Name: Kemik İliği Makrofaj üretim kaynaklı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Keşfedin fare kemik iliğinden primer makrofaj farklılaştırma yöntemini. Bu teknik, immünoloji ve hücre biyolojisi araştırmalarında bakteri etkileşimlerini incelemek için yüksek verimli primer hücre sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma CNRS (RESİMLER EG 2012-2014) tarafından ve Regione Campania (LR n.5, Giovanna Mottola 2002/03/28) bir hibe ile desteklenmiştir. Filippo Conti Bilimsel İşbirliği Vakfı&#39;&#39; Infectiopole Sud bir üyesidir.&#39;&#39; Nicola Boucherit Araştırma ve Teknoloji Bakanlığı Fransız bir adam olduğunu. Finansman kaynakları çalışma tasarımı, veri toplama, veri analizi, yayınlamak kararı, ya da yazının hazırlanmasında hiçbir rolü vardı.

Etik Bildirimi Kurallara uygun olarak Aix-Marseille Üniversitesi&#39;nden hayvan taşınması için protokol bizim kurumsal Hayvan Etik Kurul &quot;Conseil Scientifique du Centre de Formation et de Recherche Deneysel Médico-chirurgical&quot; tarafından onaylandı (CFREMC, Eric Ghigo Proje izni 10-300.122.013) bir Décret N 1987/10/19 arasında 87-848 °. Deneyler Faculté de Médecine de la Timone (Eric Ghigo için Deneme İzni numarası 13.385) gerçekleştirildi. 1.. Malzeme ve Kültür Ortamı Hazırlama <ol><li> Iki forseps, iki makas, iki cerrahi bıçaklar, bir havan ve havan sterilize edin. </li><li> % 10 fetal buzağı serumu (FCS), 2 mM glutamin, 100 U / ml penisilin ve / ml streptomisin ihtiva eden 100 ug tam DMEM elde edilir. </li><li> 1x PBS elde etmek için steril damıtılmış su içinde 10x PBS seyreltin. </li><li> Buz gibi soğuk 1 x PBS, buz soğukluğunda tam DMEM, tam bir DMEM wa elde edilir37 ° C&#39;ye kadar şekillendirilir </li></ol> 2. L929 Hücre üst fazlan hazırlanması <ol><li> , 37 ° C de tam DMEM (yirmi 175 cm 2 şişeler)% 5 CO2 akmak üzere L929 hücreleri büyütün. </li></ol> Not: faktörü (GM-CSF) uyarıcı Granülosit-makrofaj koloni makrofaj 12 içine hematopoietik hücre değişimini etkileme için gereklidir. L929 hücreleri, GM-CSF üretir. <ol start="2"><li> Izdiham, taze tam DMEM ile kültür ortamı değiştirin. 10 gün boyunca 32 ° C,% 5 CO2 için şişeler aktarın. </li><li> Toplayın, havuz ve 10 dakika için 750 xg Süpernatantlar santrifüj. Hücre pelet atın. </li><li> -20 ° C&#39;de 15 ml tüpler ve mağaza saklayın yüzer </li></ol> 3. Kemik Makrofaj (BMDM) HAZIRLIĞI İliği-türevli <ol><li> Servikal dislokasyon 1 fare Kurban. <ol><li> Deney boyunca steril bir cerrahi bıçaklar kullanın. % 70 alkolizm ile cildi dezenfektehol. Her arka bacak üstünde bir kesi yapmak ve kas maruz ayak doğru deri aşağıya çekin. </li><li> Arka ayaklarını kesti, steril makas ve steril forseps ile cilt kaldırmak. Steril, buz gibi soğuk 1 x PBS (5 mi) ihtiva eden steril bir Petri kabı (35/10 mm) olan bacaklar yerleştirin. </li><li> Steril makas ve forseps ile kemik yapışmış olan eti ve kasları çıkarın. </li></ol></li><li> Buz soğukluğunda steril 1x PBS (5 mi) ihtiva eden yeni, steril bir Petri kabı (35/10 mm) içine kemikleri aktarın. 5 ml buz soğukluğunda steril 1 x PBS ile kemikleri iki kez yıkayın. </li><li> 5 ml buz soğukluğunda steril 1 x PBS içeren steril bir havanda içine kemik aktarın. </li><li> Steril makasla eklem femur tibia kesti. Bir havan tokmağı kullanılarak 5 ml buz gibi soğuk, steril 1 x PBS içeren steril bir havanda yavaşça kemikleri şut. </li><li> Buz soğukluğunda 15 ml tüpler içinde süpernatan toplamak. Bu adım 3x tekrarlayın. </li><li> 70 mikron naylon filtre içinden hücre strakatı parçaları kaldırmak için İner. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 450 x g&#39;de santrifüje süzüntü </li><li> Yavaşça süpernatant atın. 30 saniye için 10 ml alyuvar lisiz tamponu pelet ayrıştırmaları. 20 ml buz soğukluğunda, tam DMEM ekleyin. </li></ol> Not: Bu adımın amacı, kırmızı kan hücreleri, kirletici kaldırmak için, bu yüzden, bu adım alyuvar lisiz tamponu ile hematopoietik hücre değişimini önlemek için 2 dakika içinde gerçekleştirilmelidir. <ol start="8"><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 450 x g&#39;de santrifüje Yavaşça süpernatant atın. 37 ° C&#39;ye ısıtılmış olan 20 ml bitmiş DMEM içinde pelet ayırmak </li><li> 2 Petri kapları (100/20 mm) içine ayrışmış hücreleri aktarın. 37 ° C&#39;de 4 saat inkübe bunları </li><li> Oda sıcaklığında 50 ml tüpler içinde süpernatantlar toplayın. Ikamet makrofajlar içeren yemekleri atın. </li></ol> Not: Bu adımın amacı, yerleşik kemik Marro ortadan kaldırmak içinkültürü-işlenmiş plastik uymak için kabiliyetleri ile w makrofajlar. Bu yerleşik makrofajlar diğer deneylerde de kullanılabilir. <ol start="11"><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 450 x g&#39;de santrifüj Toplanan süpernatantlar Süpernatant atın. </li><li> 10 ml% 15 L929 hücre süpernatan ihtiva eden tam bir DMEM içinde yavaşça pelet ayrıştırmaları. 40 mikron naylon hücre süzgecinden hücrelerin filtre. </li><li> Filtratı kurtarın. 140 ml% 15 L929 hücre ortamı ile takviye edilmiş DMEM tam için toplanan filtrat (10 mi) ilave edin. </li><li> Petri kabı (15 Petri kapları, 100/20 mm) başına hücre süspansiyonu 10 ml dağıtın. 37 ° C,% 5 CO2 de hücreleri inkübe edin. </li><li> 3 gün boyunca hücrelerin büyümesine </li><li> 10 ml% 15 L929 deneyinde ile takviye edilmiş DMEM tam ekleyin. Ilave 4 gün boyunca inkübe hücreleri. </li></ol> Not: Bir ters mikroskop ile, periyodik olarak, hücre büyümesini Monitör (3,14-3,16 adım). Yapışık makrofajlar olacakkültür 3 gün sonra saptanmıştır. 4. Hasat BMDMs <ol><li> Süpernatant kaldırmak. Bitmiş DMEM ile BMDMs 2 kez yıkayın </li><li> 5 ml 37 ° C&#39;ye ısıtıldı edilmiş tam bir DMEM ekleme Nazikçe bir lastik polis ile kazıyarak BMDMs ayırın. </li><li> 10 dakika boyunca 450 x g &#39;de 50 ml tüpler ve santrifüj BMDMs toplayın. Yavaşça, 20 ml bitmiş DMEM içinde hücre pelletleri ayrışır. </li><li> Tripan mavisi mevcudiyetinde BMDMs Toplamı (en fazla% 10 mortalite dikkat edilmelidir.) </li></ol> Not: Genellikle, yaklaşık 6-7.5 x 10 7 makrofajlar makrofaj 15 Petri kutularına (100/20 mm) elde edilmiştir. Yaklaşık 4-5 x 10 6 makrofaj / Petri (100/20 mm) vardır. <ol start="5"><li> Deney için gerekli olan BMDMs hazırlayın. 37 ° C&#39;de komple ortam içinde 16 saat sonra,% 5 CO2, makrofajlar yeniden desteğe yapışır. </li></ol> 5. BMDMs saklanması <ol><li> İzole BMDMs (adım 4.3) toplayın. 10 dakika boyunca 450 x g&#39;de santrifüj. Not: BMDMs sıvı azot içinde dondurulmuş olabilir. </li><li> Her bir ampul içine / ml pipet ve 1 ml 4 x 10 6 hücre nihai konsantrasyonda,% 10 DMSO ve% 90 FCS içeren dondurma ortamı içinde yeniden süspanse hücre topakları. </li><li> 1 ° C / dk bir soğutma oranında hücreleri dondurur. 24 saat sonra uzun süreli saklama için sıvı nitrojen kaba ampul aktarın. </li></ol>

<ol><li>Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+generating+functionally+heterogeneous+macrophages%3A+chaos+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited.</a> J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).</li>
<li>Van Furth, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+Furth%2C+R+%22Inflammation%3A+Basic+Principles+and+Clinical+Correlates%22">Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates</a>. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).</li>
<li>Adams, D., Halmiton, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAdams%2C+D+%22Inflammation%3A+Basic+Principles+and+Clinical+Correlates%22">Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates</a>. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).</li>
<li>Morris, L., Graham, C. F., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+haemopoietic+and+other+tissues+of+the+developing+mouse+detected+by+the+monoclonal+antibody+F4%2F80%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80.</a> Development. 112, 517-526 (1991).</li>
<li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagosome%3A+compartment+with+a+license+to+kill%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The phagosome: compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8, 311-330 (2007).</li>
<li>Underhill, D. M., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+of+microbes%3A+complexity+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis of microbes: complexity in action.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002).</li>
<li>Castagna, A., Polati, R., Bossi, A. M., Girelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte%2Fmacrophage+proteomics%3A+recent+findings+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Monocyte/macrophage proteomics: recent findings and biomedical applications.</a> Expert Rev. Proteomics. 9, 201-215 (2012).</li>
<li>Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in bacterial infections.</a> J. Immunol. 181, 3733-3739 (2008).</li>
<li>Barry, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+stimulation+of+p38alpha-MAPK%2FVps41-HOPS+by+LPS+from+pathogenic+Coxiella+burnetii+prevents+trafficking+to+microbicidal+phagolysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Impaired stimulation of p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS by LPS from pathogenic Coxiella burnetii prevents trafficking to microbicidal phagolysosomes.</a> Cell Host Microbe. 12, 751-763 (2012).</li>
<li>Henry, R. M., Hoppe, A. D., Joshi, N., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uniformity+of+phagosome+maturation+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The uniformity of phagosome maturation in macrophages.</a> J. Cell Biol. 164, 185-194 (2004).</li>
<li>Sundaramurthy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Chemical+and+RNAi+Multiparametric+Profiles+Identifies+Triggers+of+Intracellular+Mycobacterial+Killing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Integration of Chemical and RNAi Multiparametric Profiles Identifies Triggers of Intracellular Mycobacterial Killing.</a> Cell Host Microbe. 13, 129-142 (2013).</li>
<li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+rat+bone+marrow+cells+into+macrophages+under+the+influence+of+mouse+L929+cell+supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant.</a> J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).</li>
</ol>

Hiçbir çıkar beyan çatışmalar vardır.

Burada tarif edilen protokol BMDMs çok sayıda üretilmesi için bir yöntem göstermektedir. BMDM birincil hücreler ve olgunlaşmamış makrofaj hücre hatları, aksine, olgun vardır, çünkü biyolojik fonksiyonunu ve monositler ayırt makrofajların özelliklerine sahiptir. BMDMs genetik tarama (RNAi), ilaç tarama, fonksiyonel çalışmalar, konak-patojen etkileşimi çalışmaları ve soruşturma diğer birçok alanda kullanılabilir. Burada sunulan işlem çok basittir ve herhangi bir özel ekipman gerektirmez, bu ne...

Makrofaj fonksiyonunun önemli bir yönü doğal ve adaptif bağışıklık rolleri olduğunu. Çünkü asal partiküller, bakteri veya parazit fagosite kapasiteleri, makrofajlar yabancı işgalcilere karşı ilk savunma hattı vardır. Bir kez içselleştirilmiş, mikroplar fagolizozomları içinde parçalanırlar. Aynı zamanda makrofajlar, T lenfositler ve diğer bağışıklık hücrelerinin için işe alım sinyalleri ve antijenlerini gönderebilirsiniz. Makrofajlar monositlerden elde edilmiştir. Monositler miyeloid kök hücrelerden kemik iliği ortaya çıkan ve makrofajlara ayırt periferik kan ve çeşitli dokulara göç ederler. Sağlıklı yetişkin fare, çeşitli organ ve dokularda (Tablo 1), 1,2 vücut boyunca dağıtılan yaklaşık 10 8 makrofajlar içerdiği tahmin edilmektedir. Makrofajlar nedeniyle mikroçevresinin 3,4 uyum kabiliyetleri büyük fenotipik ve fonksiyonel çeşitlilik gösterir. En önemli macrophage mülkiyet mikropları fagosite ve onları yok etmek için kendi kapasitesi ile tanımlanır onların mikrobisidal faaliyetidir. Fagositik yanıt mikrobiyal temas ile uyarılır kompleks sinyal ağların aktivasyonu ile tanımlanan, bu yüzden, makrofajlar çeşitli uyaranlara karşı yanıt olarak uygun gen ifadesini modüle ederler. Fagositozundan sonra, mikroplar phagolysosome denilen bir yapıda ortadan kalkar, ancak birçok patojen mikroplar makrofaj 5 mikrobisidal fonksiyonunu yıkmak için stratejiler geliştirdik. Farklı mikrobiyal türler tarafından kullanılan yıkılma mekanizmalarının çeşitlilik Fagositik sürecinin 6 karmaşıklığı ve phagolysosome biyogeneze bir kanıtıdır. Bulaşıcı hastalıklar, başlıca insan sağlık sorunları, ve çok sayıda mekanizmaları ve molekülleri makrofaj antimikrobiyal faaliyetlerine katılmak. Ayrıca, mikroplar tarafından kaçırıldı vardır mikrobisidal özelliklerinin hedefleri hala bilinmiyor, bu nedenle, bir e varmakrofajlar ile ilgili bilimsel dikkatini yeniledi konak-patojen etkileşimleri, evrimsel genetik ve biyokimyasal açıdan ilgi xplosion. Şu anda, bu alanda araştırma çoğunluğu fagositik aktivitesi, sitokin üretimi ve oksidatif patlama düzenlenmesinde birincil makrofaj farklılık makrofajlar hücre çizgileri, yapılır. Buna ek olarak, mikroskopi için daha az uygundur. Etkileşim makrofajlar-patojenleri araştırmak için daha fazla fizyolojik özellikler sergileyen bu gibi Kemik İliği kökenli makrofajlar (BMDMs) birincil makrofajlar, kullanımı tavsiye edilir. Bu makrofajlar transgenik farelerden izole edilmiş ve doğrudan doğruya, örneğin lentiviral transfeksiyonu gibi yeni teknolojilerin durumu ile olabilir çünkü Ayrıca, bu, genetik olarak modifiye edilmiş BMDMs üzerinde çalışmak mümkündür, bunların gen ekspresyon profili gen aşırı ifadesi veya RNA girişim ile değiştirilebilir. Burada, biz fare kemik m ayırt etmek için bir prosedür açıklanmaktadırfonksiyonel gibi Proteomikte 7, transkriptomik 8 gibi analizler çeşitli için 7 gün içinde makrofajlar çok sayıda sağlayacaktır makrofajlar içine ok, içi insan ticareti 9, dinamik çalışmaları 10, genetik ekranlar (RNAi) ve 11 tarama ilaç çalışmaları.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco Yaşam Teknolojileri</td><td>21969-035</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Buzağı Serumu</td><td>Gibco Yaşam Teknolojileri</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Gibco Yaşam Teknolojileri</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Gibco Yaşam Teknolojileri</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Lonza</td><td>BEM515F</td><td></td></tr><tr><td>Kırmızı Kan Hücresi Lizisi tampon</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeci 70 & mu; m Naylon</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeci 40 &mu; m Naylon</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tüpler</td><td>herhangi bir tedarikçi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tüpler</td><td>herhangi bir tedarikçi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları (100/20 mm)</td><td>herhangi bir tedarikçi</td><td>n/a</td><td>kültürle işlenmiş</td></tr><tr><td>Petri kapları (35/10 mm)</td><td>herhangi bir tedarikçi</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

kemik İliği makrofaj üretim kaynaklı

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Makrofajlar, doğal ve adaptif immün yanıtları kritik bileşenleri ve bunlar nedeniyle güçlü mikrobisidal faaliyetlerinin yabancı işgalcilere karşı ilk savunma hattı vardır. Makrofajlar, tüm vücuda yaygın şekilde dağıtılmıştır ve lenfoid organlarda bulunurlar, karaciğer, akciğer, gastrointestinal sistem, merkezi sinir sistemi, kemik ve deri. Çünkü onların yeniden bölme içinde, bunlar, fizyolojik ve patolojik işlemler geniş bir yelpazede katılabilir. Makrofajlar microenvironmental değişiklikleri tanımak ve doku dengesini korumak için mümkün oldukça çok yönlü hücrelerdir. Çok sayıda patojenler, hayatta çoğaltmak ve enfekte insan ve hayvanları hem vücutta yayılmasına için Truva atları gibi makrofajlar kullanmak için mekanizmalar gelişmiştir. Konak-patojen etkileşimleri, evrimsel genetik ve biyokimyasal açıdan ilgi son patlama makrofajlar ilgili bilimsel ilgi yeniledi. Burada, bir tarifkonukçu-patojen etkileşimlerine okuyan hem de diğer işlemler için makrofajların sayıda sağlayacak faregiller kemik iliğinden izole makrofajlar ve yetiştirmek için prosedür.

Bu yöntemin amacı, kolayca birkaç gün makrofajların çok sayıda elde etmek olmuştur. Kemik iliği hücre hazırlama, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Arka bacak kemikleri toplanır ve bir havanda ezildi. Makrofajlar yerleşik kemik iliği hücre hazırlama çıkarıldı sonra, kemik iliği hücreleri, GM-CSF (Gün 0) ile inkübe edildi. 3 gün sonra, kültürden önce yuvarlak ve nonadherent olan hücreler, makrofajlar içine farklılaştırmak ve (Şekil 1A) uymak başlar. F4/80 sitometri analizi ile ve HLA-DR bel...

Makrofajlar uzun doğal ve adaptif immün yanıtları kritik bir bileşeni olarak kabul edilmiştir. Makrofajlar ve mikrop arasındaki etkileşimin, evrimsel genetik ve biyokimyasal yönleri ile ilgili bilginin son patlama makrofajlara bilimsel ilgi yenilenmiştir. Bu makalede, fare kemik iliği makrofajları ayırt etmek için bir yöntem tarif edilir.

Kemik İliği Makrofaj üretim kaynaklı

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Bu prosedürün genel amacı, idrar, kemik iliği türevli hücre kültürlerinden makrofajlar üretmektir. Bu işlem, öncelikle fare arka bacaklarından kemik iliğinin ekstrakte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, kemik iliği yerleşik makrofajlar uzaklaştırılır ve ardından kemik iliği hücreleri, makrofaj farklılaşma koşulları altında kültüre edilmeye devam edilir.Ardından, kemik iliği hücreleri makrofajlara farklılaştığında, deneysel analiz için toplanabilirler. Nihayetinde, bakteriyel LPS'nin kemik iliğinden türetilmiş makrofajların asidik kompartmanları içindeki lokalizasyonunu göstermek için konfokal mikroskopi kullanılabilir. Bu tekniğin makrofaj hücre hatlarını büyütmek gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çok sayıda primer makrofaj elde edilebilmesidir.Kendi başına üretim adımlarının öğrenilmesi zor olduğu ve pratik gerektirdiği için yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir; başarıya ulaşmak için, ötenazi uygulanmış bir farenin cildini %70 etanol ile dezenfekte edin. Her bir arka bacağın üst kısmından bir insizyon yapın ve kası açığa çıkarmak için cildi ayağa doğru aşağıya çekin. Ardından, steril makas ve pens kullanarak arka bacakları kesin.Deriyi temizlemek için bacakları, içinde beş mililitre steril buz gibi soğuk PBS bulunan steril 35 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Kemiklere yapışmış olan tüm deri ve kas dokularını temizleyin ve ardından kemikleri, içinde beş mililitre buz bulunan yeni bir steril Petri kabına aktarın.Soğuk, steril PBS. Kemikleri beş mililitre daha PBS ile iki kez yıkayın ve ardından beş mililitre buz soğukluğunda steril PBS içeren steril bir havana aktarın.Şimdi tibyayı eklem yerinden femurdan kesin ve kemikleri nazikçe ezmek için bir havan eli kullanın. Süpernatantı, buz gibi soğuk 15 milliliter tüplere üç kez toplayın. Ardından doku süspansiyonunu 70 mikronluk bir naylon hücre süzgecinden filtreleyin.Katı parçacıkları uzaklaştırmak için filtratı santrifüjleyin ve süpernatantı dikkatlice dökün. Pelleti eritrosit liziz tamponu ile ayrıştırın, reaksiyonu durdurmak için 30 saniye sonra 20 milliliters buz soğukluğunda komple DMEM ekleyin; hücreleri santrifüjledikten sonra pelleti 20 milliliters 37 degrees Celsius komple DMEM içinde süspande ediyoruz ve ardından hücre süspansiyonunu iki adet 100 millimeter Petri kabına paylaştırıyoruz. Kapları 37 degrees Celsius sıcaklıkta dört saat inkübe edin ve ardından süpernatantları oda sıcaklığında 50 milliliter tüplere toplayın.Süpernatantlar santrifüjle çöktürüldükten sonra, peleti önceden hazırlanmış L 9 29 hücre süpernatantı ile desteklenmiş 10 mililitre komple DMEM içinde yeniden süspanse edin ve ardından hücreleri 40 mikronluk bir naylon hücre süzgecinden filtreleyin. Filtratı 140 mililitre komple DMEM ve L 9 29 hücre besiyerine ekleyin ve ardından hücre süspansiyonunu, kap başına 10 mililitre olacak şekilde 15 adet 100 milimetrelik Petri kabına dağıtın. Hücreleri 37 °C ve %5 karbon dioksit altında üç gün boyunca inkübe ettikten sonra, 10 mililitre komple DMEM artı L 9 29 süpernatantı ekleyin ve hücreleri dört gün daha inkübe edin.Kemik iliği kaynaklı makrofajları toplamak için hücre büyümesini bir ters mikroskopla periyodik olarak izleyin; önce süpernatantı aspire edin ve atın. Ardından Petri kaplarını iki kez tam DMEM ile yıkayın. Sonrasında, beş mililitre 37 °C tam DMEM ekleyin ve hücreleri nazikçe ayırmak için bir kauçuk hücre kazıyıcı (policeman) kullanın, kemik iliği kaynaklı makrofajları 50 mililitrelik tüplere toplayın ve ardından hücreleri santrifüj ederek çöktürün.Peletleri 20 mililitre komplet DMEM içerisinde resüspand edin. Son olarak, hücreleri tripan mavisi dışlama yöntemiyle sayın. Bu yöntemle, az önce gösterildiği gibi, kemik iliği yerleşik makrofajlar hariç tutularak yuvarlak yapışmayan kemik iliği hücrelerinin izole edilmesi ve ekilmesiyle sadece birkaç gün içinde yüksek sayıda makrofaj elde edilebilir.Bu temsili BMDM öncül hücreleri G-M-C-S-F ile inkübe edildi. Üç gün sonra hücreler yapışmaya ve makrofajlara farklılaşmaya başladı. Yedi gün sonra, kemik iliği kaynaklı makrofajlardan oluşan konfluent bir tek tabaka gözlemlendi.F4/80 ve HLA-DR için yapılan akış sitometrisi analizi, kemik iliği kaynaklı makrofajların her iki markörü de eksprese ettiğini ortaya koyarak kemik iliği hücrelerinin makrofajlara farklılaşmasını doğrulamıştır. Kemik iliği kaynaklı makrofajların fagositoz yeteneklerini değerlendirmek amacıyla, hücrelerin lateks boncukları içselleştirme kapasitesi beklendiği üzere izlenmiştir.Endositik potansiyellerini değerlendirmek amacıyla hücre başına düşen boncuk sayısının zamanla arttığı belirlenmiştir. Kemik iliği türevli makrofajlar ayrıca Coxiella ile ko-kültüre edilmiştir. Kırmızı renkteki Burnett göz LPS'sinin, mavi renkteki lizozomal ilişkili membran proteini bir'in bulunduğu ancak yeşil renkteki kathepsin D'nin bulunmadığı bir kompartmanda lokalize olduğu gözlemlenmiş; bu durum, LPS'nin, beklenen kemik iliği türevli makrofajların aksine lizozomlarla birleşemeyen geç endozomlarda mevcut olduğunu göstermiştir.Bakteriyel patojen etkileşimleri, TMA Wiley göz enfeksiyonları aracılığıyla daha ayrıntılı olarak analiz edilmiştir. Beklendiği gibi, kırmızıyla gösterilen bakteriler, yeniden yeşil renkte görünen KPS ve D içeren bölmede yerleşmemiştir. Bu temsili immünoblotta, kemik iliği türevli makrofaj sinyal iletim yolları değerlendirilmiş ve doku benzeri kemik iliği türevli makrofajların, izole makrofajlar gibi, esia coli LPS stimülasyonuna yanıt olarak fosforile P 38 alfa map kinaz seviyelerini yukarı regüle ettiği gösterilmiştir.Bu yöntem, mikro lokalizasyonun hangi hücre içi kompartmanda gerçekleştiği gibi hücresel mikrobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

bone-marrow-derived-macrophage-production

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, bakteriyel lipopolisakkarit ve intravenöz immünoglobuline yanıt olarak kemik iliği kaynaklı makrofajların aktivasyonunu gösteriyoruz.

Antikorlara Yanıt Olarak Fare Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların Aktivasyonu

Bu makale, kolayca kolay uyarlanabilir...

Kemik İliği Türetilmiş makrofajlar kullanarak Makrofaj Polarizasyon İncelenmesi

İnsan makrofaj üretimi için basit ve etkin bir protokol sunuyoruz. İnce beyaz kat çifte yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile işlenir ve izole edilmiş monositlerin, sonra Teflon kaplı bir hücre kültürü torbalarda makrofajlara ayrılır. Bu makrofaj verim maksimize ve daha sonraki deneyler için hücre hasat kolaylaştırır.

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Burada murin peritoneal makrofajları izole etmek için basit bir protokolü açıklıyoruz. Bu prosedürü, Toll benzeri reseptörlerin uyarılması üzerine gen ekspresyon analizi yapmak için RNA ekstraksiyonu takip eder.

Fare Periton Makrofagların izolasyonu Toll-benzeri reseptörler Uyarım üzerine Gen İfadesi Analizi Yapacak

Metabolik yeniden programlama, M1 ve M2 makrofaj polarizasyonu için bir özellik ve önkoşuldur. Bu el yazması, fare kemik iliği türevli makrofajlarda glikoliz ve mitokondriyal fonksiyonun temel parametrelerinin ölçümü için bir testi açıklamaktadır. Bu araç, belirli faktörlerin makrofajın metabolizmasını ve fenotipini nasıl etkilediğini araştırmak için uygulanabilir.

Gerçek zamanlı Ekstrasellüler Flux Analizi Polarize M1 ve M2 Kemik İliği-türevli Makrofagların Metabolik Karakterizasyonu

Granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ile kültürlenen kemik iliği hücreleri, makrofajlar ve dendritik hücreler (DC'ler) içeren heterojen bir kültür oluşturur. Bu yöntem, makrofajları GM-CSF kültüründeki DC'lerden ayırt etmek için MHCII ve hyaluronan (HA) bağlanmasının kullanılmasını vurgular. Bu kültürdeki makrofajlar, alveolar makrofajlarla birçok benzerliğe sahiptir.

Fare Kemik İliği itibaren Üretimi ve GM-CSF tanımlanması Türetilmiş Alveoler gibi makrofajlar ve dendritik hücrelerin

Makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) farklılaşmış insan monosit türevi makrofajların hücre kültürü için bir protokol sunulmuştur. Protokol, monositlerin makrofajlara toplu farklılaşması ile birlikte dondurularak saklanmasını kullanır. Daha sonra hasat edilen makrofajlar daha sonra deneyler yapmak için gerekli hücre yoğunluklarında kültür kuyularına ekilebilir.

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

Bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden makrofajların sağlam nesil açıklar, ve sonraki karakterizasyonu için yöntemler. Hücre yüzeyi belirteç ekspresyonu, gen ekspresyonu ve fonksiyonel tahliller bu iPSC kaynaklı makrofajların fenotip ve fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılır.

Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Makrofajlarının Üretimi ve Karakterizasyonu

Bu protokol, NO-redoks biyolojisini incelemek için tetrahidrobiyopterin (BH4) ve indüklenebilir nitrik oksit sentaz (iNOS) eksikliği olan primer murin makrofajlarını kültürlemek için kurulmuştur. Çalışma, BH4'ün ve geleneksel izolasyon ve kültür yöntemlerinde bulunan ve deneysel sonuçları ve sonuçların yorumlanmasını karıştırabilecek diğer eserlerin potansiyel kontaminasyonunu azaltmaya odaklanmaktadır.

NO-Redoks Biyolojisi Çalışması için Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve In vitro Kültürü

Bu protokol, farelerden kemik iliği kaynaklı makrofajların izolasyonunu ve kültürünü açıklamaktadır.

Farelerden Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Bu protokol, 7-9 günlük yenidoğan fare kemik iliği hücrelerini izole etmek ve granülosit koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kaynağı olarak L929 hücrelerinin bir süpernatantını kullanarak farklılaşmış makrofajlar oluşturmak için enzimatik olmayan ve basit bir yöntemi tanımlar. Kemik iliği kaynaklı makrofajlar, yüzey antijenleri F4/80, CD206, CD11b ve fonksiyonel yeterlilik açısından daha fazla analiz edildi.

Yenidoğan Fare Kemik İliği İzolasyonu ve Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların Hazırlanması

Keşfedin fare kemik iliğinden primer makrofaj farklılaştırma yöntemini. Bu teknik, immünoloji ve hücre biyolojisi araştırmalarında bakteri etkileşimlerini incelemek için yüksek verimli primer hücre sağlar.

Kemik İliği Makrofaj üretim kaynaklı

Daha fazla video keşfet