Kemik İliği Makrofaj üretim kaynaklı

Bu prosedürün genel amacı, idrardan, kemik iliği kaynaklı hücre kültürlerinden makrofajlar üretmektir. Bu, ilk olarak farenin arka bacaklarından kemik iliğinin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, kemik iliğinde yerleşik makrofajlar çıkarılır ve daha sonra kemik iliği hücreleri, makrofaj farklılaşma koşulları altında daha fazla kültürlenir.

Daha sonra kemik iliği hücreleri makrofajlara farklılaştığında, deneysel analiz için toplanabilirler. Sonuç olarak, konfokal mikroskopi, kemik iliği kaynaklı makrofaj, uç asidik kompartmanlar içinde bakteriyel LPS'nin lokalizasyonunu göstermek için kullanılabilir. Bu tekniğin büyüyen makrofajlar, hücre hatları gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, çok sayıda olmasıdır, bu nedenle birincil makrofajlar elde edilebilir.

Yöntemin görsel gösterimi, kendi kendine üretim adımlarının öğrenilmesi zor ve pratik gerektirdiğinden kritik öneme sahiptir ve başarıya ulaşmak için ötenazi yapılmış bir farenin cildini% 70 etanol ile dezenfekte edin. Her arka bacağın üst kısmında bir kesi yapın ve kası ortaya çıkarmak için cildi ayağa doğru çekin. Sonra, arka ayakları kesin ve steril makas ve forseps kullanın.

Cildi çıkarmak için bacakları beş mililitre steril buz içeren 35 milimetrelik steril bir Petri kabına yerleştirin. Soğuk PBS. Kemiklere bağlı tüm deri ve kasları çıkarın ve ardından kemikleri beş mililitre buz içeren yeni bir steril Petri kabına aktarın.

Soğuk, steril PBS. Kemikleri beş mililitre PBS ile iki kez yıkayın ve ardından beş mililitre buz içeren steril bir harca aktarın. Soğuk, steril PBS.

Şimdi tibiayı eklemdeki uyluk kemiğinden kesin ve kemikleri nazikçe parçalamak için bir havaneli kullanın. Süpernatanı buz gibi 15 mililitrelik tüplerde üç kez toplayın. Daha sonra doku süspansiyonunu 70 mikronluk bir naylon hücre süzgecinden süzün

Katı parçaları çıkarmak için, süzüntüyü aşağı doğru döndürün ve süpernatanı yavaşça atın. Hücreleri santrifüjledikten sonra reaksiyonu durdurmak için 30 saniye sonra 20 mililitre buz gibi tam DMEM ekleyerek peleti kırmızı kan hücresi lizis tamponu ile ayırın, peleti 20 mililitre 37 santigrat derecede süspanse ediyoruz, DMEM'i tamamlıyoruz ve ardından hücre süspansiyonunu iki 100 milimetrelik Petri kabı arasında bölüyoruz. Bulaşıkları 37 santigrat derecede dört saat boyunca inkübe edin ve ardından süpernatanları oda sıcaklığında 50 mililitrelik tüplere toplayın.

Süpernatanları döndürdükten sonra, peleti önceden hazırlanmış L 9 29 hücre süpernatanı ile desteklenmiş 10 mililitre tam DMEM içinde yeniden süspanse edin ve ardından hücreleri 40 mikronluk bir naylon hücre süzgecinden süzün. Süzüntüyü 140 mililitre tam DMEM ve L 9 29 hücre ortamına ekleyin ve ardından tabak başına 10 mililitre hücre süspansiyonunu 15 100 milimetre Petri kabına dağıtın. Hücreleri 37 santigrat derecede üç gün inkübe ettikten ve 10 mililitre tam DMEM artı L 9 29 süpernatantta% 5 karbondioksit inkübe ettikten sonra hücreleri dört gün daha inkübe edin.

Kemik iliği türevi makrofajları hasat etmek için hücre büyümesinin periyodik olarak ters mikroskopla izlenmesi, önce süpernatanı aspire edin ve atın. Daha sonra Petri kaplarını tam DMEM ile iki kez yıkayın. Daha sonra, beş mililitre 37 santigrat derece tam DMEM ekleyin ve hücreleri nazikçe ayırmak, kemik iliği türevi makrofajları 50 mililitrelik tüplerde toplamak ve ardından hücreleri döndürmek için bir lastik polis kullanın.

Resus, peletleri 20 mililitre tam DMEM'de askıya alır. Son olarak, hücreleri triam mavisi dışlamasına göre sayın. Bu yöntemi kullanarak, az önce gösterildiği gibi, yuvarlak yapışık olmayan kemik iliği hücreleri eksi kemik iliği yerleşik makrofajları izole ettikten ve kapladıktan sadece birkaç gün sonra çok sayıda makrofaj elde edilebilir.

Bu temsili BMDM öncü hücreleri G-M-C-S-F ile inkübe edildi. Üç gün sonra, hücreler makrofajlara yapışmaya ve farklılaşmaya başladı. Yedi gün sonra, kemik iliği türevli makrofajların birleşik bir tek tabakası gözlendi.

F four, 80 ve H-L-A-D-R için akış sitometrik analizi, kemik iliği kaynaklı makrofajların, kemik iliği hücrelerinin makrofajlara farklılaşmasını doğrulayan her iki belirteci de eksprese ettiğini ortaya koydu. Kemik iliği kaynaklı makrofajların PHA asidik yeteneklerini değerlendirmek. Hücrelerin lateks hızlarını içselleştirme yeteneği beklendiği gibi izlendi.

Hücre başına düşen boncuk sayısının, endositik potansiyellerini değerlendirmek için zamanla arttığı belirlendi. Kemik iliğinden elde edilen makrofajlar da Coxiella ile birlikte kültürlendi. Kırmızı renkteki Burnett gözü LPS'nin, mavi renkte lizozomal ilişkili zar proteini bir'i barındıran bir bölmeye lokalize olduğu, ancak yeşil renkte katepsin D'ye lokalize olmadığı gözlendi, bu da LPS'nin, kemik iliği kaynaklı makrofaj olarak lizozomlarla kaynaşamayan geç endozomlarda mevcut olduğunu gösterdi.

Bakteriyel patojen etkileşimleri, TMA Wiley gözü ile enfeksiyonları yoluyla daha fazla analiz edildi. Beklendiği gibi, kırmızı renkteki bakteriler, yine yeşil renkte görünen KPS ve D'yi barındıran bölmede lokalize değildi. Bu temsili immünobotta, kemik iliği kaynaklı makrofaj sinyal iletim yolakları değerlendirildi ve doku gibi kemik iliği kaynaklı makrofajların, izole makrofajların esia coli LPS stimülasyonuna yanıt olarak fosforile P 38 alfa harita kinaz seviyelerini yukarı regüle ettiğini gösterdi.

Bu yöntem, hangi hücre içi bölme mikrosunun lokalize olduğu gibi hücresel mikrobiyoloji alanındaki temel arayışların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.