Mikrovasküler Endotel Fizyolojik E-selektin aracılığı ile Lökosit Rolling Analizi

Bu video, lökositlerin endotel hücre yüzeylerindeki yuvarlanmasını tetikleyen faktörleri incelemek için kullanılan paralel plak akış odası analizini göstermektedir. Endotel hücre monokatmanları, S-selektin ekspresyonunu artırmak için pro-inflamatuar sitokin IL-1β ile stimüle edilir. Ardından, paralel plak akış odası endotel hücrelerin üzerine yerleştirilir ve S-selektin pozitif lökositler monokatman üzerinden infüze edilir.

Böylece haznedeki hücresel etkileşimlere, postkapiller endotel lökosit adezyonundaki stresle benzer bir kayma gerilmesi uygulanmış olur. Yuvarlanma olayları NIS elementleri kullanılarak yakalanır, sayılır ve E-selektin bağımsızlığı için analiz edilir. Merhaba, ben George Weis; Brigham and Women's Hospital, Harvard Tıp Fakültesi, Dermatoloji Bölümü'nde Dr. Charles de Nitro'nun laboratuvarındayım.

Bugün size, fizyolojik kan akış koşulları altında insan lökositlerinin insan kemik iliği endotel hücrelerine yapışmasında E selektin ve E selektin ligandlarının rolünü analiz eden bir prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, kan damarlarının iç yüzeyini döşeyen endotel hücrelerine beyaz kan hücrelerinin veya metastatik kanser hücrelerinin yapışmasını başlatan hücre yüzeyi moleküllerinin rolünü incelemek için kullanıyoruz. Bu adhezyon olayı, bir bowling topunun kulvar boyunca yuvarlanmasına benzer bir yuvarlanma davranışı ile karakterize edilir.

Öyleyse başlayalım. Bu prosedürün ilk adımı, akış odasını kaplayacak olan endotel hücrelerini hazırlamaktır. Bu protokolde, insan kemik iliğinden türetilmiş H-B-M-E-C 60 hücreleri kullanılmaktadır.

Mikrovasküler kültür kapları, hazırlık amacıyla önceden fibronectin ile kaplanmalıdır; bunun için 35 mL'lik doku kültürü kaplarını, 20 µg/ml fibronectin içeren PBS ile inkübe edin. Bunlar 4 °C'de gece boyunca veya 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edilebilir. H-B-M-E-C 60 hücrelerini medium 1 99 içerisinde süspande edin ve her kap için 10⁵ hücre olacak şekilde ekin; kültürleri %90'ın üzerinde konfluense ulaşana kadar büyütün.

E-selectin ekspresyonunu yukarı regüle etmek yaklaşık iki gün sürecektir; büyüme ortamını aspire edin ve 50 ng/mL IL-1β içeren taze ortam ekleyin, dört ila altı saat inkübe edin. Hücre monokatmanları artık akış odası deneyi için hazırdır. Ek HBMEC-60 hücre plakaları, IL-1β ile stimüle edilebilir ve 37 °C'de bir saat boyunca 20 µg/mL konsantrasyonda nötralize edici anti-human e-selectin antikoru ile işleme tabi tutulabilir.

Bu, e selectin'in fonksiyonel ekspresyonu için kontrol sağlayacaktır. Ardından, e selectin pozitif lökositleri hazırlayın. Bunlar, insan hematopoetik progenitör hücreleri olan KG-1'dir.

Bunlar, RPMI 1640 içerisinde konfluense ulaşana kadar veya mililitrede 10⁶ hücre yoğunluğuna gelene kadar süspansiyonda büyütülür. KG-1A hücreleri doğrudan kültürden pipetlenip hemositometre ile sayılabilir. Hücreleri, 10 mM HEP veya 2 mM kalsiyum klorür içeren HH tamponu eklenmiş HBSS içerisinde, mililitrede 10⁶ hücre olacak şekilde resüspande edin.

Hücreleri analiz edilene kadar buz üzerinde saklayın. Sonraki adımlar mikroskobun, paralel plaka akış odasının ve şırınga pompasının hazırlanmasını içerir. Analiz için mikroskobu ve şırınga pompasını açın.

Mikroskopta 10 x objektifi seçin. Tutucuya 50 mililitrelik konik tüp yerleştirin ve içini iki milimolar kalsiyum klorür içeren HH tamponu ile doldurun. Ardından alt kısımdaki tutucuya beş mililitrelik plastik test tüplerini yerleştirin.

Ardından, şırınga pompasına 60 mL'lik bir şırınga yerleştirin. Hem pistonun hem de şırınga gövdesinin sabitlendiğinden emin olun. 60 mL'lik şırınganın ucuna üç yollu bir musluk takın ve ardından üç yollu musluğa 5 mL'lik bir şırınga bağlayın.

Paralel akış odası düzeneğini, giriş tüpü sağda, çıkış tüpü solda ve vakum tüpü arkada olacak şekilde mikroskop tablasına yerleştirin. Hortumlar vakuma bağlandıktan sonra, paralel plaka düzeneğinin tablaya yapışmasını sağlamak için hava valfini açın. Bu işlem, akış odasındaki vakum eteğinin hava sızdırmaz olup olmadığını test edecektir.

Sızdırmazlık onaylandığında, hava valfini kapatın. Şimdi çıkış tüp hattını, şırıngaya önceden bağlanmış olan üç yollu musluğa takın. Düzenek artık H-B-M-E-C 60 hücrelerinin üzerine yerleştirilmeye hazırdır.

Vakumu açın, akış odası düzeneğini yavaşça plakanın üzerine yerleştirin ve düzeneğin vakumla oturmasını bekleyin. Hava sızıntısı sesi gelmemelidir ve bu noktada, kauçuk contayı sıkıştırmak için odaya baskı uygulamanız gerekebilir. Vakum kurulduktan sonra, giriş tüpünü 50 mililitrelik konik tüpün içine yerleştirin.

Plakadaki hücreleri yerinden kaldırmadan hatlardaki havayı boşaltmak için üç yollu musluğu 60 ml'lik şırınga konumuna getirin ve pompayı pompa moduna alın. Giriş tüpünü doldurmak için dakikada iki ml hıza ayarlanmış şırınga pompasını kullanın. Ardından hızla dakikada 0,5 ml'ye ayarlayın.

Sıvı aparata ulaşmadan hemen önce, kurulumun dikkatlice hazirlanması ve monotabakayı plakadan kaldıracak olan hava kabarcıklarının önlenmesi kritik öneme sahiptir. Sıvı 60 mil şırıngaya girdiğinde, akış odası ve şırınga pompası hazır hale gelmiş olur. Şimdi, giriş, çıkış ve vakum hatlarının her birinin üzerine bir parça bant yapıştırarak akış odasını sahneye sabitleyin.

Bu, veriler görselleştirilirken ve toplanırken görüş alanının sabit kalmasını sağlar. Akış odası artık kullanıma hazırdır. Bu adımlar, her hücre giriş çalışması ve her yeni plaka için tekrarlanmalıdır.

Lucas bölgesi yuvarlanma olaylarını kaydetmek için masaüstündeki NIS elements programını açın ve canlı görüntüleme için oynat simgesine basın. Otomatik pozlama, plakayı görmenizi ve görüntüyü odaklamanızı sağlayacaktır. Mikroskobun odağını manuel olarak ayarlayarak, mikroskobun hücre tek tabakasına düzgün şekilde odaklandığından emin olun.

Görüntü netlendiğinde, pozlamayı saniyede bir kareye sıfırlayın ve mikroskoptaki ışığı ayarlayın. Görüntü bilgisayarda görünmeli ve artık mikroskoptan görünür olmamalıdır. Ardından, arka plan pozlamasını gidermek veya hücre netliğini artırmak için ışık histogramı ayarlanabilir; movie capture için ideal bir görüntü elde etmek amacıyla "two by two bin" veya "live bin" seçeneğine tıklayın.

Menü çubuğundaki macro seçeneğine tıklayın ve right to port kısmından com three portunu seçip açın. Bu işlem, şırınga pompasıyla koordinasyon sağlamak için portu açar. Akış odası artık KG1-A hücrelerinin infüzyonu için hazırdır; 1 mL KG1-A süspansiyonunu, giriş hortum hattının yanındaki 5 mL'lik test tüpüne pipetleyin.

Ardından, giriş hattını deney tüpünün altına yerleştirin. Menü çubuğuna gidin ve yakalama (capture) ile zaman ayarlı çekim (time lapse acquisition) seçeneklerine tıklayın. 210 saniye süren protokolü seçin.

Bu, H-B-M-E-C 60 hücreleri üzerindeki yuvarlama işlemi için programın uzunluğudur. Her faz, pompa protokolü süresince her saniyede bir fotoğraf çekecek şekilde programlanmıştır. Ayrıca, pompayı başlatmak için comm three portu üzerinden bir komut gönderecek şekilde ayarlanmıştır.

Şırınga pompasını, belirli akış hızlarının manuel olarak programlanmasına olanak tanıyan program moduna ayarlayın. Bu işlem, hazne içindeki kayma gerilimi seviyelerini belirleyecek ve H-B-M-E-C 60 hücreleri üzerindeki KG one A hücre etkileşimlerini dikte edecektir. Bu etkileşimler için ayarlar, 45 saniye boyunca santimetrekare başına 4.2 dine olarak belirlenmiştir.

Saniye başına santimetrekare başına 3 dine değerinde 60 saniye boyunca beklenir ve her 15 saniyede bir artış yapılarak maksimum 4,2 dine per centimeter squared değerine ulaşılır. Mikroskop ve bilgisayar artık zaman ayarlı fotoğraf çekimi yapmaya hazırdır. Programı çalıştırırken veri toplamaya başlamak için bilgisayar üzerindeki start run düğmesine basın.

Giriş-çıkış borularının besiyeri ile dolu kalmasını sağlamak ve sisteme hava kabarcıklarının girmesini önlemek için KG one A hücrelerini içeren tübe besiyeri eklediğinizden emin olun. Time-lapse işlemi kesintiye uğrarsa, pompa kendiliğinden durmayacaktır ve sıfırlanması gerekecektir. Canlı görüntüye dönmek için iptal düğmesine basın.

Uyarılmamış bir endotelyal hücre monokatmanı, bu deney için negatif kontrol olarak kullanılır. Bunu gerçekleştirmek için, E-selektin bağımsızlığını kontrol etmek amacıyla, işlem görmemiş H-B-M-E-C 60 hücreleri üzerindeki akış odasına KG-1A lökositleri infüze edin; ardından E-selektin bağımsızlığını daha fazla kontrol etmek için endotelyal hücre monokatmanını IL-1β ile uyarın ve lökositleri bu hücrelerin üzerine infüze edin. H-B-M-E-C 60 hücrelerini önce IL-1β ile, ardından anti-human S-selektin antikoru ile işlemden geçirin.

Ardından, bu hücrelerdeki lökosit yuvarlanma olaylarını analiz edin. Hücre yuvarlanması yalnızca S selektin tarafından değil, aynı zamanda lökosit hücre yüzeyindeki sialik asit kalıntıları tarafından da belirlenir. Bunu göstermek için, KG one A hücrelerini 37 °C'de bir saat boyunca ml başına 0,1 ünite nöraminidaz ile sindirin.

Ardından, stimüle edilmiş H-B-M-E-C 60 hücreleri üzerindeki yuvarlanma olaylarını analiz edin. Lökosit yüzeyindeki glikoproteinler de hücre yuvarlanması için önemlidir. Bu durum, KG one A hücrelerinin 37 °C'de bir saat boyunca mil başına 0,2 ünite bromelan ile işleme tabi tutulması ve ardından akış odasına infüze edilmesiyle gösterilebilir.

Zaman dizisi elde edildikten sonra veriler analiz için hazır hale gelir. Verileri kaydedin, menü çubuğundaki ölçüm (measure) sekmesine gidin ve tanımlanmış eşik (defined threshold) seçeneğini belirleyin. İstenen hücreler kırmızıyla renklenene kadar çubukları hareket ettirin, tüm görüntüleri seçin ve ardından tamam (okay) düğmesine tıklayın; artık tüm zaman atlamalı (time-lapse) dizinin, görünür kırmızı yuvarlanan hücrelerle modifiye edilmiş olması gerekir.

Ölçüm (measure) sekmesine gidin ve kısıtlamaları (restrictions) seçin. Bu işlem, kullanıcının yuvarlanan hücreleri temsil etmeyen eşik nesnelerini hariç tutmasını sağlar. Bunlar öncelikle H-B-M-E-C 60 tek tabakası tarafından oluşturulan arka plan alanlarıdır; ardından yuvarlanan lökositler için ideal olan minimum ve maksimum değerleri girin.

Bu adımı uzama ve dairesellik için tekrarlayın. Ölçümü seçin ve ardından kısıtlamaları kullanarak ikili oluşturmayı seçin. Bir önceki adımda belirlenen kısıtlama değerleri, NIS elements yazılımını endotel hücre monokatmanındaki yuvarlanan lökositleri tanıyacak şekilde optimize etmek için kullanılacaktır. Ölçüme geri dönün, alan verilerini seçin ve ardından verileri sıfırla seçeneğini belirleyin.

Menüyü kapatın, ölçüme dönüp tarama alanını seçin, ölçüm alanı verilerini açın ve nesne sayısını seçin. Ardından tüm alanları seçin ve verileri Microsoft Excel'e aktarın. Son olarak, verileri temizle seçeneğini seçin.

NIS elementleri artık daha fazla veri toplama için hazırdır. Bu temsili veriler, lökosit-endotel hücre etkileşimlerinin fizyolojik kayma stresine nasıl yanıt verdiğini, özellikle yapışkan ligand E selectin rolünü test ederek göstermektedir.

Endotel hücreleri IL-1β ile önceden stimüle edildiğinde güçlü lökosit yuvarlanması gerçekleşir. Bu sonuç stimüle edilmemiş kontrol ile karşılaştırıldığında, hücre yuvarlanmasının sitokin stimülasyonuna bağlı olduğu açıkça görülmektedir. HBMEC-60 hücreleri önce IL-1β ile, ardından anti-human E-selektin antikoru ilele tedavi edildiğinde, hücre yuvarlanmasının spesifik olarak E-selektine bağlı olduğu ortaya çıkmaktadır.

Bu analiz diğer parametreleri test etmek için de kullanılabilir. Örneğin, stimüle edilmiş hücreler bir siazidaz veya brolin ile ön işlemden geçirildiğinde, sonuçlar daha az belirgindir. Bu veriler, uç siali̇k asit kalıntılarının yanı sıra hücre yüzeyi glikoproteinlerinin önemini vurgulamaktadır.

S selektin ligand aktivitesi için; lökositler ile endotelyal hücreler arasındaki E selektin tabanlı adeziv etkileşimlerin, lökositlerin kandan ayrılarak dokulara girdiği dolaşım sistemi bölgesi olan postkapiller venül içinde mevcut olan kuvvetleri taklit eden koşullar altında nasıl analiz edileceğini gösterdik. Bu prosedürü gerçekleştirirken, bu analiz sisteminde ilgili selektinin ve ligandının gerekliliğini doğrulamak için uygun bloklama antikoru veya enzimatik işlem kontrolünün kullanılmasının önemli olduğunu unutmayın. İşte böyle.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.