Name: Çift Renkli Zaman-kapılı Uyarılmış Emisyon tükenmesi (STED) Nanoscopy tarafından İmmünoloji Synapse görselleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-24T20:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Öğrenin çift renkli STED nanoskopi kullanarak NK hücreleri sitotoksik immün sinapsını görüntüleme yöntemini. Bu teknik sitoskeleton ve lizozom salınımı arasındaki ilişkiyi incelemek için alt-100 nm çözünürlük sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teknik yardım için Geoff Daniels'a teşekkür ederiz. Bu çalışma R01 tarafından AI067946 J.S.O. tarafından finanse edilmiştir.

1. Antikorlu Lameller
<ol>
	<li>Ön ısıtma (37 °C'de) 30 ml RPMI, %10 FCS ortamı ve 1 ml BD Cytofix/Cytoperm.</li>
	<li>Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 5 μg / ml saflaştırılmış antikor çözeltisi hazırlayın. NK92 hücre hattının aktivasyonu için anti-CD18 ve anti-NKp30 kullanılması önerilir.
	<ol>
		<li>Bir PAP kalemi kullanarak # 1.5 lamel üzerinde her koşul için yaklaşık kuruş büyüklüğünde bir daire işaretleyin. Çift renkli bir deney için dört koşul olmalıdır: lekesiz, çift lekeli ve iki tek lekeli koşul. Her bölgeye 200 μl antikor çözeltisi dağıtın ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Lamelleri, oda sıcaklığında 50 ml'lik konik bir tüpte her birini 50 ml PBS'ye hafifçe daldırarak yıkayın. Yıkama, hücrelerin eklenmesinden hemen önce yapılmalı ve lamel üzerinde antikor kurumasını önlemek için özen gösterilmelidir.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Lameller üzerindeki NK hücrelerini etkinleştirin; Düzeltin ve Geçirgen Hale Getirin
<ol>
	<li>Koşul başına 5 x 105 NK92 hücreyi izole edin. Santrifüj ve dekant süpernatan. Adım 1.1'den itibaren 10 ml önceden ısıtılmış ortamla bir kez yıkayın. Santrifüj ve dekant süpernatan.
	<ol>
		<li>Önceden ısıtılmış ortamdaki hücreleri, 2.5 x 106 / ml'lik bir konsantrasyonda adım 1.1'den itibaren yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Bölüm 1.2.1'de oluşturulan bölgenin merkezine 200 μl'yi yavaşça boşaltın. 37 ° C'de% 5 CO2'de 20 dakika inkübe edin. (Not: İlgilenilen biyolojik fonksiyona bağlı olarak bu süre uzatılabilir veya azaltılabilir. NK hücre granül polarizasyonu için 20 dakika yeterlidir).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hücrelerin inkübe edilmesinin ardından, lamelleri 50 ml'lik konik bir tüpte her birini 50 ml oda sıcaklığında PBS'ye daldırarak nazikçe yıkayın.</li>
	<li>Adım 1.1'den itibaren 1 ml önceden ısıtılmış Fix/Perm solüsyonuna 1 μl Triton X-100 ekleyin ve iyice girdaplayın. Hücrelere 200 μl Fix / Perm tamponu (adım 2.3) ekleyerek sabitleyin ve geçirgenleştirin. Karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.</li>
</ol>
3. Leke Hücreleri
<ol>
	<li>Boyama tamponu hazırlayın: Fosfat tamponlu salin (PBS),% 1 BSA,% 0.1 Saponin.
	<ol>
		<li>Primer antikor çözeltisini 200 μl boyama tamponunda hazırlayın (bkz. adım 3.1). (Not: antikor kullanımdan önce titre edilmelidir). Lameli kaplamak için kullanılan aynı türde ortaya çıkan birincil antikorun kullanılmasından kaçının (adım 1.2). Ayrıca STED görüntüleme için Strepatividin-biotin bağlantılarından kaçının.</li>
		<li>Bölüm 2.3.1'i takiben, lamelleri 50 ml boyama tamponunda nazikçe yıkayın. Fazla tamponu çıkarmak için PAP kalem bölgesinin kenarlarını pamuklu çubukla kurulayın. Bölüm 3.1.1'de oluşturulan antikor solüsyonunu uygulayın. Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. (Önerilen: nemi korumak için lamelleri nemli bir kağıt havluyla sürgülü kutuda inkübe edin).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>200 μl boyama tamponunda ikincil antikor çözeltisi hazırlayın. Önerilen floroforlar Alexa Fluor 488, Pacific Orange ve V500'dür. Genel olarak, STED görüntüleme için 1:200 seyreltme uygundur.
	<ol>
		<li>Lamelleri 50 ml boyama tamponunda nazikçe yıkayın. Fazla tamponu çıkarmak için PAP kalem bölgesinin kenarlarını pamuklu çubukla kurulayın. İkincil antikor çözeltisi uygulayın. Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>İlgilenilen ek proteinler için yıkama ve boyamayı tekrarlayın. Phalloidin ile F-aktin tespit edilirse, bu genellikle 1:200 seyreltmede ikincil antikor ile dahil edilebilir.</li>
</ol>
4. Lamelleri slaytlara monte edin
<ol>
	<li>Montaj ortamını hazırlayın. Not: Prolong veya Prolong Gold tercih edilir. STED ile uyumlu olmadığı için VECTASHIELD'den kaçınılmalıdır. Phalloidin kullanılıyorsa 2,2-tiyodioetanolden kaçınılmalıdır. Mowiol kabul edilebilir.</li>
	<li>Bir kızak üzerine yaklaşık 10-20 μl montaj ortamı yerleştirin. Lameli ters çevirin (hücre tarafı aşağı) ve lameli nazikçe monte edin, hava kabarcıklarının girmesini önlemek için dikkatli olun. Görüntülemeden önce slaytları 24 saat inkübe edin (lamel yukarı).</li>
	<li>Lamelin kenarlarını oje ile kapatın.</li>
</ol>
5. Deney Düzeneği
<ol>
	<li>Gerekli lazerleri ve yazılımı başlatın. STED tükenme lazerini %100 güçte başlatın. Ticari sistemler söz konusu olduğunda genellikle otomatik bir prosedür olan STED lazeri hizalayın.</li>
	<li>Numuneyi, tek lekeli kontrolden başlayarak, göz mercekleri kullanarak mikroskop üzerinde odaklayın.</li>
</ol>
6. Ayarların Optimizasyonu
<ol>
	<li>İlk kanalı tarayın ve lazer gücünü, uyarma ışını konumunu ve dedektör aralığını optimize edin. Mümkünse, 100 >'luk bir kazançtan kaçının. Ayarları optimize etmek için görüntüyü konfokal olarak yakalayın. Satır ve/veya kare ortalaması çözünürlüğü artıracaktır. Piksel doygunluğunu kontrol edin. Not: STED uygulaması emisyon yoğunluğunu azaltacağından konfokal olarak bir miktar doygunluk kabul edilebilir. STED için en uygun piksel boyutu 30 nm'nin altında olacaktır, ancak daha küçük piksel boyutlarıyla daha iyi çözünürlük elde edilecektir. Görüntülenmekte olan ilgilenilen bölgenin boyutu, piksel boyutunun alt sınırını belirleyecektir. Daha küçük piksel boyutları foto ağartmayı artırabilir.
	<ol>
		<li>STED tükenme ışını uygulayın ve% 50 tükenme lazer gücünden başlayarak görüntü yakalayın. Çözünürlükte bir iyileşme görülürse, daha fazla tükenme lazer gücü uygulanabilir. Bu aşamada, uyarma lazer gücünü, hat ortalamasını ve/veya kazancını ayarlamak gerekebilir.</li>
		<li>Arka planı azaltmak için zaman geçişi uygulayın (en az 0,3 nsn). Konfokal üzerinde çözünürlükte bir iyileşme görülene kadar ayarları yapın. Çözünürlük, tam genişlik yarı maksimum (FWHM) tahmin edilerek yaklaşık olarak tahmin edilebilir. Bu, ilgilenilen yapı boyunca bir çizgi profili çizilerek oluşturulan bir Gauss zirvesinin yarı maksimum yoğunluğundaki mesafeyi temsil eder ve çözünürlüğü tahmin etmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir.</li>
		<li>İlk kanal tatmin edici olduğunda, sıralı tarama için ikinci bir dizi başlatın. Genel olarak, önce daha uzun dalga boylu floroforu taramak en iyisidir. İkinci kanalda adım 6.1'i tekrarlayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Her iki tarama dizisiyle tek lekeli kontrolleri görüntüleyerek spektral örtüşme eksikliğini onaylayın. Hafif spektral örtüşme, yazılımdaki spektral karıştırma önleme özellikleri kullanılarak düzeltilebilir, ancak mümkün olan her yerde kaçınılmalıdır.</li>
</ol>
7. Görüntü Edinme
<ol>
	<li>Görüntüleri elde edin. Kantitatif görüntüleme için en az 20 görüntü/koşul elde edilmesi önerilir. Bununla birlikte, kesin sayı, örneklem büyüklüğü hesaplaması gibi istatistiksel bir yaklaşımla uyumlu olarak deneysel soruya göre tanımlanmalıdır. Denemeyi kaydet'i tıklayın.</li>
</ol>
8. Evrişim
<ol>
	<li>Dekonvolüsyon yazılımı veya toplu işlemci ile dosyayı açın. Yazılımı kullanarak her kanal için parametreleri kontrol edin. Özellikle her kanalın uyarma ve emisyon spektrumlarını, STED tükenme emisyonunu ve görüntüleme yönünü (görüntü 3 boyutluysa yukarı veya aşağı) onaylayın.</li>
	<li>Evrişim çözme sihirbazını kullanarak deconvove. Varsayılan ayarlar genellikle yeterlidir, ancak sinyal-gürültü oranı (SNTR) florofordan florofora değişir ve her kanal ve her deney için ayrı ayrı belirlenmesi gerekir.</li>
</ol>

<ol><li>Stinchcombe, J. C., Bossi, G., Booth, S., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse+of+CTL+contains+a+secretory+domain+and+membrane+bridges%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse of CTL contains a secretory domain and membrane bridges.</a> Immunity. 15 (5), 751-761 (2001).</li>
<li>Grakoui, A., Bromley, S. K., Sumen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li>
<li>Orange, J. S., Harris, K. E., Andzelm, M. M., Valter, M. M., Geha, R. S., Strominger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mature+activating+natural+killer+cell+immunologic+synapse+is+formed+in+distinct+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The mature activating natural killer cell immunologic synapse is formed in distinct stages.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (24), 14151-14156 (2003).</li>
<li>Treanor, B., Lanigan, P. M., Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microclusters+of+inhibitory+killer+immunoglobulin-like+receptor+signaling+at+natural+killer+cell+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microclusters of inhibitory killer immunoglobulin-like receptor signaling at natural killer cell immunological synapses.</a> J. Cell Biol. 174 (1), 153-161 (2006).</li>
<li>Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+signaling+blocks+activating+receptor+clustering+and+induces+cytoskeletal+retraction+in+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells.</a> J. Cell Biol. 192 (4), 675-690 (2011).</li>
<li>Beemiller, P., Jacobelli, J., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+the+movement+of+signaling+microclusters+with+cellular+motility+in+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Integration of the movement of signaling microclusters with cellular motility in immunological synapses.</a> Nat. Immunol. 13 (8), 787-795 (2012).</li>
<li>Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+agonist+MHC-peptide+complex-dependent+T+cell+receptor+microclusters+as+scaffolds+for+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling.</a> J. Exp. Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).</li>
<li>Mossman, K. D., Campi, G., Groves, J. T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+TCR+signaling+from+geometrically+repatterned+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Altered TCR signaling from geometrically repatterned immunological synapses.</a> Science. 310 (5751), 1191-1193 (2005).</li>
<li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor-proximal+signals+are+sustained+in+peripheral+microclusters+and+terminated+in+the+central+supramolecular+activation+cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster.</a> Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).</li>
<li>Yokosuka, T., Sakata-Sogawa, K., Kobayashi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat. Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li>
<li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+wave+of+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A new wave of cellular imaging.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 285-314 (2010).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J. Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).</li>
<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+views+of+the+human+NK+cell+immunological+synapse%3A+recent+advances+enabled+by+super-+and+high-resolution+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques.</a> Front. Immunol. 3, 421 (2012).</li>
<li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission%3A+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 19 (11), 780-782 (1994).</li>
<li>Klar, T. A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+resolution+in+far-field+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 24 (14), 954-956 (1999).</li>
<li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li>
<li>Rankin, B. R., Moneron, G., Wurm, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscopy+in+a+living+multicellular+organism+expressing+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Nanoscopy in a living multicellular organism expressing GFP.</a> Biophys. J. 100 (12), 63-65 (2011).</li>
<li>Willig, K. I., Kellner, R. R., Medda, R., Hein, B., Jakobs, S., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+resolution+in+GFP-based+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale resolution in GFP-based microscopy.</a> Nat. Methods. 3 (9), 721-723 (2006).</li>
<li>Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), (2011).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+channel+STED+nanoscopy+of+lytic+granules+on+actin+filaments+in+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells.</a> Commun. Integr. Biol. 5 (2), 184-186 (2012).</li>
<li>Singh, H., Lu, R., Rodriguez, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+quantification+of+cardiac+mitochondrial+protein+clusters+with+STED+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Visualization and quantification of cardiac mitochondrial protein clusters with STED microscopy.</a> Mitochondrion. 12 (2), 230-236 (2012).</li>
<li>Tonnesen, J., Nagerl UV, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+imaging+for+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Superresolution imaging for neuroscience.</a> Exp. Neurol. 242, 33-40 (2013).</li>
<li>Kempf, C., Staudt, T., Bingen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+multicolor+STED+nanoscopy+of+presynaptic+proteins+in+the+calyx+of+held%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tissue multicolor STED nanoscopy of presynaptic proteins in the calyx of held.</a> PLoS One. 8 (4), (2013).</li>
<li>Jans, D. C., Wurm, C. A., Riedel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+super-resolution+microscopy+reveals+an+array+of+MINOS+clusters+along+human+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">STED super-resolution microscopy reveals an array of MINOS clusters along human mitochondria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (22), 8936-8941 (2013).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Gustafsson, M. G., Shao, L., Carlton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination).</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li>
<li>Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li>
<li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 13 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Cdc42-interacting protein-4 functionally links actin and microtubule networks at the cytolytic NK cell immunological. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22J.+Exp.+Med%22">J. Exp. Med</a>. Banerjee, P. P., Pandey, R., Zheng, R., Suhoski,, Monaco-Shawver, L., Orange, J. S. 204 (10), 2305-2320 (2007).</li>
<li>Vicidomini, G., Moneron, G., Han, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sharper+low-power+STED+nanoscopy+by+time+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sharper low-power STED nanoscopy by time gating.</a> Nat. Methods. 8 (7), 571-573 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler. Bu makalenin kısmi yayın maliyeti Leica Microsystems, Inc. tarafından karşılanmıştır.

Konfokal üzerinde çözünürlükteki iyileşme, bir şekilde kontrol edilemeyen faktörlere bağlı olacaktır. Bu faktörler arasında lamel kalınlığındaki küçük sapmalar ve montaj ortamındaki tutarsızlıklar yer alır. Görüntüleme odasındaki sıcaklık ve nemin mümkün olduğunca tutarlı tutulması önemlidir ve STED ışını yaklaşık her 60 dakikada bir yeniden hizalanmalıdır. Prosedürlerde belirtildiği gibi, STED ile uyumlu olmadığı için VECTASHIELD montaj ortamının kullanımından kaçınılmalıdır. Buna ek olarak, her zaman #1.5 lameller kullanılmalı ve varsa belirli bir kalınlığa göre doğrulanmış olanlar kullanılmalıdır.
Burada açıklanan yaklaşımın bir modifikasyonu, STED ışınından daha uzun bir dalga boyunda yayılan floroforlar kullanarak ek kanalları konfokalde görüntülemektir. Bu şekilde, dört kanala kadar (ikisi konfokalde, ikisi STED'de) görüntülenebilir. Bununla birlikte, bu yaklaşımı benimserseniz, STED ışınının uygulanması bu kanallardaki fotonları tüketeceğinden, önce STED tükenme lazerinin üzerinde yayılan floroforlara sahip kanalların görüntülenmesi gerekecektir. Bu tekniğin bir avantaji, kisa ömürleri34 olan fotonlardan emisyonu ortadan kaldirarak konfokalde çözünürlüğü artiracak olan zaman geçitlemesinin uygulanmasidir. Özellikle, emisyon dedektörlerinin darbeli uyarma STED'ine karşılık gelecek zamanlaması olan zaman geçidinin kullanılması, yakın görüntüleme sırasında lamel camından yansımadan kaynaklanan arka plan floresansını azaltacaktır. STED için uygun olmayan bir deneyde bile, darbeli bir uyarma kaynağı kullanılıyorsa, zaman geçitleme, konfokalde çözünürlüğü iyileştirmek için yararlı bir araç olabilir.
STED'de çözünürlüğü artırmak için kullanılabilecek çeşitli değişiklikler vardır. Birincisi, iğne deliğinin boyutunu standart 1 Airy ünitesinden azaltmaktır, ancak bu aynı zamanda numuneye ulaşan ışık miktarını da azaltacaktır. Bu, lazer gücünü veya kazancını artırarak telafi edilebilir. Bir diğeri, her foton için toplanan bilgi miktarını artıracak ve çözünürlüğü iyileştirecek olan çizgi ortalamasını artırmaktır. Ancak yine de bu, numunenin ışıkla ağartılması pahasına olabilir, bu nedenle çözünürlük ve ağartma arasında bir denge kurulması gerekecektir. Benzer şekilde, GFP gibi floresan proteinlerin kullanımı, ağartmayı önlemek için dikkatli bir optimizasyon gerektirecektir. Bu, gerekirse STED lazer gücünü azaltarak gerçekleştirilebilir. Daha uzun zaman noktaları ayrıca daha fazla foton geri kazanımına izin verecek ve ağartmayı azaltacaktır. Canlı STED analiz edilirken ışıkla ağartma düzeltmesi hesaba katılmalıdır.
Elbette STED'de 3 boyutlu görüntüleme de mümkündür ve geleneksel konfokal görüntülemeye göre bir gelişme sağlayacaktır. Bu, özellikle ters evrişim ile birlikte yapılırsa doğrudur, ancak z ekseninde birden fazla düzlemin görüntülenmesi sırasında meydana gelen kaymayı düzeltmek için özen gösterilmelidir. Ayrıştırmak için Huygens yazılımı kullanılıyorsa, bu düzeltme "görüntüyü sabitle" özelliği kullanılarak elde edilir. Bu yaklaşımı kullanarak, z eksenindeki çözünürlük iyileştirilecektir. Bu, zayıf eksenel çözünürlüğe sahip geleneksel konfokal görüntülemeye ve hatta nispeten zayıf z ekseni çözünürlüğüne sahip olan STED'in kendisine göre büyük bir gelişmedir. STED'de birden fazla yığın elde edilirken, numunenin ağartılmasını önlemek için özen gösterilmelidir ve gerekirse bunu yapmak için çizgi ortalaması veya lazer gücü yoğunluğu azaltılabilir. Yine, STED için uygun olmayan diğer floroforların görüntülenmesi durumunda, ilk ardışık taramada tükenme ışınının uygulanmasının bu kanallardan emisyonu önleyeceği unutulmamalıdır. Bu nedenle, karışık bir STED/konfokal yaklaşım (592 nm'den daha büyük bir dalga boyunda yayılan kanallarda konfokal tarama kullanıldığında) ne yazık ki 3D için uygun olmayacaktır.
Özetlemek gerekirse, standart konfokal görüntülemeye göre göreceli uygulama kolaylığı ve çözünürlükteki iyileşme nedeniyle STED'i bir yaklaşım olarak seçtik. İmmün sinapsı görüntülemek için, 200 nm'nin üzerindeki çözünürlükte mümkün olmayan F-aktin mimarisindeki ayrıntıları görmemizi sağlayan etkili ve değerli bir teknik olduğu kanıtlanmıştır. Bu ayrıntıların çoğu ince görünse de, NK hücre fonksiyonu üzerinde derin bir etkiye sahip olabilirler. Bu nedenle, insan sağlığını korumak için kritik olan bilgileri elde etmek için en son nanoskopik görüntüleme teknolojisini uyguluyoruz.

Immünolojik sinaps proteinleri ve hücre iskeleti elemanları sinyalizasyon karmaşık bir ortam olduğunu. Sitolitik sinaps aslında merkezi bir salgı etki 1-4 çevreleyen aktin ve yapışma moleküllerinin bir halka ile yapı gibi bir &quot;boğa gözü&quot; sahip olarak nitelendirildi. Ancak, şimdi bu fonksiyonu 5-11 sürekli dinamik sitoskeletal örgütlenmesini gerektirir aktif sinyalizasyon mikroskobik etki oluştuğunu biliyoruz. Sinaps hakkında şu anda sahip bilgilerin çoğu mikroskop elde edilmiştir, ve immunolojistlerden üstün görüntüleme teknolojisi erken benimseyenler olmuştur. Böyle bir yeni teknoloji süper-çözünürlük mikroskopisidir. Geleneksel uzamsal ışık mikroskobu, yaklaşık 200 nm &#39;de dahil olmak üzere tüm konfokal floresan mikroskobu için çözünürlük alt sınırı, setleri ışık kırılma bariyer ile sınırlıdır. Son yıllarda, çeşitli teknikler geliştirmek olmuşturçözünürlüğü kırınım bariyerin altında izin d. Bu uyarım emisyon tükenmesi mikroskobu (STED&#39;in), yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM), davranışsal çözüldü mikroskobu (FIRTINA) ve fotoaktıfleştırılebılır ışık mikroskobu (PALM) içerir. Bu teknikler yerlerinde detaylı olarak 12-15 gözden geçirilmiş, ancak aşağıda özetlenmiştir. Subdiffraction sınırlı çözünürlük her sistemde benzersiz şekilde oluşturulur. Süper çözünürlük tekniğinin seçimi, bu nedenle, ilgi konusu deney ve deneysel sistem tarafından dikte edilmelidir. STED süper çözünürlük subdiffraction sınırlı floresan mikroskobu 16-18 sonuçlanan uyarma sonrasında her bir ilgi florofor çevresinde seçici &quot;sessizliği&quot; floresan yüksek yoğunluklu torroidal tükenmesi ışını kullanılarak elde edilir. STED&#39;in bir avantajı görüntü elde etme, hızlı ve nispeten küçük bir post-processing gerektirir. Boya seçimi spec tarafından belirlenir daTicari olarak temin edilebilen sistemde 592 nm &#39;de yer almaktadır tükenmesi huzmesinin tral konumu, bir çok piyasada mevcut boyalar, iki florofor kombinasyonlar mümkün kılan mevcuttur. Buna ek olarak, GFP gibi yaygın olarak kullanılan floresan haberci 19,20 canlı hücre deneyleri mümkün hale görüntülenebilir. Daha önce degranülasyon 21,22 için NK hücreleri tarafından kullanılmaktadır F-aktin hipodansitedir bölgelerini belirlemek ve ölçmek için STED&#39;i kullandık. Biz STED&#39;in nedeniyle floroforlar ve xy ekseninde çözünürlükte üstün iyileşme nispeten esnek durumuna bağışıklık sinaps görüntüleme için iyi bir seçim olduğunu düşünmekteyiz. Buna ek olarak, bu deney için kullanılan, ticari olarak temin STED&#39;in sisteminde, yüksek hızlı (12,000 Hz) rezonans tarayıcının kullanılması örnekler en az hasar ile, görüntülerin elde edilmesi için hızlı sağlar. Boya seçimi sınırlı esneklik, STED&#39;in 12 bir dezavantaj olarak kabul edilirAncak çift renkli STED&#39;in piyasada bulunan çeşitli floroforlar nispeten basittir. STED iki kanal ile sınırlı iken, ek yapılar, yaklaşık 200 nm (E. Mace, yayınlanmamış gözlemler çözünürlükte konfokal görüntülü böylece bir lazer konfokal tarama mikroskobu ile STED&#39;in entegrasyonu da STED&#39;in ile kombinasyon halinde ilave confocal görüntüleme sağlar: .) Biz bağışıklık hücrelerini görüntülenmesi için STED&#39;in kullanımını tarif ederken, bu teknoloji, sinir hücreleri dahil olmak üzere hücre tipleri, çeşitli hücre ve yapıların çeşitli 23-26 görselleştirme için uygulanır. SIM subdiffraction sınırlı görüntüler oluşturmak için farklı bir yaklaşım kullanır. Bilinen periyodik uyarım desen ile görselleştirme, bilgi daha sonra, aşağıdaki matematiksel dönüşüm 27 çalışılmaktadır bilinmeyen yapısı elde edilebilir. Bu ~ 100 nm yanal 28,29 çözünürlüğe bir artış verir. SIM avantajı, bu is tüm standart konfokal boyalar ve probları ile uyumlu, ancak dezavantajı görüntüleri elde etmek için çok daha yavaş olduğunu ve bu uzun post-processing 12 ihtiyaç olmasıdır. Bu, aynı zamanda canlı hücre görüntüleme için kullanılmasını sınırlamaktadır. Son olarak, süper çözünürlüklü görüntüler Flüoroforlann stokastik foto-anahtarlama tarafından oluşturulmuş olabilir. Bu yaklaşım, fotoğraf aktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) ve stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (FIRTINA) istismar edilmektedir. Birden fazla kamera kare tarama ve zamanla ve &quot;kapalı&quot;, &quot;açık&quot; rastgele aktif molekülleri lokalize ederek, 20-30 nm çözünürlükte görüntüler birikmiş çerçeveleri 30-32 üretilir. Bu çözünürlük için trade-off görüntüleri elde etmek için gerekli zamanı. Burada ayrıntılı olarak göstermek, hazırlama ve STED&#39;in çift renk örnekleri görüntüleme için protokol. Bu sistemde, atımlı bir uyarım, ayarlanabilir, beyaz ışık lazer ile. Doğası gereğidarbeli uyarma demetinin, algılama süresi yolluk mümkün kılan ve daha fazla artış çözünürlük edilir. Buna ek olarak, sistem, bu şekilde daha düşük bir lazer güç gereksinimleri için izin gadolinyum hibrid geleneksel foto-çoğaltıcı tüpler daha duyarlıdır (hyd) dedektörleri ile donatılmıştır. STED&#39;in için tükenmesi ışın sürekli olarak tatbik edilir ve iki renk STED&#39;in için mevcut boyaların seçimi dikte edecek 592 nm, ayarlanmıştır. Yaygın olarak kullanılan boya kombinasyonları genellikle (örneğin Alexa Fluor 488, Oregon Yeşil, yeşil DyLights veya Chromeo 488 gibi) 488 nm ile heyecanlı bir ve (örneğin Pasifik Turuncu veya Horizon V500 gibi) 458 nm ile heyecanlanan birini içerir. İki boyaların algılama benzer bir aralık içinde olacaktır (ve her ikisi de tükenme lazer tarafından erişilebilir) iken Böylece, farklı dalga boylarında uyarım ile ortaya çıkar. Bir ayarlanabilir beyaz ışık lazer ve ayarlanabilir dedektörleri ile, spektral örtüşme yok ederken sinyali maksimize oldukça kolay yapılır. Gibi, biz combinat ile iyi bir başarı olduBu tür Pacific Orange (burada kullanılan) Alexa Fluor 488 olarak ticari olarak temin edilebilen boya iyonları. Bizim protokol yönelik hazırlanmıştır ve bu bizim laboratuvar tarihsel odak temsil eder gibi insan NK hücrelerinin değerlendirilmesini açıklar. Biz düzenli olarak deneysel çalışmalar 21,33 olarak uygulamış biri olarak biz özellikle bu örnekte NK92 hücre hattını kullanıyor.

<table><tbody><tr><td># 1.5 kapak fişleri</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix / Cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Pamuk uçlu aplikatör</td><td>Fisher Scientific</td><td>S450941</td><td></td></tr><tr><td>Falcon santrifüj tüpleri (50 ml)</td><td>VWR</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu (FCS) (500 ml)</td><td>Atlantik Biyoloji</td><td>S11050</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan Pasifik Turuncu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>P31584</td><td></td></tr><tr><td>Laboratuvar doku silecekleri</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>Oje</td><td>VWR</td><td>100491-940</td><td></td></tr><tr><td>NK-92 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-2407</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin Alexa Fluor 488</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu</td><td>su Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Prolong anti-solma reaktifi</td><td>Life Technologies</td><td>P7481</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış anti-CD18</td><td>Biolegend</td><td>301202</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış anti-NKp30</td><td>Biolegend</td><td>325202</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış anti-perforin</td><td>Biolegend</td><td>308102</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 ortamı ( 500 ml)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Quillaja kabuğundan saponin</td><td>Sigma</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>Süper PAP kalemi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>008899</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>22142</td><td></td></tr><tr><td>Huygens evrişim çözme yazılımı</td><td>SVI</td><td>İletişim şirketi</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS STED mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>iletişim şirketi</td><td></td></tr></tbody></table>

Çift renkli zaman-kapılı uyarılmış emisyon tükenmesi (sted) nanoscopy tarafından İmmünoloji synapse görselleştirme

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Doğal katil hücreler veya viral yönden enfekte tümörijenik hücrelerin lize etmek için sıkı bir şekilde düzenlenmiştir, ince ayarlı bir immünolojik sinaps (IS) oluşturur. Dinamik aktin tadilatı NK hücrelerin fonksiyonu ve IS oluşumu için çok önemlidir. Sinaps F-aktin Görüntüleme geleneksel ancak ışık kırılma sınır yaklaşık 200 nm, konfokal de dahil olmak üzere, flüoresan mikroskopi çözünürlüğünü sınırlandırır, konfokal mikroskopi kullanmıştır. Görüntüleme teknolojisindeki son gelişmeler subdiffraction sınırlı süper çözünürlük görüntüleme gelişmesini sağlamıştır. IS F-aktin mimarisi görselleştirmek için cam üzerinde reseptörü aktive NK hücreleri kalarak NK hücre sitotoksik sinaps özetlemek. Biz daha sonra iki-renkli uyarılmış emisyon tükenmesi mikroskobu (STED&#39;in) kullanarak ilgi görüntü proteinleri. Bu, sinaps &lt;80 nm çözünürlükte sonuçlanır. Bu yazıda numune hazırlama ve çift col kullanarak görüntüleri edinimi adımları açıklarveya NK F-aktin görselleştirmek STED&#39;in nanoscopy IS. Biz de Leica SP8 yazılım ve zaman-kapılı STED&#39;in kullanarak örnek edinme optimizasyonu göstermektedir. Son olarak, görüntülerin post-processing deconvolution için Huygens yazılımı kullanmak.

Açıkça görülmektedir ki, süper-çözünürlüklü görüntülemenin temel hedefi konvansiyonel konfokal mikroskobinin ötesinde bir iyileştirme sağlamaktır. Ancak, suboptimal çözünürlüğe yol açabilecek bazı yaygın hatalar mevcuttur. Bunlar, her deneyin ayrı ayrı optimize edilmesini gerektirir. Temsili deneyimizde, cama bağlı antikor tarafından aktive edilmiş bir NK hücresindeki F-aktin ağını görüntülüyoruz. STED'in konfokale göre çözünürlük artışı sağlamamasının yaygın nedenleri (ve bunlara yönelik düzeltmeler) şunlardır:
<ol>
	<li>Yetersiz örnekleme (Şekil 1a). Bu durum, F-aktin filamentlerinin düşük çözünürlüğü ile gösterildiği gibi, grenleşmeye ve piksel kaybına yol açabilir. Hat veya kare ortalamasının artırılması genellikle bunu düzeltebilir.</li>
	<li>Ağarma ve/veya aşırı örnekleme (Şekil 1b). Bu durum, aşırı hat ortalaması sonucunda oluşan uzun piksel bekleme süresinden kaynaklanabilir. Alternatif olarak, boşaltma lazerinin aşırı kullanımı da dahil olmak üzere, görüntü alımı öncesinde görüntünün aşırı taranmasının bir sonucu olabilir. Bu durum genellikle puslu veya bulanık görüntülerle sonuçlanır. Bu sorun, görüntü alımı öncesinde ilgi alanının yalnızca minimum düzeyde taranarak veya mümkünse lazer tarama hızı artırılarak düzeltilebilir. Sorun devam ederse, boşaltma lazeri gücü düşürülebilir.</li>
</ol>
Piksel kalış süresi, eksitasyon lazer gücü ve deplesyon lazer gücü arasında doğru denge sağlanarak, geliştirilmiş çözünürlüğe ve yeterli bilgiye sahip bir görüntü oluşturulabilir (Şekil 1c). Çözünürlük, dekonvolüsyon kullanımıyla daha da artırılabilir (Şekil 1d). Görüntüleme optimize edildiğinde, dekonvolüsyon çözünürlüğü hem kalitatif hem de kantitatif olarak iyileştirecek ve 100 nm altı çözünürlük rutin olarak elde edilebilecektir.
<img alt="Dekonvolüsyon aracılığıyla hücresel yapı iyileştirmesini gösteren floresan mikroskopi görüntüleri." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 1"> 
Şekil 1. STED görüntülemede veri toplama optimizasyonu ve yaygın hatalar. NK92 hücreleri anti-CD18 ve -NKp30 kaplı cam üzerinde 20 dk boyunca aktive edilmiş, ardından fikse edilmiş, permeabilize edilmiş ve Phalloidin Alexa Fluor 488 ile F-aktin için boyanmıştır. a) Yetersiz örnekleme nedeniyle görüntü bilgisi kaybına bir örnek. b) Ağarma/aşırı örnekleme nedeniyle çözünürlük kaybına bir örnek c) optimize edilmiş koşullar d) optimize edilmiş koşullar, dekonvolüsyon ile çözünürlükte daha fazla iyileşme sağlar. Ölçek çubuğu = 5 μm.

Burada, cam üzerinde özetlenen NK hücrelerinin sitotoksik immün sinapsı olan iki renkli STED nanoskobu ile görüntüleme protokolünü gösteriyoruz. Bu yöntemi kullanarak, sinaps proteinlerinin ve hücre iskeletinin 100 nm altında çözünürlüğünü elde ediyoruz.

Çift Renkli Zaman-kapılı Uyarılmış Emisyon tükenmesi (STED) Nanoscopy tarafından İmmünoloji Synapse görselleştirme

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Bu prosedürün genel amacı, TED mikroskobu kullanarak NK hücre litik sinapsındaki F aktin gibi yapıları görselleştirmektir. Bu, öncelikle aktive edici antikor kullanarak sinapsın cam üzerinde yeniden oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, hücrelerin fikse edilmesi, permeabilize edilmesi ve ilgilenilen yapılar için boyanmasıdır.Ardından, lamlar lazer taramalı konfokal mikroskopi ile görüntülenir ve ardından görüntü çözünürlüğünü artırmak için stead tüketimi uygulanır. Son adım, görüntülerin bir dekonvolüsyon algoritması kullanılarak işlenmesidir. Sonuç olarak, çift renkli stead ve endoskopi sayesinde hücresel yapıların 100 nanometrenin altında çözünürlükte gösterilebildiği görülür.Bu yöntem, hücre iskeleti ile ekzositoz arasındaki ilişki gibi hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bizim çalışmamızda, doğal öldürücü hücreler tarafından litik granüller olarak adlandırılan özelleşmiş lizozomların sekresyonu ile ilgileniyoruz. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, TED tüketim lazerinin uygulanmasında ayarlanabilecek birden fazla değişken bulunduğu için zorluk yaşayacaklardır.Tüketim ışınının uygunsuz uygulanması, çözünürlükte iyileşme yerine kötüleşmeye yol açacaktır. Hazırlık aşamasında, 30 mililitre %10 FCS içeren RPMI medyumu ve ayrı olarak bir mililitre BD CY effects cyop perm'i 37 derece Celsius'ye kadar ısıtın. Ardından, lamellerin antikorlarla kaplanması işlemine başlayın.1,5 numaralı lamelleri alın ve bir PAP kalem kullanarak lameller üzerine madeni para büyüklüğünde kareler çizin. Test edilen her koşul için bir kare hazırlayın.Her bir daireye, PBS içinde 5 µg/mL konsantrasyondaki antikorlardan 200 µL yükleyin. NK 92 hücre aktivasyonu için anti CD 18 ve anti NK P 30 antikorlarını kullanın. Yüklenmiş lamel ve camlarını 37 °C'de yarım saat inkübe edin ve ardından oda sıcaklığındaki PBS'e daldırarak yıkayın; ardından derhal hücre ekleme işlemine geçin, test edilen her koşul için 500.000 hücre kullanıma hazır olmalıdır.Hücreleri 10 mililitre önceden ısıtılmış besiyerinde yıkayın ve ardından aynı ısıtılmış besiyerinde yeniden süspanse edin. Hücreler tamamen süspansiyonda olduğunda ve mililitre başına 2,5 milyon hücre konsantrasyonuna ulaşıldığında, lamel üzerindeki her bir antikor karesine 200 mikrolitre dekante edin; hücreli lamelleri 37 °C ve %5 CO2 içeren inkübatörde inkübe edin. Bu durumda, NK hücrelerindeki granüllerin polarize olması için 20 dakika yeterli süredir. İnkübasyon sonrası, lamelleri oda sıcaklığında PBS ile nazikçe yıkayın.1 mL ılık BD CY effects cyto perm solüsyonuna 1 µL TRITTON X 100 ekleyerek başlayın. Ardından vortekste karıştırın. Bu solüsyondan 200 µL'yi lamellelerin üzerindeki her bir koşul karesine uygulayın.Ardından hücreleri oda sıcaklığında karanlığa yerleştirin ve 10 dakika bekleyin. İnkübasyon tamamlandığında, lamelleri boyama tamponu ile nazikçe yıkayın. Daha sonra, çevrelenmiş bölgelerin kenarlarını bir pamuklu çubukla kurulayın.Ardından, çevrelenmiş bölgelere boyama tamponu içindeki birincil antikordan 200 µL ekleyin ve lamelin yarım saat boyunca karanlıkta inkübe edilmesini sağlayın. Steady görüntüleme için uygun bazı ikincil antikörler arasında Alexa Fluor 488, Pacific Orange ve Horizon V500 yer alır. Bunların her biri 1:200 dilüsyonunda iyi sonuç verir.İnkübasyon yıkamasının ardından, lamel camları boyama tamponuyla yıkayın ve kurulayın. Daha önce olduğu gibi, her bir koşul karesine 200 µL sekonder antikor uygulayın. Ardından örnekleri karanlıkta 30 dakika daha bekletin.Bu aşamada, ek yıkama işlemlerinden sonra ilave antikorlar eklemek mümkündür. Örneğin, f actin tespit etmek için Phin 1:200 oranında uygulanabilir. Kapatma ortamı olarak, stead ile uyumlu olmayan vector shield yerine prolong tercih edin.Phin boyama kullanılıyorsa, 2-merkaptoetanol kullanımından kaçının; ancak şu an için 10 ila 20 µL kapatma medyumu bir lamın üzerine uygulamanız uygundur. Lam camını ters çevirerek, hava kabarcığı oluşmasını önleyerek yavaşça medyumun içine indirin. Ardından lamı 24 saat boyunca inkübe edin.Lam camını kapatın, ertesi gün lam camını oje ile sabitleyin ve görüntülemeye geçin. Lazerleri ve yazılımı başlatın. STED tükenme lazeri %100 güçte ısınmalı ve hizalanmalıdır.Okülerle numuneye odaklanın, ardından yazılıma geçin. En uzun dalga boyuna sahip olan ilk kanalı tarayın. Dördüncü aşamada, lazer gücünü, eksitasyon ışını konumunu ve detektör aralığını optimize edin.100'ün üzerine çıkmaktan kaçının. Ardından, bir konfokal görüntü alın ve pikselleri kontrol edin. Doygunluk, hat ve çerçeve ortalaması almak piksel çözünürlüğünü artıracaktır.Hedef, piksel başına 30 nanometrenin altında olmaktır. Stead için bir miktar doygunluk kabul edilebilir. Ardından, %50 güçte stead tükenme ışınını uygulayın ve bir görüntü yakalayın.Çözünürlük iyileşirse, daha fazla güç uygulanabilir. Ayrıca, uyarım lazer gücünün, hat ortalamasının veya kazancın ayarlanması da çözünürlüğü artırabilir. Arka planı azaltmak için 0,3 nanosaniye zaman kapılaması (time gating) uygulayın ve değeri yukarı doğru ayarlayın.Yeni çözünürlük, tam yarı maksimum genişlik (FWHM) hesaplaması kullanılarak tahmin edilmelidir. Sonuçlar tatmin edici olduğunda, tüm kanallar ayarlandığında bu adımları ikinci kanal için tekrarlayın. Tüm tarama dizileriyle tekli boyama kontrollerini görüntüleyerek spektral örtüşme olup olmadığını kontrol edin.Hafif örtüşmeler yazılım aracılığıyla spektral ayrıştırma (unmixing) ile düzeltilebilir, ancak bundan kaçınmak veya örtüşmeyi minimumda tutmak en iyisidir. Şimdi, kantitatif görüntüleme için görüntüler edinin. Deneysel koşullara göre her koşul için en az 20 görüntü elde edin.Kaydedilen görüntüleri çözmek için dosyaları uygun yazılımda açın. Her kanalın parametrelerini, özellikle eksitasyon ve emisyon spektrumlarını, sabit boşaltma emisyonunu ve görüntüleme yönünü kontrol edin. Ardından yazılımındekonvolüsyon hesaplamalarını uygulayın.Varsayılan ayarlar genellikle yeterlidir, ancak sinyal-gürültü oranı taban kuvveti arasında farklılık göstereceğinden, bu parametrenin deney için manuel olarak ayarlanması gerekir. Stead ile suboptimal çözünürlüğe yol açabilecek birkaç yaygın hata vardır. Bunlardan biri yetersiz örneklemedir.Bu durum, buradaki f aktin filamentlerinde olduğu gibi, grenleşmeye ve piksel bilgisi kaybına yol açar. Çizgi veya kare ortalamasını artırmak genellikle bu sorunu giderir. Bir diğer sorun ise uzun piksel süresinden kaynaklanan solma veya aşırı örneklemedir.Görüntüleme öncesinde tarama sırasında yapılan aşırı hat ortalamasından kaynaklanan bekleme süresi de sorunun nedeni olabilir; bu durum, görüntüler alınmadan önce daha küçük bir tarama yapılarak veya daha yüksek bir tarama hızı kullanılarak düzeltilebilir. Lazer gücünün azaltılması da her şeyin düzgün çalışmasına yardımcı olabilir. Görüntü kalitesi önemli ölçüde artacaktır.Dekonvolüsyon, görüntüyü hem niceliksel hem de niteliksel olarak daha da iyileştirecektir. Bu prosedür uygulanırken rutin olarak 100 nanometre altı çözünürlük elde edilmelidir.Her deneyden önce ve ardından yaklaşık her saatte bir, bu prosedürü takip ederek sabit ışın hizalaması yapmanın önemli olduğunu unutmayın. Kolokalizasyon, hücre altı lokalizasyon ve moleküler etkileşimlerle ilgili ek soruları yanıtlamak için kantitatif analiz gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

visualization-immunological-synapse-dual-color-time-gated-stimulated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Neisseria meningitidis (Nm), gram negatif bir insana özgü solunum patojen, insan α-aktinin bağlayabilirsiniz . Burada insan beyninin mikrovasküler endotel hücreleri (HBMECs) içine bakteriyel girmesinden sonra intraselüler α-aktinin bakterinin colocalisation görselleştirilmesi için bir protokol mevcut.

Görselleştirme ve Miktar hücre içi Etkileşimleri Neisseria meningitidis</emKonfokal Görüntüleme α-aktinin> ve İnsan

Bu protokol, ayrışmış nöronal kültür ve immünsitokimya kullanarak beyin bölümlerinde de sinaps sayısını ölçmek için nasıl ayrıntıları. Kompartman-spesifik antikorların kullanarak, presinaptik terminalleri yanı sıra postsinaptik uzmanlık siteleri etiket. Biz bu belirteçler tarafından oluşturulan sinyaller arasındaki sinaps ko noktaları olarak tanımlar.

Sinapslar miktarının: Synapse Numarası ölçmek için bir İmmünositokimya tabanlı Testi

Bu video, desteklenen bir lipid çift tabakası (SLB) üzerinde doğal öldürücü (NK) hücrelerde immünolojik sinaps oluşumunu görselleştirmek için bir tekniği göstermektedir. SLB ilk olarak florofor etiketli bir NK hücre aktive edici reseptör ligandı ile etiketlenir, ardından NK hücreleri ile inkübasyon yapılır. Daha sonra, hücreler polimerize aktin ve perforin pozitif litik granüller için boyanır. Bu yaklaşım, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu kullanılarak sinaps oluşumunun...

Desteklenen Bir Lipid Çift Tabakası Üzerinde NK Hücre İmmünolojik Sinaps Oluşumunun Süper Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Bu video, T lenfositleri ile floresan antijenleri taşıyan epitel hücreleri arasındaki etkileşimleri araştıran immünolojik sinaps topolojisinin canlı hücre görüntülemesini göstermektedir. Floresan mikroskobu, endotel hücrelerinde kırmızı sitoplazma yer değiştirmesini ve sarı zar halkalarını ortaya çıkarır ve bu da immünolojik sinapsların oluşumunu gösterir.

Canlı Hücre Görüntüleme ile İmmünolojik Sinaps Topolojisinin Değerlendirilmesi

Dört boyutlu (4D) görüntüleme omurgalı sinir terminalleri canlı endozomlar iki tip arasındaki davranış ve etkileşimleri incelemek için kullanılmaktadır. Bu küçük yapıların hareketi gibi endozom füzyon ve ekzositoz gibi olayların onay izin, üç boyutlu olarak karakterize edilir.

Dört boyutlu Floresans Görüntüleme ile Sinir Terminalleri Yaşayan endozom Dinamiği Görselleştirme

Burada, immünolojik sinapslar oluşturmak için cam destekli lipid çift katmanlı tekniğin, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobunun süper çözünürlüklü görüntüleme tekniği ile bir kombinasyonunu açıklıyoruz. Bu protokolün amacı, kullanıcılara bu iki tekniği başarılı bir şekilde uygulamak için gerekli talimatları sağlamaktır.

Bir Cam destekli Planar çift katlı lipid Doğal Öldürücü Hücre İmmünoloji Synapse Süper çözünürlüklü Görüntüleme

Adaptif bağışıklık, T hücreleri ile antijen sunan hücreler arasında oluşan dinamik 'immünolojik sinapslar' tarafından kontrol edilir. Bu protokol, endotel hücrelerinin hem az çalışılmış fizyolojik APC'ler hem de yeni bir 'düzlemsel hücresel APC modeli' türü olarak araştırılması için yöntemleri tanımlar.

Görüntüleme İmmünoloji Synapse Dynamics için bir Endotel Hücre Modeli Düzlemsel

Biz coverslips karşı antikorlar için B-hücre reseptör, ilk aşama için bir model ile kaplı üzerinde yayılmış B hücreleri aynı anda görüntü aktin yapıları, mikrotübüller ve Mikrotubul artı uç proteinler STED mikroskobu kullanılarak bir protokol mevcut bağışıklık synapse oluşumu.

Aktin ve Mikrotubul Cytoskeletons uyarılmış emisyonu tükenmesi (STED) mikroskopi kullanarak B-hücre bağışıklık sinaps, görselleştirme

Bu metodoloji genel amacı en iyi deneysel koşullar numune hazırlama resim alma ve yeniden yapılanma için 2D çift renk dSTORM görüntülerini mikrotübüller ve ara filamentler sabit hücrelerde gerçekleştirmek için...

Ara filamentler ve mikrotübüller 2 boyutlu doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu ile görüntüleme

Bu protokol hem immünolojik sinaps oluşumunu hem de sonraki polarize salgı trafiğini immünolojik sinapsa doğru görüntüler. Hücresel konjugates bir süperantijen-darbeli Raji hücre (bir antijen sunan hücre olarak hareket) ve Jurkat klonu (bir efektör yardımcı T lenfosit olarak hareket) arasında kuruldu.

İnsan İmmünolojik Sinaps Görüntüleme

Bu protokol, SMA ve ColQ ile ilişkili CMS'nin fare modellerindeki patolojik değişiklikleri ölçmek için kullanılan kombine konfokal ve STED mikroskopisi ile nöromüsküler kavşakların morfometrik analizi için bir yöntemi açıklamaktadır.

Farelerde Nöromüsküler Kavşakların Kombine Konfokal ve Süper Redüksiyonlu Mikroskopi ile Karakterizasyonu

Öğrenin çift renkli STED nanoskopi kullanarak NK hücreleri sitotoksik immün sinapsını görüntüleme yöntemini. Bu teknik sitoskeleton ve lizozom salınımı arasındaki ilişkiyi incelemek için alt-100 nm çözünürlük sağlar.

Çift Renkli Zaman-kapılı Uyarılmış Emisyon tükenmesi (STED) Nanoscopy tarafından İmmünoloji Synapse görselleştirme

Daha fazla video keşfet