılmış edinmeye tıklayın. 210 saniye süren protokolü seçin.

Bu, H-B-M-E-C 60 hücreleri üzerinde haddeleme programının uzunluğudur. Her faz, pompa protokolü süresince her saniye bir resim çekecek şekilde programlanmıştır. Ayrıca, pompayı başlatmak için iletişim üç bağlantı noktası üzerinden bir komut gönderecek şekilde ayarlanmıştır.

Şırınga pompasını, belirli akış hızlarının manuel olarak programlanmasına izin veren program moduna ayarlayın. Bu, oda içindeki saf stres seviyelerini belirleyecek ve H-B-M-E-C 60 hücreleri üzerinde KG bir A hücresi etkileşimini belirleyecektir. Bu etkileşimler için ayarlar, 4.2 saniye boyunca santimetre kare başına 45 dines'dir.

60 saniye boyunca santimetre kare başına üç yemek noktası ve her 15 saniyede bir adım uzaklaşma, santimetre kare başına maksimum 4.2 yemek seviyesine yükselir. Mikroskop ve bilgisayar artık zaman atlamalı fotoğraf çekmeye hazır. Programı çalıştırırken veri almaya başlamak için bilgisayarda çalıştırmayı başlat'a basın.

Giriş çıkış borusunu ortamla dolu tutmak ve hava kabarcıklarının sisteme girmesini önlemek için KG bir A hücresi içeren tüpe ortam eklediğinizden emin olun. Zaman atlaması kesintiye uğrarsa, pompa kendi kendine durmaz ve sıfırlanması gerekir. Canlı görüntüye dönmek için iptal düğmesine basın.

Uyarılmamış bir endotel hücresi tek tabakası, bu deney için negatif kontrol görevi görür. Bunu yapmak için, KG bir A lökositlerini, e seçimi bağımsızlığını kontrol etmek için tedavi edilmemiş H-B-M-E-C 60 hücreleri üzerindeki akış odasına infüze edin, endotel hücre mono tabakasını IL bir beta ile uyarın ve leukositleri bu hücrelerin üzerine infüze edin ve eect bağımsızlığını daha fazla kontrol etmek için. H-B-M-E-C 60 hücrelerini IL bir beta ve daha sonra anti-insan S selektin antikoru ile tedavi edin.

Daha sonra bu hücreler üzerindeki lökosit yuvarlanma olaylarını analiz edin. Hücre haddelenmesi sadece S selektini ile değil, aynı zamanda lökosit hücre yüzeyindeki slic asit kalıntıları ile de belirlenir. Bunu göstermek için, KG bir A hücresini 37 santigrat derecede bir saat boyunca mil nöraminidaz başına 0.1 birim ile sindirin.

Daha sonra uyarılmış H-B-M-E-C 60 hücreleri üzerindeki yuvarlanma olaylarını analiz edin. Lökosit yüzeyindeki glikoproteinler de hücre yuvarlanması için önemlidir. Bu, KG bir A hücresinin 37 santigrat derecede bir saat boyunca mil broma şeridi başına 0.2 birim ile muamele edilmesi ve daha sonra bunların akış odasına infüze edilmesiyle gösterilebilir.

Zaman dizisi elde edildikten sonra, veriler analiz için hazırdır. Verileri kaydedin ve menü çubuğundaki hesaplama sekmesine gidin ve tanımlı eşiği seçin. Çubukları, istenen hücreler kırmızı renkte olacak şekilde hareket ettirin, tüm görüntüleri seçin ve ardından tamam, tüm hızlandırılmış dizi şimdi görünür kırmızı yuvarlanan hücrelerle değiştirilmelidir.

Ölç'e gidin ve kısıtlamaları seçin. Bu, kullanıcının yuvarlanan hücreleri temsil etmeyen eşik nesnelerini dışlamasına olanak tanır. Bunlar öncelikle H-B-M-E-C 60 tek katmanlı seçim alanı tarafından oluşturulan arka plan ve yuvarlanan lökositler için ideal olan minimum ve maksimum değerleri girer.

Uzama ve dairesellik için bu adımı yineleyin: Hesaplamayı seçin ve ardından kısıtlamaları kullanarak ikili oluştur'u seçin. Önceki adımda ayarlanan aynı kısıtlama değerleri, şimdi endotel hücre tek tabakası üzerindeki yuvarlanan lökositleri tanımak için NIS elemanları yazılımını optimize etmek için kullanılacaktır. Ölçmeye geri dönün, alan verilerini seçin ve ardından verileri sıfırla'yı seçin.

Menüyü kapatın, ölçüme dönün ve tarama alanını seçin, ölçüm alanı verilerini açın ve sayı veya nesneleri seçin. Ardından tüm alanları seçin ve verileri Microsoft Excel'e aktarın. Son olarak, verileri temizle'yi seçin.

NIS öğeleri artık daha fazla veri toplama için hazır. Bu temsili veriler, lökosit endotel hücre etkileşimlerinin, özellikle yapışkan ligandın rolünü test ederek, fizyolojik saf strese nasıl yanıt verdiğini gösterir. E seçimi.

Sağlam lökosit yuvarlanması, endotel hücreleri IL bir beta ile önceden uyarıldığında meydana gelir. Bu sonucu uyarılmamış kontrol ile karşılaştırırken, hücre yuvarlanmasının sitokin stimülasyonuna bağlı olduğu açıktır. H-B-M-E-C 60 hücrelerini IL bir beta ve daha sonra anti-insan E selektin antikoru ile tedavi ederek, hücre yuvarlanmasının spesifik olarak e selektine bağlı olduğu anlaşılır.

Bu tahlil, diğer parametreleri test etmek için de kullanılabilir. Örneğin, uyarılmış hücreler bir saz veya brolin ile ön işleme tabi tutulduğunda, sonuçlar daha az sağlamdır. Bu veriler, terminal slic asit kalıntılarının yanı sıra hücre yüzeyi glikoproteinlerinin önemini vurgulamaktadır.

S selektin ligand aktivitesi için, lökositlerin kanı terk ettiği ve dokulara girdiği dolaşım sistemi bölgesi olan kılcal damar sonrası venialde bulunan kuvvetleri taklit eden koşullar altında lökositler ve endotel hücreleri arasındaki e selektin bazlı yapıştırıcı etkileşimlerinin nasıl analiz edileceğini gösterdik. Bu prosedürü yaparken, bu tahlil sisteminde ilgili seçici ve ligandının gerekliliğini doğrulamak için uygun bloke edici antikor veya enzimatik tedavi kontrolünü kullanmayı unutmamak önemlidir. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.