Çift Renkli Zaman-kapılı Uyarılmış Emisyon tükenmesi (STED) Nanoscopy tarafından İmmünoloji Synapse görselleştirme

Bu prosedürün genel amacı, TED mikroskobu kullanarak NK hücre litik sinapsındaki F aktin gibi yapıları görselleştirmektir. Bu, önce aktive edici antikor kullanılarak cam üzerindeki sinapsın özetlenmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, hücreleri ilgilenilen yapılar için perme ve lekelemeyi sabitlemektir.

Daha sonra, slaytlar lazer taramalı konfokal mikroskopi ile görüntülenir ve ardından daha yüksek görüntü çözünürlüğü için sabit tükenme uygulanır. Son adım, görüntüleri bir evrişim çözme algoritması kullanarak işlemektir. Sonuç olarak, sonuçlar, çift renk kararlılığı ve endoskopi sayesinde hücresel yapıların 100 nanometrenin altında çözünürlüğü gösterebilir.

Bu yöntem, hücre iskeleti ve ekzositoz arasındaki ilişki gibi hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bizim durumumuzda, litik granüller olarak adlandırılan özel lizozomların doğal öldürücü hücreler tarafından salgılanmasıyla ilgileniyoruz. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, TED tükenme lazerinin uygulanmasında ayarlanabilecek birden fazla değişken olduğu için mücadele edeceklerdir.

Tükenme ışınının uygun olmayan bir şekilde uygulanması, çözünürlükte iyileşme yerine kötüleşmeye neden olacaktır. Hazırlık aşamasında, 30 mililitre RPMI ortamını %10 FCS ile ve ayrı olarak ısıtın. Bir mililitre BD CY, cyop permasını hem 37 santigrat dereceye kadar etkiler. Ardından, kapak fişlerini antikorlarla kaplama işlemine başlayın.

1.5 numara kapak fişlerini alın ve bir PAP kalemi kullanın. Kapak fişlerinin üzerine kuruş büyüklüğünde kareler yapın. Test edilen her koşul için bir kare hazırlayın.

PBS'de her daireyi mililitre başına beş mikrogramda 200 mikrolitre antikor ile yükleyin. NK 92 hücre aktivasyonu için anti CD 18 ve anti NK P 30 antikorları kullanın. Yüklenen örtü fişlerini 37 santigrat derecede yarım saat inkübe edin ve ardından oda sıcaklığında bir daldırma ile yıkayın PBS, test edilen her koşul için hücreleri eklemeye hemen devam edin, 500.000 hücre kullanıma hazır olmalıdır.

Hücreleri 10 mililitre ön ısıtma ortamında yıkayın ve ardından aynı ısıtılmış ortamda yeniden süspanse edin. Hücreler tamamen süspansiyon halindeyken mililitrede 2,5 milyon hücrede, kapaktaki her antikor karesine 200 mikrolitre boşaltın Slipler, kapak fişlerini bu durumda% 5 CO2 ile 37 santigrat derecede hücrelerle inkübe eder. İnkübasyon yıkamasından sonra NK hücrelerindeki granülleri polarize etmek için 20 dakika yeterli bir süredir, kapak oda sıcaklığında PBS'de nazikçe kayar.

Bir mililitre ılık BD CY efektli cyto perma çözeltisine bir mikrolitre TRITTON X 100 ekleyerek başlayın. Sonra girdap. Bu çözeltiden 200 mikrolitreyi, kapak fişlerindeki her koşul karesine uygulayın.

Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında karanlıkta bırakın ve 10 dakika bekleyin. Kuluçka bittiğinde, kapak fişlerini boyama tamponunda nazikçe yıkayın. Daha sonra çevrelenmiş bölgelerin kenarlarını pamuklu çubukla kurulayın.

Daha sonra, çevrelenmiş bölgelere boyama tamponunda 200 mikrolitre primer antikor ekleyin ve kapak kaymalarının karanlıkta yarım saat inkübe kalmasına izin verin. Stead görüntüleme için bazı iyi ikincil antikorlar arasında Alexa floor 4, 88 Pacific orange ve Horizon V 500 bulunur. Bunların her biri bir ila 200 seyreltmede iyi çalışır.

Kuluçka yıkamasından sonra, kapak lekelenir, tamponlanır ve kurulayın. Daha önce olduğu gibi, her koşul karesine 200 mikrolitre ikincil antikor uygulayın. Sonra 30 dakika daha karanlıkta oturmalarına izin verin.

Bu noktada, ek yıkamalardan sonra ek antikorlar eklemek mümkündür. Örneğin, f aktin'i tespit etmek için Phin bir ila 200 arasında uygulanabilir. Bir montaj ortamı için, stead ile uyumlu olmayan vektör kalkanı üzerinden uzatmayı seçin.

Phin boyama kullanılıyorsa, ancak tamam iken iki iki tiyoetanol kullanmaktan kaçının, şimdi bir slayta 10 ila 20 mikrolitre montaj ortamı uygulayın. Kapak kayması ters çevrilmiş durumdayken, hava kabarcıklarını önleyerek yavaşça ortama indirin. Ardından slaydı 24 saat inkübe edin.

Kapakla birlikte ertesi gün kaydırın, kapak fişini oje ile kapatın ve görüntülemeye devam edin. Lazerleri ve yazılımı başlatın. Sabit tükenme lazeri% 100 güçte ısınmalı ve hizalanmalıdır.

Göz merceğini kullanarak örneğe odaklanın, ardından yazılıma dönün. En uzun dalga boyuna sahip olan ilk kanalı tarayın. Dördüncü kat, lazerin gücünü, uyarma ışını konumunu ve dedektör aralığını optimize edin.

100'ün üzerinde ayarlamaktan kaçının. Ardından, konfokal bir görüntü yakalayın ve piksel olup olmadığını kontrol edin. Doygunluk, çizgi ve kare ortalamasının her ikisi de piksel çözünürlüğünü artıracaktır.

Amaç, piksel başına 30 nanometrenin altında olmaktır. Bunun yerine bir miktar doygunluk kabul edilebilir. Ardından, sabit tükenme ışınını %50 güçte uygulayın ve bir görüntü yakalayın.

Çözünürlük iyileşirse, daha fazla güç uygulanabilir. Ayrıca, uyarma lazer gücünün veya çizgi ortalamasının veya kazancın ayarlanması da çözünürlüğü iyileştirebilir. Arka planı azaltmak için 0,3 nanosaniye zaman geçişi uygulayın ve yukarı doğru ayarlayın.

Yeni çözünürlük, tam yarım genişlik maksimum hesaplaması kullanılarak tahmin edilmelidir. Memnun kaldığınızda, tüm kanallar ayarlandığında bu adımları ikinci kanalla tekrarlayın. Tüm tarama dizileriyle tek leke kontrollerini görüntüleyerek spektral örtüşmeyi kontrol edin.

Hafif örtüşme, yazılım tarafından spektral karıştırma ile düzeltilebilir, ancak en iyi şekilde kaçınılır veya minimumda tutulur. Şimdi, kantitatif görüntüleme için görüntüler elde edin. Deney koşullarına göre koşul başına en az 20 görüntü elde edin.

Kaydedilen görüntüleri döndürmek için, dosyaları uygun yazılımda açın. Her kanalın parametrelerini, özellikle uyarma ve kabul spektrumlarını, sabit tükenme emisyonunu ve görüntüleme yönünü kontrol edin. Ardından yazılımın evrişim çözme hesaplamalarını uygulayın.

Varsayılan ayarlar genellikle yeterlidir, ancak gürültüye giden sinyal zemin kuvveti arasında değişecektir, bu nedenle bu parametrenin deney için manuel olarak ayarlanması gerekir. Stead ile optimal olmayan çözünürlüğe yol açabilecek birkaç yaygın tuzak vardır. Biri örnekleme aşamasındadır.

Bu, grenliliğe ve bu f aktin filamentlerinde olduğu gibi piksel bilgisi kaybına yol açar. Çizgi veya kare ortalamasını artırmak genellikle bu sorunu çözer. Başka bir sorun, uzun pikselin neden olduğu ağartma veya aşırı örneklemedir.

Genellikle görüntü alımından önce taramadan fazla satır ortalamasının aşırı olması nedeniyle bekleme süresi de suçlu olabilir ve görüntüleri almadan önce daha küçük bir tarama kullanılarak veya daha yüksek bir tarama hızı kullanılarak düzeltilebilir. Lazer gücünü azaltmak, her şeyin çalışmasına da yardımcı olabilir. Görüntü önemli ölçüde iyileşecektir.

Dekonvolüsyon görüntüyü daha da iyileştirecektir. Hem niceliksel hem de niteliksel olarak. Bu prosedür denenirken rutin olarak 100 nanometrenin altında çözünürlük elde edilmelidir.

Her deneyden önce ve daha sonra bu prosedürü izleyerek yaklaşık saatte bir sabit ışın hizalaması yapmayı unutmamak önemlidir. Kolokalizasyon, hücre altı lokalizasyonu ve moleküler etkileşimlerle ilgili ek soruları yanıtlamak için kantitatif analiz gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.