Batı Blotting'de Pratik, Kullanışlı ve Güvenilir Toplam Protein Yükleme Kontrolü için V3 Lekesiz İş Akışı

BioRad V three Workflow, araştırmacılara Western blotlama işleminde daha güvenilir kantitasyon ve güven sağlar. Bu, ilk olarak protein örneklerini ayırmak ve görselleştirmek için TGX lekesiz jeller kullanılarak gerçekleştirilir. Ayırma işleminden sonra proteinler, transfer kalitesinin ve verimliliğinin doğrulanmasını sağlayan leke turbo hızlı transfer sistemi kullanılarak bir zara aktarılır.

Transferi doğruladıktan sonra, zar bloke edilir ve hedef proteinler için birincil ve ikincil antikorlarla incelenir. Son olarak, hedef protein seviyeleri, yükleme kontrolü olarak lekesiz toplam protein ölçümü kullanılarak normalize edilir. V three iş akışı, batı kurutma sürecine kolaylık ve şeffaflık getirerek, araştırmacılara ayırmadan aktarmaya ve nicelemeye kadar her adımda güven sağlar.

V three Western iş akışının geleneksel Western blotlamaya göre ana avantajı, lekesiz teknolojinin hedef protein sinyallerinizi normalleştirmek için pratik, kullanışlı ve güvenilir bir toplam protein yükleme kontrolü sunmasıdır. Bu yöntem, değişen deneysel koşullar altında temizlik protein sinyallerinin aşırı doygunluğunu ve temizlik proteinlerinin diferansiyel ekspresyon seviyelerini içeren Western blotting tekniği için yükleme kontrol metodolojilerinin güvenilirliği ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Leke bırakmayan jellerde aktive edilen proteinlerin, daha fazla lekelenmeden çiçekler üzerinde de görselleştirilebildiğini keşfettik, bu da bunların geleneksel toplam protein lekelerine alternatif olarak kullanılmasına ve ayrıca temizlik protein yükleme kontrollerine izin verdiğini keşfettik.

Önümüzdeki birkaç dakika içinde, multipleks floresan kullanarak V üç iş akışının tamamını göstereceğiz. Aynı prosedür, metin protokolüne göre protein örnekleri hazırlandıktan sonra kemilüminesans için de kullanılabilir. Bir kriter kullanarak TGX lekesiz herhangi bir KD prekast jel, tarağı ve bandı kasetin altından çıkarın.

Kaseti jel aparatına yerleştirin ve her iki rezervuarı da çalışan tamponlarla doldurun. Protein standartlarını ve numunelerini yükleyin. Ardından jeli 300 voltta 20 dakika çalıştırın.

Elektroforez tamamlandıktan sonra, kaseti açmak için Criterion Cell kapağındaki jel kaset açma aletini kullanın. Ardından Chemi Dock MP görüntüleyicinin UV translüminatörüne birkaç mililitre su uygulayın. Jeli kasetten dikkatlice kaldırın ve UV Trans Aydınlatıcının üzerine yerleştirin Image Lab yazılımını başlatın ve varsayılan bir dakikalık jel aktivasyon süresini kullanarak lekesiz jeller için yeni bir tek kanal protokolü oluşturun, uygun jel tipini seçin ve yoğun bantlar için varsayılan otomatik optimizasyon.

Ardından protokolü çalıştır'ı tıklayın. Görüntü yakalama işlemi tamamlandıktan sonra, renk ayrımını ve numune kalitesini görselleştirin. Ardından hemen aktarım adımına geçin.

Protein transferini gerçekleştirmek için bir trans blok turbo MIDI PVDF transfer paketi açın. Alt yığını kaset tabanının ortasına yerleştirin. Jeli görüntüleyiciden çıkarın.

Jeli zarın üstüne hizalayın. Jel ve zar arasındaki hava kabarcıklarını gidermek için leke silindirini nazikçe kullanın. Ardından, üst yığını jelin üzerine hizalayın.

Hava kabarcıklarını çıkardıktan sonra kaset kapağını tabana yerleştirin. Kapağı sıkıca aşağı bastırın, kilitlemek için kadranı saat yönünde çevirin ve kaseti iki kurutma kağıdı yuvasından birine yerleştirin. Ana ekrandan turbo protokolünü seçin.

İki mini veya bir mini jeli seçin ve uygun bölme için çalıştır düğmesine basın. Aktarım yedi dakika içinde tamamlanacaktır. Kaseti yuvadan çıkarın.

Kasetin kilidini açın ve kurutma sandviçini sökün. Transfer sonrası jeli Chemi dock MP görüntüleyicinin UV translüminatörüne yerleştirin ve membranı hemen deiyonize suya yerleştirin. Aktivasyon süresi olmadan lekesiz jeller için yeni bir tek kanal protokolü oluşturun.

Uygun jel tipini seçin ve maruz kalma süresini manuel olarak transfer öncesi jelin süresine ayarlayın ve çalıştırma protokolüne tıklayın. Görüntü yakalama tamamlandıktan sonra. Transfer öncesi ve sonrası jeller arasındaki numune bandı yoğunluklarını karşılaştırarak transfer verimliliğini doğrulayın.

Artık gerekmediği için jeli numune tepsisinden çıkarın ve atın. Doğrulamak için blot'a aktarın. Membranı numune tepsisine yerleştirin ve yeni bir tek kanal protokolü ayarlayın.

Lekesiz leke için. Yoğun bantlar için uygun jel tipini ve varsayılan otomatik optimizasyonu seçin. Ardından protokolü çalıştır'ı tıklayın.

Görüntü yakalama işlemi tamamlandıktan sonra, membrana aktarımı doğrulayın. Leke zarını UV trans aydınlatıcıdan çıkarın ve batı lekeleme için engelleme tamponuna yerleştirin. Membranı oda sıcaklığında bir saat inkübe ettikten sonra, ertesi gün gece boyunca dört santigrat derecede fare ve tavşan primer antikorları ile inkübe edin.

Antikor çözeltisini dökün ve lekeyi beş dakika boyunca yıkamak için 50 mililitre TBST kullanın. Lekeyi floresan konjuge, anti muse ve anti tavşan ikincil antikorları ile oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Ardından, lekeyi her biri beş dakika boyunca beş kez yıkamak için TBST'yi kullanın.

Lekeyi görüntülemek için, görüntü laboratuvarı yazılımındaki Chemi doc MP görüntüleyicinin UV trans aydınlatıcısına yerleştirin. Yeni bir çok kanallı protokol ayarlayın. Blot uygulamaları altında dite six 50'yi seçerek birinci kanalı yapılandırın ve yoğun bantlar için varsayılan otomatik optimizasyonu kullanın.

Sırasıyla DITE 5, 49 ve lekesiz leke için ikinci ve üçüncü kanalları yapılandırmak için bu adımları tekrarlayın. Uygun jel tipini seçin ve çalıştırma protokolüne tıklayın. Şeritleri tanımlamak için, lekesiz leke görüntü şeridini ve bantlarını seçin.

Ardından doğru nicelik için otomatik şerit bulucu. Yuvarlanan disk boyutunu 70'e ayarlayarak her numune şeridindeki arka plan profillerinin benzer olduğundan emin olun. Hem dite six 50 hem de 5 49 kanallarındaki bantları tanımlamak için tüm şerit profillerini tarayarak arka plan bütünlüğünü onaylayın.

Varsayılan hassasiyet ayarlarını kullanarak bantları algılamak için bant bulucu aracını kullanın. Normalleştirme kanalını belirlemek için analiz araç kutusuna geri dönün. Normalleştirmeyi tıklayın ve lekesiz lekeyi seçin, toplam şerit proteininin seçildiğinden emin olun.

Moleküler ağırlık standart şeritlerini atamak için analiz araç kutusuna geri dönün, MW analiz araçları'na tıklayın ve uygun şeridin altındaki kutuyu işaretleyin. Son olarak, normalleştirilmiş protein bandı yoğunluklarını görüntülemek için araç çubuğundaki analiz tablosuna tıklayın. Yazılım otomatik olarak hacim yoğunluklarını, normalleştirme faktörlerini ve normalleştirilmiş hacimleri içeren bir tablo oluşturacaktır.

Normalleştirilmiş birimler veri analizi ve raporlama için kullanılmalıdır. Tablo dışa aktarılabilir. Daha fazla analiz için, V three Western blotting iş akışının tamamını gösterdik.

Şimdi size gerçek bir deneyden elde edilen temsili sonuçları göstereceğiz. Kontrol lizatları ve ışınlanmış lenfoblast hücre kültürleri, V three Western blot iş akışı kullanılarak analiz edildi. Lekesiz toplam protein sinyali mavi renkte görünür.

Hedef protein M CM yedi kırmızı renkle gösterilir ve doğrulanmış temizlik protein yükleme kontrolü GA DH yeşil renkle gösterilir. GA DH, bu videoda açıklanan deneysel koşullar kullanılarak doğrusallığı değerlendirilerek uygun bir yükleme kontrolü olarak doğrulanmıştır. Leke üzerindeki her şerit için lekesiz toplam protein sinyalleri, görüntü laboratuvarı yazılımı kullanılarak ölçüldü.

MCM yedi sinyal yoğunluğu, hem toplam protein hem de GA DH sinyalleri kullanılarak normalize edildi. Her iki yöntemle normalize edilen MCM yedi protein bandı hacimleri, doğru normalizasyondan önce kontrol numunelerine göre ışınlanmış numunelerde %25 azalmış ekspresyon seviyeleri ortaya çıkardı. Temizlik proteini, doğrulama olmadan numuneler arasında doğrusal aralığını ve tutarlı ekspresyon seviyelerini doğrulayan doğrulama gerektirir.

Kat hizmetleri protein yükleme kontrolleri, doğru normalleştirmeyi garanti etmez. Buna karşılık, toplam protein normalizasyonu doğrulama gerektirmez. Böylece, V three iş akışı ile elde edilen lekesiz toplam protein sinyali, bu prosedürü denerken pratik, kullanışlı ve daha güvenilir bir yükleme kontrolü sunar.

Lekesiz teknolojinin, mevcut triptofan kalıntılarının UV kaynaklı kovalent modifikasyonu yoluyla protein numunelerinin floresan görselleştirmesine izin verdiğini unutmayın. Sadece nadir durumlarda bu değişiklik, immün algılama veya kütle spektrometresi gibi aşağı akış uygulamalarını önemli ölçüde etkileyecektir. Bu videoyu izledikten sonra, V three Western iş akışını ve lekesiz toplam protein normalizasyonunu nasıl gerçekleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Bu iş akışını multipleks floresan Western lekeleme için göstermiş olsak da, lekesiz teknoloji, ışıldayan Western lekeleriyle toplam protein normalizasyonu için de kullanılabilir.