Name: Bir Cam destekli Planar çift katlı lipid Doğal Öldürücü Hücre İmmünoloji Synapse Süper çözünürlüklü Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Öğrenin, cam destekli planar çift katlı lipid kullanarak NK hücre immünolojik sinapslarını STED mikroskobisiyle süper çözünürlüklü görüntüleme yöntemini. Bu teknik, aktin sitoskeleton ve lizozom granüllerinin ultra yapısını detaylı incelemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Görüntüleme ve dekonvolüsyon analizi için Emily Mace ve Malini Mukherjee'ye teşekkür ederiz. Liu laboratuvarındaki çalışmalar kısmen Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü'nden AI36211 numaralı Baylor-UTHouston AIDS Araştırma Merkezi Temel Destek Hibesi, Caroline Wiess Moleküler Tıp Araştırmaları Hukuk Fonu, Teksas Çocuk Hastanesi Pediatrik Pilot Araştırma Fonu ve Baylor Tıp Fakültesi ve Metodist Araştırma Enstitüsü'nden Lenfoma SPORE Gelişimsel Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.

Lipozomların hazırlanması 1. <ol><li> 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC) ve 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-kapak biyotinil kloroform süspansiyon stok çözeltileri miktarını hesaplayın (Biotin-PE) istenen son konsantrasyonda seyreltilmiş stok yapmak için. 10 ml her biri 400 uM DOPC ve 80 uM Biyotin-PE fosfolipidler nihai konsantrasyonları sağlamak için, ayrı bir cam kromatografi tüplere 10 mg / ml DOPC 629 ul ve 88 ul 10 mg / ml biyotin-PE yerleştirilmesi ile başlar. NOT: DOPC ve biotin-PE kloroform-süspansiyon stok solüsyonu aktarma sırasında, çözeltisi (120 ml su ihtiva eden 60 g potasyum hidroksit, KOH 1 L% 95 etanol) temizleyerek cam Hamilton şırınga ve bir cam kromatografi temiz tüplere önemlidir. </li><li> Kimyasal kaputu bir argon akıntısı ile kloroform kurutun. Parafilmle kromatografi tüpü kapatılmalıdır. </li><li> Bir lyophiliz yüksek vakuma yeni kurutuldu lipozomlar Konuer O / N herhangi bir kalıntı kloroform kaldırmak için. 60-90 dakika boyunca kuru aynı gün tamamlanması için. </li><li> Liyofilizerde çalışır iken, bazı seyreltme tamponu hazırlamak. Bu protokol için, 25 mM Tris, pH 8.0 oluşan 25 ml hazırlamak; 150 mM NaCI; ve (ağırlık olarak)% 2 n-oktil-β-D-glukopiranosid (KK), deterjan. Sonra kuru OG tozu eklemeden önce argon ile oksijenin yerini, birbirine Önce iki malzemeyi karıştırın. Hazırlandıktan sonra 4 ° C de RG 0.2 mikron selüloz asetat membran ile çözeltisi ve mağaza filtre edin. </li><li> Buna ek olarak, ama RG olmadan aynı konsantrasyonlarda Tris-salin tamponu, 1 L, iki vidalı kapaklı şişe hazırlanır. Her bir alt damıtılmış suyla temizlenen manyetik karıştırma çubuğu yerleştirin. Tris-tuzlu tampon 6 ek litre hazırlayın. Argon ile tüm şişeler oksijen çıkarın ve hem de 4 ° C &#39;de koyun. </li><li> Liyofilizasyondan sonra, her bir 4 mM çözeltinin yapılması Tris-salin RG tamponu içinde tutularak kurutulmuş lipitlerin çözülür. Örneğin ardındanmiktarlar, Biyotin-PE tüp DOPC tüpüne 2 ml ve 0,2 ml ilave ediniz. </li><li> Birlikte DOPC lipidler ile biyotin-PE lipidleri karıştırın. Birleştiğinde biyotin fosfat baş grupları akışkanlığını bozabilir gibi bu, SLB hareketliliğini artırır. 80 uM Biyotin-PE bir son konsantrasyon sağlamak için, 0.2, 4 mM Biyotin-PE ml ve 4 mM DOPC 1 ml karıştırın. Daha sonra, Tris-salin RG tampon 8.8 ml ilave ediniz. </li><li> 400 uM DOPC bir son konsantrasyon için, sadece Tris-salin RG 9 ml 4 mM DOPC 1ml karıştırın. </li><li> Buzlu su ile sonikatör doldurun. Bir yardımcı kelepçe kullanarak sonikatörde merkezinde seyreltilmiş fosfolipid içeren cam tüp koyun. Çözelti berrak hale gelinceye kadar 10 dakika boyunca seyreltilmiş fosfolipid sonikasyon. NOT: Sonication ısı üretir çünkü düşük sıcaklık tutmak için sonikatör su banyosu içine buz ekleyin. </li><li> Sıvının üzerindeki havanın oksijeni yerinden argon tüpler doldurun ve parafilm ile mühür. </li></ol&gt; Liposome&#39;lara 2. Diyaliz <ol><li> Kuru diyaliz tüpünün iki bölüm kesin (Moleküler ağırlık cut-off: 12-14,000, çap: 6.4 mm) ve uygun uzunlukta (bu örnekte, 40 cm), her bir fosfolipid seyreltme için bir, rulosundan. </li><li> Uygulanan 2 dakika boyunca bir cam kap içinde damıtılmış su, 200 ml ıslatmaya bırakarak boru bölümleri rehidrate. </li><li> Yüksek ayarda 5 dakika bu mikrodalga, ya da en azından su kaynama noktasına gelene kadar. </li><li> Her tüpün bir ucunda bir düğüm ve Tris-salin-OG tampon maddesinin bir kaç mililitre ile iç yıkayın. Bundan sonra, titizlikle içinde kalan tampon miktarını en aza indirmek için mümkün olduğunca bu yıkama tamponu kadar sıkmak. </li><li> Havayı uzaklaştırmak için, bir laminar akış başlığı içinde, küçük bir diyaliz tüpü kapağın açık uçları, her bir tüp içinde seyreltilmiş fosfolipidleri ekleyebilir ve kelepçe. Komple hava dışlama ve altında sıkma numunenin küçük bir hacimde kurban gerektirir# 8220; su hattı &quot;. </li><li> OG olmadan Tris-tuzlu tampon önceden hazırlanmış şişelerde örnekleri daldırın. 4 ° C&#39;de O / N karışmaya yeniden mühürleme ve yerleştirmeden önce argon ile şişe içinde oksijenin yerini. </li><li> En az 3 kez OG olmadan Tris-salin tamponu yeni bir şişe içine, 12 saatte bir boru aktarın. </li><li> Kısa bir süre diyaliz lipitlerin çıkarılmasının önce oksijenin yerini, argon her doldurarak lipidler kana içine küçük bir dizi tüpten hazırlar. </li><li> 36 saat sonra, laminer akış kaputun içine diyaliz şişe almak ve şişelerden diyaliz tüpleri çıkarın. Islak ikinci tur toplamak için yandan bir tezgah bebek bezi veya beher var. </li><li> Sonra klibini kaldırmak ve dikkatle buz üzerinde argon gazı ile doldurulmuş önceden hazırlanmış tüpler 1 ml kısma pipet aracılığıyla diyaliz lipit çözümü aktarmak, klibi üzerinde diyaliz tüp kesin. </li><li> Sulu lipozom çözümü bölmeyin, i oksijen tekrar yerinden argon akışı kullanınn, her bir tüp. </li><li> 4 ° lipozomlar saklayın. Donma yok. </li></ol> Çift katlı lipid üzerindeki Antikor Yoğunluk 3. Belirlenmesi <ol><li> Aşağıdaki konsantrasyonlarda, biyotinile edilmiş, floresan etiketli antikorun bir seyreltme serisi, her bir seyreltme için hacim olarak 50 ul hazırlayın: (boş) 0 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM ve 500 nM. (Ahirette olarak &quot;örnek serisi&quot; olarak anılacaktır). </li><li> 96 oyuklu V-tabanlı plakanın 6 kuyu içine silis boncuklar 1 ul ekle. Onlar çökmemesi için iyi pipetleme önce boncuk sallamak emin olun. NOT: askıya yerine kuru boncuk sipariş sahip olursa, sulandırmak için üreticinin talimatlarını izleyin. </li><li> 1: 1 oranında bir Biyotinil fosfolipid: bu boncuklar için, 2 karma DOPC ul ekle. Her kuyu için bunu yapın. </li><li> Boncuk ve fosfolipidler ile etkileşimi teşvik etmek 10 saniye, her orta güçte 3 kez vortexer üzerinde plaka Darbe. </li><li> 5% cas 150 ul ekleyinHer bir oyuğa ein. Yukarı pipetleme ve üç kez aşağı iyice karıştırın. </li><li> Plaka daha sonra 10 dakika boyunca kazein çözeltisi içinde inkübe yıkayın olsun. Yıkama, HEPES, 250 ul toplam hacmine her bir dolgu,% 1 insan serum albümini (HSA) ile tuzlu su (HBA) tamponlu. 2 dakika için 1000 xg&#39;de santrifüj. Dışarı Pipet ve süpernatant iyi 200 ul atmak ve üç yıkama döngüsü toplam iki kez tekrarlayın. </li><li> 333 ng / ml konsantrasyonda streptavidin 50 ul ekle. Tekrar 10 sn 3x plaka basınç ve 15 dakika boyunca bir karıştırıcıda bekletin. Yıkama 3x 6. adımda olduğu gibi bağlanmamış streptavidini kaldırmak için. </li><li> Daha önce hazırlanan seyreltme serilerinden floresan etiketli biyotinile antikor, 50 ul ekle her oyuğa (adım 3.1), 20-30 dakika boyunca bir karıştırıcı üzerinde plaka değiştirin. Yıkama 3x aşama 6&#39;da olduğu gibi bağlanmamış antikorların çıkarılması için. </li><li> Son yıkamadan sonra, daha sonra bir FACS tüpü transfer HBS /% 1 HSA 100 ul boncuk yeniden süspanse edin. Iki kez bu işlemi tekrarlayın300 ul bir toplam kuyudan tüm tanelerin etkin şekilde çıkarılmasını sağlamak ve her bir oyuk için bunu. </li><li> Akış sitometresinde elde edilen tüpler getirin. Onları okumak için zamanı. </li><li> Florasan yoğunluğu kalibrasyon (FIC) kordon kiti &quot;B&quot; işaretli şişe 1 damla bir FACS tüpü için (bundan sonra &quot;standart dizi&quot; olarak anılacaktır) ve HBS /% 1 HSA 300 ul ile seyreltin. </li><li> Bu tüp oku, ama henüz veri kaydı yok. Şimdilik, sadece boş boncuklar düzgün sıfırlanır emin olun. Zirve histogram kadar sol tarafında kadar uygun kanalda ölçülen boncuk floresan gösteren bir histogram yapın, sonra aşağı uyarma lazer gerilimi kayması. </li><li> Tüp çıkarın ve aynı tüpe (4 üzerinden 1 etiketli) dizinin diğer 4 tüplerin her biri 1 damla ekleyin. Şimdi, tekrar makineye tüp yerleştirmek, ve 5 ayrı zirveleri olarak görünmelidir elde edilen verileri, kayıt. </li&gt; <li> Örnek serisi her tüp okuyun. </li><li> FACS analizi yazılımı kullanarak, yarı-maksimal noktada standart seri Histogramda her tepe tüm genişliğini kapsayan bir kapı çizin. Yani, her bir zirve için, bir kapı. Her numune için de yapın. MFI, her kapı için (ortalama floresan yoğunluğu) Not. </li><li> Uygun bir yerde bir elektronik tablo programı girişi ölçülen MFI değerleri kullanarak. Ayrıca giriş MESF değerleri (Eşdeğer Çözünür Florokrom Moleküllerin) standart seride her şişe için (her bir boncuk kaplama floresan moleküller ortalama sayısı). Bu bilgiler plastik tüpler tarifi geldi kavanoz takip ederek ulaşabilirsiniz. </li><li> Fluorophores sayısı ve ölçülen yoğunluğu arasında doğrusal bir ilişki oluştururken, MESF değerlerine karşı MFI arsa olacaktır e-tabloyu kullanın. </li><li> Pro boyanın oranını belirlemek için mikro hacim spektrofotometrede &#39;, proteinlerin ve etiket&#39; modülünü kullanaraketiketli antikor proteindir. </li><li> Giriş örnek protein etiketleme verimliliği, lipidler ile kaplı tanelerin ortalama çapı, ve her bir giriş için MFI değeri. Elektronik tablo otomatik olarak her bir protein seyreltme ve her konsantrasyonda örnek protein tohumlama yoğunluğu için MESF değerlerini hesaplamak için adım 3.16 oluşturulan çizgi grafikten formülü kullanacağız. </li></ol> 4. Yalıtımlı ve Kültürleme İnsan NK Hücreleri <ol><li> Kısım 15 ml 50 ml konik tüp içine periferik kan veya ince beyaz tabaka. PBS 1 oranında% 1 FBS içeren bu kan seyreltilir: 1 arasındadır. </li><li> Yavaşça, 10 ml serolojik pipet ile tüpün dibine Ficoll 13 ml ilave edilir. </li><li> Santrifüj 20 hızlandırıcı ile 1.200 xg&#39;de dakika ve mola için kapalı veya düşük ayarlarda bu tüp. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, ağ, (PBMC&#39;ler), periferal kan tek-çekirdekli hücrelerinin yüzen bulanık beyaz orta tabaka toplamak için serolojik bir pipet kullanınarada tutarak oturmak ve berrak sarı renkli bir üst tabaka ve kırmızı kan hücrelerinin (RBC) &#39;in bir alt katman üzerinde oturmak, her ikisi de, daha dumanlı ve uçuk renkli alt tabakası arasındaki kesişme gerekir. NOT PBMC&#39;leri toplama herhangi eritrositlerde toplamak etmeyin. </li><li> Yeni 50 ml konik tüp toplanan PBMC&#39;leri yerleştirin ve PBS% 1 FBS içeren kapasitesine seyreltin. Tekrar santrifüj, 300 x g, 5 dakika boyunca en fazla üzerinde fren ile gaz pedalı, bu kez. </li><li> Süpernatant atılır ve% 1 FBS içeren 10 ml PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Adım 4.6 olarak bir kez daha aynı ayarlarda santrifüj sırasında hücreleri saymak. </li><li> Bir kez daha Süpernatant atılır ve 10000000 hücre / ml bir yoğunlukta R10 ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Üreticinin talimatları izleyerek, 5 ml polistiren tüp içinde 30 milyon hücre alın ve bir manyetik ayırma kiti kullanılarak NK hücreleri izole. İzolasyondan sonra, 500,0 bir yoğunlukta hücreler bir kez daha tekrar süspansiyon ve sayısıR10, tam bir ortamda 00 hücre / ml (% 88 RPMI,% 10 FBS,% 1 HEPES,% 1 sodyum piruvat), IL-2 (100 U / ml) ile takviye edilmiştir. CO 2 inkübatör 37 ° ve kültür 2-3 kez haftalık orta yerine. </li></ol> 5. Cam destekli Planar çift katlı lipid Montaj <ol><li> Bir çanak içinde 3: 1 oranında sülfürik asit ile% 30&#39;luk hidrojen peroksit karıştırılarak 100 mi pirana çözelti hazırlayın. NOT: Her zaman doğru belirlenmiş kimyasal davlumbaz sülfürik asit gibi zararlı maddeler ile çalışmalarını yürütmek. </li><li> Bu çözelti içine, 20-30 dakika boyunca pirana çözeltisi içinde 2 dikdörtgen # 1.5 lamelleri bırakın. NOT: Bu piranha çözeltisi ile lamelleri temizlemek için gereklidir. </li><li> Lamelleri temizlenir edilirken, daha önce 400 mcM DOPC lipidler ve daha önce 80 mcM Biotin-PE lipidler hazırlanan 1 tüp hazırlanmış, 1 tüp almak. Argon tankına buz üzerinde taşırlar. </li><li> Argon ile yeni bir mikrosantrifüj tüpü içinde oksijenin yerini,: 1 oranında daha sonra 1 de DOPC ve biotin-PE birbirine eklenir. Belirli hacmi deneysel ihtiyaçlarına göre değişir, ancak en az 2 ul her biri olmalıdır. Buzdolabı ikinci dönmeden önce, hem de bir kez daha argon gazı ve bireysel reaktif tüpleri ile karışım tüpü içinde oksijenin yerini. </li><li> Onlar temizlik bittikten sonra, distile su ile iyice durulayın lamelleri. Bir kaç dakika için havayla kurumaya üzerinden lamelleri ayarlayın. </li><li> Adım 5.4 hazırlanan lipozom karışımı 1.5 ul çekiniz ve oda slayt şeritli odalarından birine tek bir damla onu bölmeyin. Her şerit başına 2 damla kullanımı tipik, ancak gerekli değildir. </li><li> Hızlı ve verimli bir şekilde damlacıklar üzerinde kuru lamel yerleştirin. Lamel yerleştirilir kez onlar birleştirme kalmamak damla yeteri kadar aralıklı emin olun. Ayrıca, damla odası duvarlarının kenarları dokunmadan, yuvarlak ve iyi tanımlanmış kalmasını emin olun. Sıkıca bastırınarasında her kulvarın etrafında lamel ve slayt arasındaki su geçirmez bir mühür sağlamak. </li><li> Bir işaretleyici kalem kullanarak damla konumlarını işaretleyin </li><li> Iki tabakalı engellemek için, odacık içinde, sulu% 5 kazein 100 ul geçirin. Akış odasında hiçbir kabarcıklar olmadığından emin olmak için deneyin. </li><li> Her bir şerit halinde 333 ng / ml&#39;lik bir konsantrasyonda streptavidin 100 ul enjekte edilir. Oda sıcaklığında 10-15 dakika kuluçkalayın. Bundan sonra, aşırı streptavidin kaldırmak için her kulvarın içinden HBS / 1% HSA 3 ml çalıştırarak yıkayın. </li><li> , Daha önce 20-30 dakika süreyle karanlıkta inkübe bölüm 3&#39;te en etkili olduğu tespit protein konsantrasyonunda Alexa Fluor 568 olarak biyotinile edilmiş floresan etiketli anti-CD16 100 ul ekle. Her kulvar üzerinden HBS / 1% HSA 3 ml çalıştırarak tekrar yıkayın. </li><li> St spesifik olmayan bağlanma şansı fazlalık streptavidini bağlamak ve böylece ortadan kaldırmak için, odacık içinde bir konsantrasyonu, 25 nM D-biyotin 100 ul akışhücrelere reptavidin. </li><li> HBS /% 1 HSA 500000 / ml&#39;lik bir konsantrasyonda, NK hücreleri ve tekrar süspansiyon sayısı. </li><li> Hücrelerin aşağı iplik birlikte, şerit başına HBS /% 1 HSA bir 3 ml bölmenin üzerinden D-biotin yıkayın. </li><li> Önce NK hücrelerini ekleyerek bir toplam iç yansıma floresan (TIRF) veya konfokal mikroskobu üzerinde (sıkı bağlamak) photobleaching sonra floresan kurtarma ile SLB üzerinde ligandların hareketliliğini kontrol edin. </li><li> Hücreler iplik bitirdim ve istenilen konsantrasyonda yeniden süspanse edildikten sonra, her kulvarın 100 ul ekleyin. </li><li> 30-60 dakika boyunca 37 °,% 5 CO2 kuluçka makinesinde bölme yerleştirin. </li><li> Bu inkübasyon süresinden sonra, 10-20 dakika boyunca oda sıcaklığında% 4 paraformaldehit ile hücrelerin tespit. Paraformaldehid kaldırmak için her sokağın içinden PBS 3 ml çalıştırarak yıkayın. </li><li> Tamponu (% 5 normal eşek serumu ve% 0.2 PBS Tritron X-100) bloke 400 ul ekle. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Leke F-aktin ve reklama göre perforinDing seyreltildi floresan işaretlenmiş falloidinle 200 ul (1 adet / ml işaretlenmiş falloidinle) ve floresan-etiketli anti-perforin mAb (500 ng / ml anti-perforin mAb). 1 saat süre ile oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> PBS 3 ml çalıştırarak yıkayın. kamara görüntüleme için hazırdır. </li></ol> STED&#39;i kullanarak lipid iki-tabakalı NK Synapse 6. Görüntüleme <ol><li> Gerekli tüm donanım modüllerinde açın. </li><li> Görüntü analiz yazılımı başlatın. Rezonans tarama ve STED&#39;in modülleri hem etkinleştirin. Bu seçimleri yaptıktan sonra, yazılım başlatmak için yaklaşık 3-5 dakika bekleyin. </li><li> Ekranın üst kısmındaki &quot;Yapılandırma&quot; sekmesine tıklayın. </li><li> Seç &quot;Lazer Yapılandırma&quot; sonra beyaz ışık ve STED&#39;in 592 nm lazerler açın. </li><li> 100x hedefi seçin ve 592 nm tükenmesi lazer ile uyarma lazer ışını hizalamak. </li><li> &quot;Lazer Yapılandırma&quot; modülünü seçin 592 tükenmesi kapatmakLazer ve 660 nm tükenmesi lazer dönüş. </li><li> Lens üzerinde, sahnede üzerine slayt yerleştirin. Beyaz ışık lamba ve Okülerin kullanarak odağa demarcated iki katmanlı bölgeye bağlı hücreleri getir. </li><li> Doğrudan &quot;Yapılandırma&quot; sekmesinin sağında, &quot;Toplama&quot; sekmesine dönün. </li><li> &quot;Anahtarı Whitelight için&quot; sekmesine tıklayın, ardından bu modülü açmak ve uygun dalga boyu uyarma lazer çizgisini sürükleyin. </li><li> Sonra dalga boylarında uygun kapsayacak şekilde algılama aralığı ayarlamak, mevcut olanların listesinden istediğiniz dedektör seçin. NOT: Uyarma kirişin altında doğrudan algılama aralığı koymak ASLA. </li><li> Sol araç çubuğunun alt Sıralı Tarama diyalog getirmek için sol-el &quot;Seqential&quot; renkli &quot;Edinme&quot; araç çubuğunu tıklatın. Bu, kullanıcının birden dizileri eklemek için her veriyorFarklı renk için ayrı bir uyarım ışığı ile. &quot;Çerçeveleri Arasında&quot; tıklatın ve sonra adım 6.9 ve 6.10 gibi her ek renk için uyarma frekansı, dedektör ve algılama aralığı ayarlayın. </li><li> Tüm ayarlar optimize sonra, satın alma işlemini başlatmak için &quot;Başlat&quot; çarptı. </li><li> Daha önce açıklandığı gibi 13, STED deconvolution için tasarlanmış bir ayarı kullanarak ücretsiz Dekonvolüsyonun yazılımı (Huygens) uygulayın. </li></ol>

<ol><li>Dustin, M. L., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic immunological synapses.</a> Immunol. Rev. 235 (1), 24-34 (2010).</li>
<li>Monks, C. R., Freiberg, B. A. K. upferH., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Hafeman, D. G., von Tscharner, V., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+antibody-dependent+interactions+between+macrophages+and+lipid+haptens+in+planar+lipid+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Specific antibody-dependent interactions between macrophages and lipid haptens in planar lipid monolayers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 78 (7), 4552-4556 (1981).</li>
<li>Tscharner, V., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+properties+of+lipid+monolayers+on+alkylated+planar+glass+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Physical properties of lipid monolayers on alkylated planar glass surfaces.</a> Biophys J. 36 (2), 421-427 (1981).</li>
<li>Crites, T. J., Chen, L., Varma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TIRF+microscopy+technique+for+real-time%2C+simultaneous+imaging+of+the+TCR+and+its+associated+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A TIRF microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the TCR and its associated signaling proteins.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Prins, K. C., Vasiliver-Shamis, G., Cammer, M., Depoil, D., Dustin, M. L., Hioe, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+HIV-1+envelope-induced+virological+synapse+and+signaling+on+synthetic+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging of HIV-1 envelope-induced virological synapse and signaling on synthetic lipid bilayers.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. , (2008).</li>
<li>Michalet, X., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+photon+statistics+to+boost+microscopy+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Using photon statistics to boost microscopy resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (13), 4797-4798 (2006).</li>
<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat. Methods. 6 (1), 21-23 (2009).</li>
<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-field+optical+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Far-field optical nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+%28STED%29+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J. Vis. Exp. , (2014).</li>
<li>Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), e1001151(2011).</li>
<li>Leutenegger, M., Ringemann, C., Lasser, T., Hell, S. W., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+with+a+total+internal+reflection+fluorescence+STED+microscope+%28TIRF-STED-FCS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy with a total internal reflection fluorescence STED microscope (TIRF-STED-FCS).</a> Opt Express. 20 (5), 5243-5263 (2012).</li>
<li>Liu, D., Bryceson, Y. T., Meckel, T., Vasiliver-Shamis, G., Dustin, M. L., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+organization+and+bidirectional+vesicular+traffic+at+cytotoxic+immune+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent organization and bidirectional vesicular traffic at cytotoxic immune synapses.</a> Immunity. 31 (1), 99-109 (2009).</li>
<li>Liu, D., Peterson, M. E., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adaptor+protein+Crk+controls+activation+and+inhibition+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The adaptor protein Crk controls activation and inhibition of natural killer cells.</a> Immunity. 36 (4), 600-611 (2012).</li>
<li>Wu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+conjugated+supported+lipid+bilayer+for+capturing+and+purification+of+viable+tumor+cells+in+blood+for+subsequent+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Antibody conjugated supported lipid bilayer for capturing and purification of viable tumor cells in blood for subsequent cell culture.</a> Biomaterials. 34 (21), 5191-5199 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu çalışmanın yenilik NK hücre sinaps çalışma STED&#39;in ile SLB tekniği birleştiren olmasıdır. Önceki çalışmalar plazma zarı 6 T hücre sinaps oluşumu 8 ve sinyalizasyon molekül kaçakçılığı çalışma TIRF ile iki tabakalı lipid görüntülü var. Diğer antikor kaplı cam slaytlar 13,14 kullanılarak NK hücre sinaps STED&#39;in görüntüleme tarif edilmiştir. Burada daha fazla tarif hibrit yöntemi çift katlı lipid yüzeyinde süper çözünürlüklü görüntüleme sağladığı gelişmiş netlik ile NK hücre sinaps görüntüleme ile bu çabaların üzerine inşa olan bir APC daha iyi modelleri dinamik bir yüzey. SLBS gerçek hedef hücreleri veya APC&#39;lerdir sahip olduğu hücre iskeletinin, lipid sallar eksik yapay membranlar ve diğer ligandlar olmasına rağmen, bu tekniğin hareketlilik ve ligandların yönelim gibi önemli özellikleri özetlemek olabilir. Bu SLB sistemi diseksiyon t indirgemeci bir yaklaşım olarak hizmet veriyorIS oluşumu ve IS dinamiklerine bireysel reseptörleri ve ligandların o katkısı. SLBS en önemli özelliği araştırmacılar, konfokal ve TIRF mikroskopi gibi yüksek çözünürlüklü görüntüleme yaklaşımları, bu tekniği birleştirebilirsiniz olmasıdır. STED mikroskopi giriş bile daha fazla araştırma ve klinik uygulamaları IS içine görülmemiş anlayışlar sağlayarak, bu avantajı artırır. Bu sistemin bir potansiyel eleştiri SLB yeterince bu şekilde elde edilen sinaps potansiyel olarak fizyolojik olmayan anatomik özelliklere yol açan, bir APC kompleks yüzeyi taklit olmasıdır. O SLB yüzey moleküllerinin sınırlı repertuarı tam bir APC heterojen nüfuslu yüzeyini özetlemek olmadığı doğru olsa da sinaps oluşumu bireysel reseptör ve ligand etkileşimleri etkisini belirlemek için müfettişler izin verir ki, bu sınır da avantajlı olabilir . TBurada sürecinde birçok önemli adımlardır. En kritik arasında lipozomlar bu oksidasyon gibi adımlar 1.10, 2.6, 2.11 ve gibi sürekli tüp ve çözüm, oksijeni yerinden argon kullanarak üzerinden önlenebilir olduğunu. Lipidlerin oksitlenmesi, böylece serbestçe hareket ve sinaptik yapılanma katılma yüzey proteinleri engellemeden, azalmış lipit hareket neden olur. Aynı şekilde, bu liyofılizasyondan (adım 1.2) tarafından lipozom tüm kloroform kaldırmak için de önemlidir. Lipit protein yoğunluğunun belirlenmesi, ilk olarak, kümeler arınmış homojen bir süspansiyon haline silikon boncuk dağıtmak için önem taşımaktadır. Gerekirse, tanelerin sonikasyon uygulanabilir. Lamelleri temizlenir burada SLB monte edilirken, ilk adım (5,1-5,8) damla yerleştirilir ve kapak hayati önem yapıştırılmıştır. Bunlardan herhangi bir hata (bölüm 5 yılı başından itibaren) üzerinde deney başlamadan gerektirebilir. Bu nedenle, bununBir aksilik durumunda zaman kazanmak için gerekli olacak daha iyi bir uygulama daha lamelleri temizlemek için. Bu sistem ile çalışırken olmayan kümeleme en sık konudur. Son adımda hücreleri görselleştirme zaman, biri herhangi bir floresan sinaps bulmak için başarısız olursa, alınabilir bir kaç adım vardır. Hücreler, sinaptik-katılan yüzey proteinleri gerekir, cam lamel veya iki tabakalı bir yüzeyine spesifik olmayan yapışma çıkarabilirler aynı kökenli hücre yüzeyi reseptörü için bir diğer boyama, hücre çift tabakalarına sahip bir sinaps meydana olmadığını doğrulamak için bölmeye eklenebilir tutturulmamış yüzey proteinleri pilin etrafında olarak yaygın boyama görünmelidir ise, hücreye iki katmanlı arayüzü düzleminde gibi farklı kümeleri görünür. Bu yöntem başarısız Should, belirli bir işaretleyici bir hücre yüzeyinde yeterli bolluk ifade edilir çalışma umuduyla emin olmak için flow sitometri aracılığıyla hücrelerini kontrol etmelisiniz. Bazı yüzey protein vivo kültür içinde uzun vadede aşağı regüle olduğu bilinmektedir. Bu protokol bilgilerini özellikle nasıl NK hücre sinaps oluşumunu görselleştirmek için birlikte, SLB sistem yalnızca adım 5.11 birincil ligandın ikamesi ile akla gelebilecek herhangi bir immünosit sinaps oluşumunu çalışmak için de kullanılabilir. Çoklu ligand aynı anda ilave edilebilir. Bir de çift-katlı olan yüzey proteinlerini yapıştırılması için bir streptavidin-biyotin sistemi kullanmak gerekli değildir. Nikel-NTA: histidin etkileşimler de yaşayabilir. Ancak, streptavidinin yüksek mukavemet ve özgüllüğü: biotin etkileşim, bizim laboratuar bu sistemi tercih ediyor. Bir de adım 5.13 reçete edilen yoğunluktan çift-katlı eklenen hücre konsantrasyonu, aynı zamanda olgunlaşmasının farklı aşamalarında sinaps gözlemlemek için daha sonraki kuluçka periyodunun süresi değişebilir. Elbette bu hücre içi str görselleştirme olasılığını dışlar ancak bu bile, canlı yapılabiliructures (onlar zaten sigortalı floresan etiketi ile etiketlenmiş sürece, bizim laboratuar birkaç tür değişmiş hücre hatları kullanır). Bu nedenle protokolde olası özelleştirme yüksek derecede, tek bir temel lipit dinamikleri 15, sinaps oluşumu da dahil olmak üzere, immünoloji, hücre biyolojisi ve biyokimya soruları inanılmaz yelpazede ele almak, STED&#39;in görüntüleme ile birlikte, temel SLB tekniği kullanabilirsiniz 16, hücre 17 sinyal ve tümör hücre metastazı 18.

immünolojik sinaps (IS) hücre aktivasyonu ve fonksiyonu 1 için kritik bir kavşakta yatıyor. Bu yüzden, antijen sunumu ve hücre-aracılı bağışıklık gerçekleştirildiği birincil ortamdır. sinaps oluşumu erken mikroskobik çalışmalar hücre-hücre konjuge sistemi 2 kullanılmaktadır. Bu yaklaşım ile önemli bir sınırlama böylece sinaptik yapının kendisi gözlemcinin bakış kısıtlayan, olduğu gibi konjügatlann çoğu, &#39;profilde&#39; inceledi olacak olmasıdır. 1999 yılında, Dustin laboratuar önceki McConnel laboratuar 4,5&#39;ten öncülük olmuştu cam destekli çift katlı lipid (SLB) tekniğini 3, kullanılarak bu sınırlama ele. Proteinler bağlı ve iki boyutta serbest bir şekilde hareket edilebilir olan bir cam-destekli düzlemsel lipit yüzey lehine antijen sunan hücreler (APC&#39;ler) olarak yerleştirilmiş bu yaklaşım. Bu yöntemi kullanarak, Dustin ve arkadaşları t doğrudan yukarı eş başardıkO yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu kullanarak, ilk kez IS yapısı bir &quot;yüz-yüze&quot; bir görünüm elde sinaps. SLB sisteminin kullanımı ile, IS görüntülenebilir hangi ayrıntı yalnızca geçerli görüntüleme tekniklerinin 6-8 sınırlamaları tarafından sınırlandırılmıştır. Standart aydınlatma tekniklerini kullanarak, minimum çözünürlük (yani, onlar ayırt edilebilir, burada iki farklı nesneler arasındaki minimum mesafe) &lt;olmuştur Rayleigh kriter 9 dayanarak 200 nm vardır. Bu sınır sinaps makyaj çok ince, moleküler ölçekli yapıların görüntüleme engel, ve süper-çözünürlük görüntüleme tekniklerinin gelişmesi 10-12 kadar, bu yapıların görselleştirme elektron mikroskobu kullanılarak sabit hücrelerin görüntüleme sınırlıydı. Böyle SIM gibi süper-çözünürlük teknikleri, çeşitli son çıkışıyla (yapılandırılmış aydınlatma mikroskopisi), PALM (fotoaktive yerelleştirme mikroskopi), STORM (stokastik optik mikroskop rekonstrüksiyon) ve STED&#39;in 10-12, araştırmacılar şimdi sırayla IS giderek açıklık anlaşılmasını sağladı sahip görülmemiş detay, bu sinaptik yapıları incelemek mümkün. STED&#39;in mikroskopi avantajları 13 daha önce tarif edilmiştir. Burada yeni geliştirilen 660 nm tükenmesi lazer ile donatılmış STED&#39;in mikroskobu ile süper çözünürlüklü görüntüleme tarif. Geleneksel 592 nm tükenmesi lazer ile karşılaştırıldığında, 660 nm lazer floresan boyalar (http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/ bakınız), özellikle bu kırmızı fluorophores daha geniş bir seçim sağlar. Diğer yayınlar, antikor kaplı cam lam 13,14 NK hücre sinaps STED&#39;in görüntüleme tarif edilmiştir. Burada, SLB sistemi NK hücre sinaps çalışma süper çözünürlüklü STED&#39;in mikroskobu ile bir araya getirilmektedir. Bu teknik antikor üzerinde bir avantaja sahiptirGömülü yüzey proteinleri düz bir iki-boyutlu bir yüzeye (xy düzlemi) serbestçe hareket edebileceği bir sıvı mozaik olmanın kaplı slaytlar. Bu daha iyi şekilde, bir hedef hücrenin, organik ve mobil yüzey taklit ve sonuç olarak daha iyi bir fizyolojik olarak uygun bir bağışıklık sinaps oluşumunu tartışıldı. Bu protokolün amacı SLB sistemi ve süper çözünürlüklü mikroskopi STED&#39;in birleştirerek NK hücrelerinin nasıl görüntüye immünolojik sinaps ayrıntılı bilgi ile son kullanıcıya sağlamaktır. Bu gerekli adımlarla son kullanıcıya sağlayacaktır: lipozomlar hazırlamak, protein gömülü bilayers inşa, lipit bilayers protein yoğunluğu belirlemek ve STED&#39;in mikroskopi kullanılarak süper çözünürlüklü görüntüler elde. Bu teknikler, immünoloji alanında sınırlı değildir ve geniş ölçüde çeşitli disiplinler boyunca kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>18:1 (&Delta; 9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin</td><td>Avanti&nbsp;</td><td>850375C</td><td>Lipozom hazırlama</td></tr><tr><td>18:1 Biotinil Kap PE 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-(kap biyotinil) (sodyum tuzu)</td><td>Avanti&nbsp;</td><td>870273C&nbsp;</td><td>Lipozom hazırlama</td></tr><tr><td>Argon gazı, basınçlı</td><td>Hava gazı&nbsp;</td><td>UN1006</td><td>Lipozom hazırlama</td></tr><tr><td>Bir liyofilizatör</td><td>Labconco&nbsp;</td><td>Freezone 7740020</td><td>Lipozom hazırlama</td></tr><tr><td>Liyofilizatör tüpleri</td><td>Labconco&nbsp;</td><td>7540200</td><td>Lipozom hazırlama</td></tr><tr><td>Kromatografi Sütunları</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-205558</td><td>Lipozom hazırlama</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 8.0</td><td>Ambion&nbsp;</td><td>AM9856</td><td>Lipozom hazırlama</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Ambion&nbsp;</td><td>AM9759</td><td>Lipozom hazırlama</td></tr><tr><td>Octyl-&beta;-D-glukopiranosid</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>O1008</td><td>Lipozom hazırlığı</td></tr><tr><td>Diyaliz tüpü</td><td><a href="http://www.spectrumlabs.com/generic/tms.html? LiFrom=%2Fdialysis%2FRCtubing.html; FrName=Spectra%2FPor+RC+Boru; rtm=Kit;#KIT">Spectrum Labs&nbsp; </a></td><td>132676</td><td>Lipozom hazırlama</td></tr><tr><td>96 oyuklu V-tabanlı polistiren plaka (işlenmemiş)</td><td>Corning</td><td>3896</td><td>antikor yoğunluğu tayini</td></tr><tr><td>İşlevselleştirilmemiş silika</td><td>boncuklar Bangs Laboratories&nbsp;</td><td>SS06N</td><td>antikor yoğunluğu tayini</td></tr><tr><td>FACS tüpleri</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-959-2A&nbsp;</td><td>Antikor Yoğunluğu Tayini</td></tr><tr><td>QuantumTM MESF boncukları</td><td>Bangs Laboratuvarları</td><td>Değişken</td><td>antikor yoğunluğu tayini</td></tr><tr><td>Kazein&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C0875</td><td>Lipid çift tabakalı hazırlama</td></tr><tr><td>HEPES tamponlu salin +% 1 HSA</td><td>Ev Yapımı</td><td></td><td>Lipid çift tabakalı hazırlama</td></tr><tr><td>Streptavidin ve nbsp;</td><td>Yaşam teknolojileri&nbsp;</td><td>434301</td><td>Lipid çift tabakalı hazırlama</td></tr><tr><td>Floresan etiketli biyotinile protein&nbsp;</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td>Lipid çift katmanlı hazırlama</td></tr><tr><td>ibidi Sticky-Slide VI 0.4</td><td>ibidi&nbsp;</td><td>80608</td><td>Lipid çift tabaka hazırlığı</td></tr><tr><td>25x75 mm cam lamel</td><td>ibidi&nbsp;</td><td>10812</td><td>Lipid çift tabaka hazırlama</td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit (% 30)</td> <td>Fisher Scientic&nbsp;</td><td>BP2633</td><td>Lipid çift tabakalı hazırlama</td></tr><tr><td>Sülfürik asit</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>258105</td><td>Lipid çift tabakalı hazırlama</td></tr><tr><td>D-Biotin</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>B20656</td><td>Lipid çift tabakalı hazırlık</td></tr><tr><td>Lens kağıdı</td><td>VWR ve nbsp;</td><td>54826-001</td><td></td></tr> F <tr><td>Tipi Görüntüleme için Daldırma Yağı</td><td>Leica&nbsp;</td><td>11 513 859</td><td>Görüntüleme için</td></tr><tr><td>A Leica TCS STED mikroskobu</td><td>Leica</td><td></td><td>Görüntüleme için</td></tr></tbody></table>

bir cam destekli planar çift katlı lipid doğal Öldürücü hücre İmmünoloji synapse süper çözünürlüklü görüntüleme

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

Cam destekli düzlemsel lipid çift katmanlı sistem çeşitli disiplinlerde kullanılmıştır. Bu tekniğin en kullanışlı uygulamalarından biri, cam destekli düzlemsel lipid çift katmanlarının yatay bir arayüz oluştururken bir hedef hücrenin yüzeyini taklit etme kabiliyeti nedeniyle immünolojik sinaps oluşumu çalışmasında olmuştur. Süper çözünürlüklü görüntülemedeki son gelişmeler, bilim adamlarının sinaps yapısının ince ayrıntılarını daha iyi görmelerini sağladı. Bu çalışmada, bu ileri tekniklerden biri olan uyarılmış emisyon tükenmesi (STED), desteklenen lipid çift tabakası üzerindeki doğal öldürücü (NK) hücre sinapslarının yapısını incelemek için kullanılmıştır. Burada, takip etmesi kolay bir protokol detaylandırılmıştır: cam destekli çift tabakaların sentezlenmesinde kullanılmak üzere ham sentetik fosfolipidlerin nasıl hazırlanacağı; belirli bir konsantrasyondaki proteinin iki tabakanın bağlanma bölgelerini ne kadar yoğun bir şekilde işgal ettiğinin nasıl belirleneceği; NK hücre aktive edici reseptör CD16'ya karşı antikorlar içeren desteklenen bir lipid çift tabakasının nasıl oluşturulacağı; ve son olarak, NK sinapslarında perforin pozitif litik granüllerin ve filamentli aktinin dağılımına odaklanarak, STED süper çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak bu çift tabaka üzerinde insan NK hücrelerinin nasıl görüntüleneceği. Bu nedenle, cam destekli düzlemsel lipid çift katmanlı sistemi STED tekniği ile birleştirerek, bu kombine tekniğin fizibilitesini ve uygulamasını ve ayrıca NK immünolojik sinapsındaki hücre içi yapıları süper çözünürlükle gösteriyoruz.

Şekil 1, bir lipid iki katmanının üzerinde antikor yoğunluğu sonucunu göstermektedir. ilke akış sitometrisi (A) üzerinden MFI karşı MESF standart eğri için standart boncuk kullanmaktır. Örnek serisi MFI standart eğri kullanılarak MESF dönüştürülmüştür. çift ​​katlı lipid üzerinde antikor yoğunluğu doğrusal antikor konsantrasyonu (B) ile ilişkilidir. cam destek düzlemsel çift katlı lipid NK sinaps 2 gösteri üçlü renkli STED&#39;in görüntü Şekil. Çift katlı lipid Anti-CD16 antikoru F-aktin oluşumunu ve kutuplaşmayı ve NK hücreleri immünolojik sinapsların odak panelinde F-aktin ağ üzerinden perforin penetrasyonunu tetikleyen, birikir. Bu kombine yaklaşım kullanarak, bir temiz doğrudan NK hücre üzerindeki CD16 kümelendirilmesini aynalar SLB içinde, anti-CD16 floresan etiketli microclusters gözlemleyebilirsiniz. Geleneksel konfokal görüntü, CD16 merkezindeki yapısı ile karşılaştırıldığındal küme daha kolay nedeniyle tükenmiş ortam floresan STED&#39;in görüntüde ayırt edilir. Ayrıca, aktin hücre iskeletinin ultrastrüktür önemli ölçüde geliştirilmiş çözünürlük ile görülür. Önceki gözlemlerle 16,17 ile uyumlu olarak, perforin pozitif litik granüller STED&#39;in imajı, çoğunlukla konfokal görüntüde kayıp önemli bir ayrıntı olarak düşük F-aktin yoğunluk bölgeleri üzerinde konumlandırılmış görülür. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52502/52502fig1highres.jpg" /> Çift katlı lipid üzerindeki 3G8 antikor Şekil 1. Yoğunluk. (A) standart serisi için MESF ve MFI arasında doğrusal korelasyon. (B) Protein yoğunluğu ve örnek protein seyreltme serileri için konsantrasyonu arasında doğrusal korelasyon, başına floresan-etiketli protein monomerlerin sayısını gösteren Lipid kaplı si artan konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak birim alanLica boncuk. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52502/52502fig2highres.jpg" /> Düzlemsel bir lipid iki katmanının NK sinapsların Şekil 2. STED&#39;in görüntüleme. Birincil NK hücreleri, SLB içeren biyotinile edilmiş floresan etiketli anti-CD16 (kırmızı) ile uyarılmış sabitlendi, geçirgenleştirildi ve sonra falloidinle (mavi) ve anti-F-aktine ile boyandı (yeşil). Tek bir hücre ilk normal konfokal ayarı altında görüntülü ve ardından STED&#39;in ayarı yapıldı. Konfokal ve STED&#39;in görüntüleri Huygens yazılımı kullanılarak deconvoluted edildi. Ölçek çubuğu, 1 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52502/52502fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonu için burayı tıklayınız.</a>

Burada, immünolojik sinapslar oluşturmak için cam destekli lipid çift katmanlı tekniğin, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobunun süper çözünürlüklü görüntüleme tekniği ile bir kombinasyonunu açıklıyoruz. Bu protokolün amacı, kullanıcılara bu iki tekniği başarılı bir şekilde uygulamak için gerekli talimatları sağlamaktır.

Bir Cam destekli Planar çift katlı lipid Doğal Öldürücü Hücre İmmünoloji Synapse Süper çözünürlüklü Görüntüleme

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Bu prosedürün genel amacı, desteklenmiş lipid çift tabakası üzerindeki doğal katil veya NK hücrelerinin immünolojik sinapslarının süper çözünürlüklü görüntülerinin nasıl başarıyla elde edileceğini göstermektir. Bu işlem, oda slaytları içerisinde NK hücresi aktive edici reseptörü CD 16'ya karşı antikorlar içeren cam destekli düzlemsel bir lipid çift tabakası oluşturularak gerçekleştirilir. Daha önceden izole edilmiş NK hücreleri ardından antikor gömülü düzlemsel lipid çift tabakasına eklenir ve ardından hücreler f aktin ve perforin ile boyanır.Son adım, ortaya çıkan NK hücresi sinapslarının stead mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi ve nihayetinde destekli lipid çift tabaka üzerindeki NK sinapsının görüntülenmesidir. Stead kullanımı, NK hücresi sinapsını gelişmiş ayrıntılarla göstererek aktin hücre iskeletinin ultra yapısının ve düşük F aktin yoğunluğuna sahip bölgeler üzerine konumlanmış perran pozitif litik granüllerin görselleştirilmesine olanak tanır. Dolayısıyla bu tekniğin temel avantajı, cam destekli düz lipid bariyerinin, hedef hücrenin plazma membranını ve bu düz lipid bariyeri üzerindeki proteini taklit edebilmesidir.Yanal olarak hareket edebilirler, bu da immünolojik sinaps oluşumunun mantıksal açıdan çok daha ilgili bir şekilde yeniden canlandırılmasını sağlayabilir. Bu yöntem, araştırmacıların sinaps oluşumunu ticari ve mikroskobik yaklaşımlarla elde edilemeyen bir detayla ve kontrollü bir şekilde görselleştirmelerine olanak tanıyarak immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bir doktora sonrası araştırmacı ve bir lisansüstü öğrencisi, cam destekli düzlemsel lipid çift tabakasının kurulma prosedürünü gösterecektir.İlk olarak, bir beher içerisinde %30 hidrojen peroksiti sülfürik asit ile birle üç oranında karıştırarak 100 mililitre piranha çözeltisi hazırlayın. Kapak lamları temizlenirken, iki adet dikdörtgen 1,5 numara kapak lamını 20 ila 30 dakika boyunca bu çözeltide bekletin. Önceden hazırlanmış 400 mikromolar DOPC lipidleri içeren bir tüpü ve önceden hazırlanmış 80 mikromolar biotin PE lipidleri içeren bir tüpü alın.Argon ile oksijenden arındırılmış yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktararak, buz üzerinde argon tankına taşıyın. DOPC ve biotin PE'yi bir bire oranında birlikte ekleyin. Spesifik hacim deneysel ihtiyaçlara göre değişecektir ancak minimum iki µL olmalıdır.Merdiveni buzdolabına geri koymadan önce, karışım tüpünü ve her bir reaktif tüpünü oksijensiz hale getirin. Temizleme işlemi bittikten sonra, lamel camlarını distile su ile iyice durulayın. Lamel camlarını birkaç dakika boyunca havada kurumaya bırakın, ardından 1,5 µL lipozom karışımı çekin ve bir oda slaytının şerit odacıklarından birine tek bir damla halinde paylaştırın.Hat başına iki damla kullanılması yaygındır ancak zorunlu değildir. Şimdi, kuru lamelliği damlacıkların üzerine hızlı ve etkili bir şekilde yerleştirin; lamel yerleştirildiğinde damlacıkların birleşmemesi için yeterince aralıklı olduklarından emin olun. Ayrıca, damlaların oda duvarlarının kenarlarına değmeden dairesel ve belirgin kaldığından emin olun.Kapağın arasında su sızdırmaz bir mühür oluştuğundan emin olmak için her bir kanalın arasuna ve çevresine sıkıca bastırın. Damlaların konumlarını bir markör kalem kullanarak işaretleyin. Ardından, çift tabakayı bloke etmek için oda içerisinden 100 µL sulu %5 kılıf geçirin.Akış odasında hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Ardından, her bir kanala 333 ng/mL konsantrasyonunda 100 µL streptadin enjekte edin. Oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika inkübe ettikten sonra, her bir kanaldan 3 mL %1 insan serum albümini içeren HEPES tamponlu salin geçirerek yıkama yapın.Fazla streptavidini uzaklaştırmak için, metin protokolünde açıklandığı üzere önceden belirlenmiş protein konsantrasyonunda 100 µL biotinillenmiş floresan işaretli anti CD 16 ekleyin ve 20 ila 30 dakika boyunca karanlıkta inkübe edin. Her bir kanaldan 3 mL %1 insan serum albümini içeren HEPES tamponlu salin geçirerek tekrar yıkayın. Daha sonra, fazla streptavidine bağlanmak ve böylece streptavidinin hücrelere spesifik olmayan bağlanma olasılığını ortadan kaldırmak için oda boyunca 25 nM konsantrasyonda 100 µL D-biotin akıtın.Ardından insan NK hücrelerini sayın ve %1 insan serum albümini içeren HEPES tamponlu salin içerisinde mililitrede 500, 000 konsantrasyonunda yeniden süspande edin. Her kulvar için %1 insan serum albümini içeren üç mililitre daha HEPES tamponlu salin ile oda içerisindeki D biyotini yıkayarak uzaklaştırın. Hücreler istenen konsantrasyonda yeniden süspande edildikten sonra, her kulvara 100 µL ekleyin.Hücre odasını 37 °C'de %5 karbon dioksit içeren bir inkübatörde 30 ila 60 dakika bekletin. Bu inkübasyon süresinin ardından, hücreleri oda sıcaklığında %4 paraformaldehit ile 10 ila 20 dakika boyunca fikse edin. Paraformaldehiti uzaklaştırmak için her kanaldan üç mL fosfat tamponlu salin akıtarak yıkama yapın.Ardından, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe etmeden önce 400 µL bloklama tamponu ekleyin. Sonrasında, iki µL dilüe edilmiş floresan işaretli Phalloidin ve floresan işaretli anti-perforin monoklonal antikor ekleyerek f-aktin ve perforini boyayın; oda sıcaklığında bir saat inkübe ettikten sonra, kanaldan üç mL fosfat tamponlu salin geçirerek yıkama işlemini gerçekleştirin. Kanal görüntüleme işleminin başlaması için hazırdır.stead mikroskobunun gerekli tüm donanım modüllerini açın. Görüntü analiz yazılımını başlatın ve hem rezonans tarama hem de stead modüllerini etkinleştirin. Bu seçimleri yaptıktan sonra, yazılımın başlatılması için yaklaşık üç ila beş dakika bekleyin.Ekranın üst kısmındaki konfigürasyon sekmesine tıklayın, lazer konfigürasyonunu seçin. Ardından beyaz ışığı ve 592 nanometrelik sabit lazerleri açın. 100 x objektifi seçin ve eksitasyon lazer ışınını 592 nanometrelik deplesyon lazeri ile hizalayın.Lazer konfigürasyon modülünü seçin, 592 tüketim lazerini kapatın ve 660 nanometre tüketim lazerini açın. Lamı, lensin üzerindeki tablaya yerleştirin. Beyaz ışık lambasını ve okülerleri kullanarak, belirlenmiş çift katmanlı bölgeye bağlı hücreleri odaklayın.Ardından, konfigürasyon sekmesinin hemen sağındaki veri toplama sekmesine geri dönün. Beyaz ışık sekmesi anahtarına tıklayın, ardından bu modülü açın ve eksitasyon lazer çizgisini uygun dalga boyuna sürükleyin. İstenen dedektörü seçip tespit aralığını ayarladıktan sonra, sol taraftaki toplama araç çubuğunda bulunan sıralı (sequential) düğmesine tıklayarak sol araç çubuğunun alt kısmında sıralı tarama iletişim penceresini açın.Bu özellik, kullanıcının her biri farklı bir renk için farklı bir uyarım ışınına sahip birden fazla sekans eklemesine olanak tanır. Kareler arasında tıklama yapın ve ardından her ek renk için uyarım frekans dedektörünü ve tespit aralığını ayarlayın. Tüm ayarlar optimize edildiğinde, veri toplama sürecini başlatmak için başlat düğmesine basın.Cam destekli düzlemsel lipid çift tabakası üzerindeki NK hücresi sinapsının üç renkli STEAD görüntüsü, kırmızı ile gösterilen anti CD 16 antikorunun lipid çift tabakası üzerinde birikerek F aktin oluşumunu tetiklediğini ve mavi ile gösterilen perforinin odak panelindeki F aktin ağından geçerek kutuplaşmasını ve nüfuz etmesini göstermektedir. Bu birleşik yaklaşım kullanılarak, cam destekli lipid çift tabakası içindeki floresan işaretli anti CD 16 mikro kümeleri net bir şekilde gözlemlenebilir; bu durum, NK hücresi üzerindeki CD 16 kümelenmesini doğrudan yansıtır. Konvansiyonel konfokal görüntü ile karşılaştırıldığında, ortam floresansının azaltılmış olması nedeniyle, CD 16 merkezi kümesinin halka yapısı STEAD görüntüsünde daha kolay ayırt edilmektedir.Ayrıca, aktinle sitoskeletinin ultrastrüktürü önemli ölçüde artırılmış bir çözünürlükle görülmektedir. Önceki gözlemlerle uyumlu olarak, perin pozitif litik granüller düşük F aktin yoğunluğuna sahip bölgelerin üzerinde konumlanmış şekilde görülür. Konfokal görüntüde çoğunlukla kaybolan kritik bir detay STEAD görüntüsünde mevcuttur. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, uygulama doğru şekilde gerçekleştirilirse süreç yaklaşık dört saat sürmektedir.Argon ile oksijeni tekrar tekrar uzaklaştırarak örneğinizin deoksijenize durumunu korumanız ve hücreyi monte ederken lamelle örtü camını örneğinizin üzerine hızla yerleştirip kılıf çözeltisine daldırmanız gerektiğini unutmamak önemlidir.

super-resolution-imaging-natural-killer-cell-immunological-synapse-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Desteklenen düzlemsel bilayers immünolojik sinaps moleküler etkileşimleri modellemek için kullanılabilir güçlü araçlardır. Burada, lipid bilyer üst broşür sinaps oluşumunu modüle ve sinaps oluşumu TIRF mikroskobu kullanarak görselleştirmek için bilinen hücre adezyon proteinleri demirleme için yöntemler göstermektedir.

İmmünolojik Sinapslar ve Kinapse Eğitim Oluşumu için desteklenen Düzlemsel Bilayers

Bu makale toplam iç yansıma floresans (TIRF) mikroskop camı desteklenen düzlemsel bilayers bir HIV-1 zarf kaynaklı virolojik sinaps oluşumu görselleştirmek için bir yöntem açıklanır. Yöntem ayrıca, HIV-1 zarfı ile endüklenen virolojik sinaps oluşumu sırasında meydana gelen sinyal molekülleri aktivasyonu ve dağıtılması algılamak için immünfloresans boyama yöntemi ile kombine edilebilir.

Görüntülemede HIV-1 Zarf bağlı Virolojik Synapse ve Sentetik Lipid Bilayers üzerine Sinyal

Bu videoda, canlı T hücreleri ile antijen sunan hücreler arasındaki etkileşimleri görselleştirmek için kafes ışık tabakası mikroskobu tekniğini açıklıyoruz. Yöntem, hücre-hücre etkileşiminin uzay-zamansal dinamiklerini ortaya çıkaran yüksek çözünürlüklü dört boyutlu görüntüler elde etmek için birleştirilen bir dizi iki boyutlu görüntü elde etmek için ultra ince bir kafes ışık tabakasının etkileşimli bir hücre çifti üzerine odaklanmasını içerir.

Canlı hücrelerde reseptör-ligand etkileşimlerini görselleştirmek için kafes ışık tabakası mikroskobu

Bu video, desteklenen bir lipid çift tabakası (SLB) üzerinde doğal öldürücü (NK) hücrelerde immünolojik sinaps oluşumunu görselleştirmek için bir tekniği göstermektedir. SLB ilk olarak florofor etiketli bir NK hücre aktive edici reseptör ligandı ile etiketlenir, ardından NK hücreleri ile inkübasyon yapılır. Daha sonra, hücreler polimerize aktin ve perforin pozitif litik granüller için boyanır. Bu yaklaşım, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu kullanılarak sinaps oluşumunun...

Desteklenen Bir Lipid Çift Tabakası Üzerinde NK Hücre İmmünolojik Sinaps Oluşumunun Süper Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Bu video, birincil insan T hücreleri ile desteklenen lipid çift katmanları (SLB) arasındaki immün sinaps oluşumunu incelemek için bir in vitro tekniği göstermektedir. T hücresi yüzey proteinleri, bir immün sinaps oluşturmak için SLB üzerinde hareketsiz hale getirilen ilgili ligandlarla etkileşime girer, ardından litik granüllerin sinapsa doğru hareketi izler, bu da floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilir.

Desteklenen Düzlemsel Lipid Çift Katmanları ile T Hücresi Etkileşimini İncelemek İçin Bir İn Vitro Teknik

Burada, cam üzerinde özetlenen NK hücrelerinin sitotoksik immün sinapsı olan iki renkli STED nanoskobu ile görüntüleme protokolünü gösteriyoruz. Bu yöntemi kullanarak, sinaps proteinlerinin ve hücre iskeletinin 100 nm altında çözünürlüğünü elde ediyoruz.

Çift Renkli Zaman-kapılı Uyarılmış Emisyon tükenmesi (STED) Nanoscopy tarafından İmmünoloji Synapse görselleştirme

Protein fonksiyonelleştirilmiş düzlemsel cam destekli lipid çift katmanlarının hazırlanması, içindeki protein hareketliliğinin belirlenmesi ve protein yoğunluklarının ölçülmesi burada gösterilmiştir. Yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe sahip tek çift katmanlı yerleşik florokromların görselleştirilmesine olanak tanıyan, gürültüsü azaltılmış bir Toplam İç Yansıma mikroskobu oluşturmak için bir yol haritası özetlenmiştir.

Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

Adaptif bağışıklık, T hücreleri ile antijen sunan hücreler arasında oluşan dinamik 'immünolojik sinapslar' tarafından kontrol edilir. Bu protokol, endotel hücrelerinin hem az çalışılmış fizyolojik APC'ler hem de yeni bir 'düzlemsel hücresel APC modeli' türü olarak araştırılması için yöntemleri tanımlar.

Görüntüleme İmmünoloji Synapse Dynamics için bir Endotel Hücre Modeli Düzlemsel

Protokol düzlemsel lipid bilayers kullanarak sinaptik arabirimleri oluşturmak için birincil poliklonal insan T hücreleri yeteneklerini çalışmaya bir teknik anlatılmaktadır. İnsan birincil T hücreler lenf düğümleri ve periferik kan elde fark synapse oluşumu yeteneğini göstermek için bu tekniği kullanın.

Periferik kan ve lenf dokusu birincil insan T hücre sinaptik arabirimi değerlendirilmesi

Bu protokolün amacı, canlı hücrelerdeki yüzey reseptör dinamiklerini dört boyutlu olarak görselleştirmek için Kafes Işık Sayfası Mikroskobu'nun nasıl kullanılacağını göstermektir. Burada CD4+ primer T hücrelerindeki T hücre reseptörleri gösterilmiştir.

Yüzey T-Hücre Reseptör Dinamiklerini Dört Boyutlu Olarak Kafes Işık Sayfası Mikroskobu Kullanarak Görselleştirme

Bu protokol hem immünolojik sinaps oluşumunu hem de sonraki polarize salgı trafiğini immünolojik sinapsa doğru görüntüler. Hücresel konjugates bir süperantijen-darbeli Raji hücre (bir antijen sunan hücre olarak hareket) ve Jurkat klonu (bir efektör yardımcı T lenfosit olarak hareket) arasında kuruldu.

İnsan İmmünolojik Sinaps Görüntüleme

Öğrenin, cam destekli planar çift katlı lipid kullanarak NK hücre immünolojik sinapslarını STED mikroskobisiyle süper çözünürlüklü görüntüleme yöntemini. Bu teknik, aktin sitoskeleton ve lizozom granüllerinin ultra yapısını detaylı incelemenizi sağlar.

Bir Cam destekli Planar çift katlı lipid Doğal Öldürücü Hücre İmmünoloji Synapse Süper çözünürlüklü Görüntüleme

Daha fazla video keşfet