Bir Cam destekli Planar çift katlı lipid Doğal Öldürücü Hücre İmmünoloji Synapse Süper çözünürlüklü Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, desteklenen lipid çift tabakası üzerindeki doğal öldürücü veya NK hücrelerinin immünolojik sinapslarının süper çözünürlüklü görüntülerinin nasıl başarılı bir şekilde yakalanacağını göstermektir. Bu, NK hücre aktive edici reseptör CD 16'ya karşı antikorlar içeren cam destekli düzlemsel lipid çift tabakasının oda slaytlarında oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Önceden izole edilmiş NK hücreleri daha sonra düzlemsel antikor gömülü lipid çift tabakasına eklenir, ardından hücrelerin f aktin ve perforin ile boyanması takip edilir.

Son adım, elde edilen NK hücre sinapslarının stead mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi ve sonuçta NK sinapsının desteklenen lipid çift tabakası üzerinde görüntülenmesidir. Stead kullanmak, NK hücre sinapsını gelişmiş ayrıntılarla gösterir, bu da aktin hücre iskeletinin ultra yapısının ve düşük F aktin yoğunluğuna sahip bölgeler üzerinde konumlandırılmış perran pozitif litik granüllerin görselleştirilmesine olanak tanır. Dolayısıyla, bu tekniğin ana amacı, cam destekli düz lipid bariyerinin, bu düz lipid bariyeri üzerindeki protein olan tuck hücresinin artı zarını taklit edebilmesidir.

Yanal olarak hareket edebilirler, bu da immünosinaps ile mantıksal olarak çok ilgili oluşumu daha iyi özetleyebilir. Bu mesaj, immünoloji alanındaki kilit Hıristiyanların cevaplanmasına yardımcı olabilir ve araştırmacıların, ticari ve mikroskobik yaklaşımlar kullanılarak elde edilemeyen sinaps oluşumunu kontrol edici bir şekilde ayrıntılı bir şekilde görselleştirmelerine olanak tanır. Bir doktora sonrası bursiyer resim ve bir yüksek lisans öğrencisi hibesi, cam destekli düzlemsel lipid çift tabakasını monte etme prosedürünü gösterecektir.

İlk olarak, bu çözeltiye% 30 hidrojen peroksit ile sülfürik asit ile bir ila üç oranında karıştırarak 100 mililitre piranha çözeltisi hazırlayın. Kapak fişleri temizlenirken 20 ila 30 dakika boyunca iki adet dikdörtgen numara 1.5 kapak fişi yerleştirin. Önceden hazırlanmış 400 mikromolar DOPC lipidinden bir tüp ve önceden hazırlanmış 80 mikromolar biotin PE lipidinden bir tüp alın.

Argon ile yeni bir mikro santrifüj tüpünü deoksi oksijenlendirdikten sonra bunları buz üzerinde argon tankına taşıyın. DOPC ve biotin PE'yi bire bir oranında bir araya getirin. Spesifik hacim deneysel ihtiyaçlara göre değişecektir, ancak en az iki mikrolitre olmalıdır.

Her deoksi, merdiveni buzdolabına geri göndermeden önce karışım tüpünü ve tek tek reaktif tüplerini oksijenlendirir. Temizlik bittikten sonra, kapak fişlerini damıtılmış suyla iyice durulayın. Kapak kızaklarını birkaç dakika havayla kurumaya bırakın, ardından 1,5 mikrolitre lipozom karışımını çekin ve tek bir damlada bir hazne kaydırağının şerit odalarından birine alikot yapın.

Şerit başına iki damla kullanılması tipiktir ancak gerekli değildir. Şimdi, hızlı ve verimli bir şekilde, kuru örtü kızağını damlacıkların üzerine yerleştirin, örtü fişi yerleştirildikten sonra birleşmemeleri için damlaların yeterince aralıklı olduğundan emin olun. Ayrıca, damlaların oda duvarlarının kenarlarına dokunmadan dairesel ve iyi tanımlanmış kaldığından emin olun.

Kapak arasında su geçirmez bir sızdırmazlık sağlamak için her şeridin arasına ve çevresine sıkıca bastırın. Kaydırın ve kaydırın, bir işaretleyici kalem kullanarak damlaların konumlarını işaretleyin. Ardından, çift tabakayı bloke etmek için hazneden 100 mikrolitre sulu% 5 muhafaza geçirin.

Akış odasında kabarcık olmadığından emin olmaya çalışın. Daha sonra her şeride mililitre başına 333 nanogram konsantrasyonda 100 mikrolitre strept adin enjekte edin. Oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika inkübe ettikten sonra, her şeritten üç mililitre tamponlu salin ve %1 insan serum albümini geçirerek yıkayın.

Fazla tritini çıkarmak için, karanlıkta 20 ila 30 dakika inkübasyonun ardından metin protokolünde tarif edildiği gibi daha önce belirlenen protein konsantrasyonunda 100 mikrolitre biyotinile floresan etiketli anti CD 16 ekleyin. Her şeritten üç mililitre tamponlu tamponlu salin geçirerek% 1 insan serum albümini geçirerek tekrar yıkayın. Daha sonra, fazla STR tabinini bağlamak ve böylece STR tabininin hücrelere spesifik olmayan bağlanma şansını ortadan kaldırmak için hazneden 25 nanomolar konsantrasyonda 100 mikrolitre D biotin akıtın.

Daha sonra insan NK hücrelerini sayın ve% 1 insan serum albümini ile tamponlanmış salin yığınlarında mililitre başına 500.000 konsantrasyonda yeniden süspanse edin. D biyotinini, şerit başına% 1 insan serum albümini ile üç mililitre yığın tamponlu salin ile hazneden yıkayın. Hücreler istenen konsantrasyonda yeniden süspanse edildikten sonra, her şeride 100 mikrolitre ekleyin.

Odayı 30 ila 60 dakika boyunca 37 derece Santigrat derece% 5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. Bu inkübasyon süresinden sonra, hücreleri oda sıcaklığında 10 ila 20 dakika boyunca% 4 paraform aldehit ile sabitleyin. Paraform aldehiti çıkarmak için her şeritten üç mililitre fosfat tamponlu salin geçirerek yıkayın.

Ardından, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe etmeden önce 400 mikrolitre engelleme tamponu ekleyin. Daha sonra, iki mikrolitre seyreltilmiş floresan etiketli Phin ve floresan etiketli anti perran monoklonal antikor ekleyerek f aktin ve perforini boyayın, yıkamadan önce üç mililitre fosfat tamponlu salini hazneden geçirerek oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Oda, görüntülemenin başlaması için hazırdır.

Stead mikroskobunun gerekli tüm donanım modüllerini açın. Görüntü analizi yazılımını başlatın ve hem rezonans tarama hem de sabit modülleri etkinleştirin. Bu seçimleri yaptıktan sonra, yazılımın başlaması için yaklaşık üç ila beş dakika bekleyin.

Ekranın üst kısmındaki yapılandırma sekmesine tıklayın, lazer yapılandırmayı seçin. Ardından beyaz ışığı açın ve 592 nanometre lazerleri ayarlayın. 100 x objektifi seçin ve uyarma lazer ışınını 592 nanometre tükenme lazeri ile hizalayın.

Lazer yapılandırma modülünü seçin, 592 tükenme lazerini kapatın ve 660 nanometre tükenme lazerini açın. Slaytı lensin üzerindeki sahneye yerleştirin. Beyaz ışık lambasını ve oküler kullanarak sınırları belirlenmiş iki katmanlı bölgeye bağlı hücreleri odak noktasına getirin.

Ardından, doğrudan yapılandırma sekmesinin sağındaki alım sekmesine dönün. Beyaz ışığa geç sekmesine tıklayın ve ardından bu modülü açın ve uyarma lazer çizgisini uygun dalga boyuna sürükleyin. İstenen dedektörü seçtikten ve algılama aralığını ayarladıktan sonra, sol taraftaki araç çubuğunun altındaki sıralı tarama diyaloğunu getirmek için sol taraftaki araç çubuğundaki sıralı düğmeye tıklayın.

Bu, kullanıcının her biri farklı bir renk için farklı bir uyarma ışınına sahip birden fazla dizi eklemesine olanak tanır. Çerçeveler arasında tıklatın ve ardından her ek renk için uyarma frekansı dedektörünü ve algılama aralığını ayarlayın. Tüm ayarlar optimize edildikten sonra, satın alma işlemine başlamak için başlat düğmesine basın.

NK hücre sinapsının cam destekli düzlemsel lipid çift tabakası üzerindeki üçlü renkli sabit görüntüsü, kırmızı ile gösterilen anti CD 16 antikorunun, F aktin oluşumunu tetikleyen lipid çift tabakası üzerinde biriktiğini ve mavi ile gösterilen perforinin fokal paneldeki f aktin ağı boyunca polarizasyonunu ve penetrasyonunu göstermektedir. Bu birleşik yaklaşımı kullanarak, NK hücresi üzerindeki CD 16'nın kümelenmesini doğrudan yansıtan cam destekli lipid çift tabakası içinde floresan etiketli anti CD 16'nın mikro kümeleri temiz bir şekilde gözlemlenebilir. Konvansiyonel konfokal görüntü ile karşılaştırıldığında, CD 16 merkezi kümesinin halka yapısı, tükenmiş ortam floresansı nedeniyle sabit görüntüde daha kolay ayırt edilir.

Ayrıca, aktin hücre iskeletinin ultra yapısı, önemli ölçüde geliştirilmiş çözünürlükle görülür. Önceki gözlemlerle tutarlı olarak, perin pozitif litik granüllerin düşük F aktin yoğunluğuna sahip bölgeler üzerinde konumlandırıldığı görülmektedir. Yerine görüntüde, konfokal görüntüde çoğunlukla kaybolan çok önemli bir detay Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, içinden geçerken düzgün bir şekilde yapılırsa yaklaşık dört saat içinde yapılabilir.

Oksijeni argon ile tekrar tekrar değiştirerek ve hazneyi monte ederken, kapak kızağını numunenizin üzerine hızlı bir şekilde yerleştirerek ve muhafaza çözeltisine daldırarak numunenizi oksijenden arındırmayı unutmamak önemlidir.