Name: Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Öğrenin, yüksek çözünürlüklü erime analizi ile PCR kullanarak Danio rerio genotiplemesini hızlı ve verimli şekilde gerçekleştirmeyi. Bu yöntem, genetik varyasyonları tespit etmek için hassas ve güvenilir bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz tavsiye ve teknik yardım için Blaschke, Grunwald ve Wittwer laboratuarları üyelerine teşekkür ederim. Bu çalışma JLB için PCMC Vakfı, NIH R01 MH092256 ve DP2&#39;deki MH100008 ve Dimes Vakfı araştırma bursu # 1-FY13-425, Mart, tarafından desteklenmektedir.

1.. DNA hazırlanması <ol><li> 50 mM KCI, 10 mM Tris-HCl pH 8.3,% 0.3 Tween 20,% 0.3 NP-40: DNA lizis tamponu hazırlayın. Kullanım 12 günde 1 mg / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar proteinaz K ilave taze. </li><li> Doku toplama: <ol><li> Yetişkin balık yüzgeç klibi için: <ol><li> Balık anestezisi: 0.004% MS-222 (tricaine) çözümü de balık yerleştirin. Solungaç hareketi yavaşlatır kadar bekleyin. </li><li> 5-10 Kimwipes bir yığın balık koymak ve steril bir jilet ile kuyruk yüzgecinin, yaklaşık 2-3 mm, küçük bir parça kesti. </li><li> Hızla geri kazanımı için temiz su ile etiketlenmiş bir tankta balık yer, özenle fin klip içerecek tankı ve ilgili tüpü hem etiket. Su değiştirin ve her gün balık yemi. </li><li> Steril bir pipet ucu ile kanat klibi almak ve 100 ul DNA liziz tamponu ile dolu bir tüp içine aktarın. </li><li> Pipet atmak ve bir kesici kabın içine jilet atmak. </li></ol></li><li> Embriyo kuyruk klibi için: <ol><li> % 0.004 MS-222 (tricaine) çözelti içine embriyolar yerleştirin. 2 dk bekleyin. </li><li> Bir tahlil mikroskobu altında forseps ile kuyruk bir parça kesin. </li><li> 30 ul DNA liziz tamponu ile dolu bir etiketli tüp içine kuyruk koyun. </li><li> Hızla 100 ul% 4 paraformaldehid içeren bir tüp içine embriyo koydu. </li><li> Embriyo ve bunlara karşılık gelen kuyruk tüpleri ile Etiket tüpler. </li><li> Tespit için 4 ° C sıcaklıkta gece boyunca embriyolar ile tüpleri saklayın. </li><li> Kirlenmeyi en aza indirmek için her bir embriyonun arasında Milli-Q su ve Kimwipes kullanarak forseps temizleyin. </li></ol></li><li> Bütün embriyo için: <ol><li> % 0.004 MS-222 (tricaine) çözelti içine embriyolar yerleştirin. 2 dk bekleyin. </li><li> DNA, 100 ul lizis tamponu ile doldurulmuş bir tüp içinde 1-5 embriyolar koyun. Dechorionation gerekli değildir. </li></ol></li></ol></li><li> DNA sindirim 55 ° C&#39;de doku (fin veya kuyruk klipleri ya da embriyolar) ile inkübegecede 12 4 saat kadar için. </li><li> Proteinase K inaktive 15 dakika 12 boyunca 95 ° C&#39;ye kadar ısı boruları. DNA PCR için hemen kullanılabilir veya en fazla 3 ay boyunca -20 ° C&#39;de saklanmalıdır. </li></ol> 2. PCR <ol><li> Tasarım Primerler elle veya primer tasarım yazılımı (örneğin Lightscanner Primer Tasarım Yazılımı-Biofire) tarafından. HRMA için PCR ürünleri genellikle 50-200 bp, SNP tespiti için daha küçük PCR ürünleri, tipik haliyle, 50-80 bp olması gerekir. </li><li> PCR <ol><li> 96 kuyucuklu veya 384 oyuklu bir plaka içerisinde PCR reaksiyonu yapın. </li><li> 10 ul toplam hacim kullanın: 4 ul LightScanner ana karışımı (0.1 U sıcak başlangıç ​​Taq-polimeraz AB, tampon, 0.2 mM dNTPler, 2 mM magnezyum klorür ve 1x floresan çift bükümlü DNA-bağlama boya); 5 pmol her bir primer, ve yetişkin kuyruk fin ya da embriyonik kuyruk 13 3 ul genomik DNA ekstre 1 ul genomik DNA şablonu. </li><li> 30 ul mineral yağ ile kapak örnekleri. </li&gt; <li> Optik-şeffaf yapışkan conta ile kapak plakası. </li><li> PCR çevrim koşulları tipik şartlar 95 ° C&#39;de 5 dakika ve 10 saniye 30 döngü için 95 ° C olan optimize, 60 ° C&#39;de 25 saniye, 72 ° C&#39;de 30 saniye, 30 saniye boyunca 95 ° C ile biten ve soğutuldu 15 ° C. </li><li> Mağaza PCR 4 ° C&#39;de plakalar veya HRMA doğrudan devam etmektedir. </li><li> PCR&#39;nin ilk duruma getirilmesi sırasında, agaroz jel elektroforez kullanılarak boyutu analizi ile teyit eden PCR ürünü ve PCR ürününün dizilimi yolu ile değerlendirildiler. </li></ol></li></ol> 3. HRMA <ol><li> Isı plakaları <ol><li> Bir eriyik analiz sisteminde plaka koyun. </li><li> (LightScanner Yazılım Çağrı-IT 2.0) yazılımını açın. </li><li> 60-95 ° C arasında ısı plakaları </li><li> Yeni bir veri depolama dosyası oluşturun. </li></ol></li><li> HRMA verileri analiz (Şekil 2). Analiz pek çok aşamadan sonra mümkündür. Bu veri m en yaygın olarak kullanılan bir dizi göstermektediranipulations. <ol><li> Alt Küme ayarı Altkümesini sekmesini tıklatın. Örnekleri ile kuyu seçin. </li><li> Normalleştirme <ol><li> Sol paneldeki Normale sekmesini seçin. Floresan varyans ortadan kaldırmak için, elle öncesi (başlangıç) olarak paralel çift çizgi konumlandırmak ve sonrası (son)-eriyik bölgeleri (Şekil 2C, ok uçları) gösterildiği gibi ve 1 ve 0 tüm örneklerin eritmek ve post-eriyik floresan sinyalleri normalleştirmek sırasıyla 14. </li><li> Erime bölgesi öncesi ve sonrası eriyik hatları arasındaki bölgede, ama seçilmemiş böylece hatlarının konumlandırma ayarlayın. Genel olarak, Aşağı Min ve Aşağı Max (ve Yukarı Min ve Üst Max) sıcaklık hatları birbirinden yaklaşık 1 ° C konulmalıdır. </li><li> Normalleştirilmesi için sıcaklık pozisyonlar seçin tüm örnekler (eritmek bölge ve en az ya da post-eritme bölgesi için bir (% 0) floresan için maksimum veya tam (% 100) sahip olacak şekilde floresan kutuplu olarak en iyi olarakmak). Normalizasyon erime noktası ve 0 en az floresan de erime noktasından daha sonra yakın bir yatay çizgi kadar uzanır 1 en yüksek floresan da yakın bir yatay bir çizgi ile sonuçlanacaktır, 1 üzerinde veya 0 ° C&#39;nin altındaki floresan seviyeleri olmamalıdır . Örneğin, Şekil 2C&#39;de, 79-80 ° C&#39;lik sıcaklık aralıkları kullanılarak önceden eritilmesi eğrileri normalize </li></ol></li><li> Gruplama / Kümelenme Erime sıcaklığı (Şekil 2C, yeşil kutu) dayalı genotipleri ayırt. Gruplamasını seçin. <ol><li> Gruplama bölümünde Standartları seçim listesinden Autogroup seçin. </li><li> Gruplama bölümünde Hassasiyet seçim listesinden sırasıyla tek geçişler veya çoklu geçişler ile profiller eritmek için Normal veya Yüksek seçeneğini seçin. </li><li> Seç ComputeGruplama bölümünde gruplar. </li><li> Dosya menüsüne gidin ve sonuçları kaydetmek için Kaydet&#39;i tıklatın. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li>
<li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Sander, J. D., Cade, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).</li>
<li>Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+gene+targeting+in+zebrafish+using+customized+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).</li>
<li>Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+melting+analysis+%28HRMA%29%3A+more+than+just+sequence+variant+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutation%22%5BJournal%5D)">High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening.</a> Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).</li>
<li>Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+methods+for+generating+and+detecting+locus-specific+mutations+induced+with+TALENs+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome.</a> PLoS Genet. 8 (8), (2012).</li>
<li>Liew, M., Pryor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+of+single-nucleotide+polymorphisms+by+high-resolution+melting+of+small+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons.</a> Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).</li>
<li>Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+Amplicon+DNA+melting+analysis+for+mutation+scanning+and+genotyping%3A+cross-platform+comparison+of+instruments+and+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes.</a> Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).</li>
<li>Carrillo, J., Martínez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melting+analysis+for+the+identification+of+novel+mutations+in+DKC1+and+TERT+genes+in+patients+with+dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cell.+Mol.+Dis.%22%5BJournal%5D)">High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita.</a> Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).</li>
<li>Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melt+analysis+%28HRMA%29%3B+a+viable+alternative+to+agarose+gel+electrophoresis+for+mouse+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping.</a> PloS one. 7 (9), (2012).</li>
<li>Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIK3CA+hotspot+mutation+scanning+by+a+novel+and+highly+sensitive+high-resolution+small+amplicon+melting+analysis+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method.</a> J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).</li>
<li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li>
<li>Xing, L., Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+foxP2+zinc+finger+nuclease+mutant+has+normal+axon+pathfinding%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding.</a> PloS one. 7 (8), (2012).</li>
<li>Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+High+Resolution+Melting+analysis+as+an+alternate+tool+to+screen+for+risk+alleles+associated+with+small+kidneys+in+Indian+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns.</a> BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).</li>
<li>Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+Expanded+instrument+comparison+of+amplicon+DNA+melting+analysis+for+mutation+scanning+and+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping.</a> Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).</li>
<li>Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Genotyping+by+Amplicon+Melting+Analysis+Using+LCGreen%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen.</a> Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).</li>
<li>Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+closed-tube+methylation-sensitive+high+resolution+melting+assay+%28MS-HRMA%29+for+the+semi-quantitative+determination+of+CST6+promoter+methylation+in+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples.</a> BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).</li>
<li>Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+two+broad-range+PCR+assays+for+pathogen+detection+in+positive-blood-culture+bottles%3A+PCR-high-resolution+melting+analysis+versus+PCR-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry.</a> J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

HRMA ile birlikte PCR Zebra balığı genotiplendirebilmek güçlü bir teknolojidir. Bu yaklaşımın avantajı, hız, sağlamlık, ve hatta nokta mutasyonları tespit etmek için hassasiyet vardır. Tüm protokol, fin-klip için eritilerek eğri analizi, tek bir kişi tarafından daha az sekiz saat içinde gerçekleştirilebilir. Buna ek olarak, teknik, yüksek miktarda madde taraması için müsait olan, etidyum bromid kullanımını gerektirmeyen ve kirlenme sorunları en aza indirir ve her PCR analizi adımları için kapatılır. <p class="jove_c...

Zebrafish (Br.rerio) yaygın gelişimi ve hastalığın modelleme çalışmaları için kullanılan bir omurgalı bir model sistem. Son zamanlarda çok sayıda transgenik ve mutasyon zebrabalıkları teknolojileri geliştirilmiştir. Genellikle Tol2 transpozon sistemi 1 göre hızlı transgenesis teknikleri, birden fazla DNA fragmanı düzeneği 2 için gelişmiş klonlama seçenekleri ile kombine edilmiştir. Çinko-Parmak nükleazlar (ZFNs) ve transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlar (TALENS) zebra balığı 3,4 hem somatik hem de germlin hücrelerinde mahalleri hedeflemek üzere kullanılmıştır. Bu teknikler, etkili bir şekilde yüksek frekanslı mutasyon oluşturulması ve germ-hattı iletim 3,4 olan, genetik olarak modifiye edilmiş hayvanlar oluşturabilir. Bu ilerlemelere rağmen, zebrabalıkları geleneksel genotip teknikleri mütajeni ve Transgenesis araçlarının tam gücünü sınırlamak. PCR bazen KISITLAMAL ile birlikte, jel elektroforezi, ardındann enzim sindirimi, yaygın genom değişiklik tespit etmek için kullanılır, ancak zaman alıcı ve küçük eklemeleri veya silmeleri tanımlamak için daha az hassas olmasıdır. TaqMan probu tahliller yüksek başlangıç ​​maliyetleri ve dikkatli optimizasyon gerektirir. PCR ürünlerinin dizileme birkaç gün sürebilir ve büyük ölçekli tarama için pratik değildir yapabilirsiniz. RFLP (RFLP) analizi sadece kısıtlama enzimi tanıma siteleri, sınırlı etkileyen SNP ayırt edebilir. Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRMA), kapalı-tüp post-PCR analiz yöntemi, hızlı, hassas, ucuz ve örneklerin çok sayıda tarama için müsait bir yeni geliştirilen bir yöntemdir. HRMA SNP, mutasyonlar ve transgenlerin 5-7 tespit etmek için kullanılabilir. HRMA çift sarmallı DNA &#39;ların termik denatürasyona göre ve her bir PCR amplikonu karakteristik benzersiz bir ayrışma (erime) 5 vardır. Numuneler nedeniyle t ayrımcılık olabiliro Farklı nükleotid bileşim olup, GC içeriği veya uzunluğu, tipik olarak, bir floresan boya ile kombinasyon halinde, sadece çift sarmallı DNA 8 bağlar. Böylece, HRMA farklı erime eğrisi özelliklerine göre farklı genotipleri ayırt edebilir. HRMA düşük maliyetli reaktifler kullanır ve bir tek aşamalı post-PCR işlemi olduğu için, yüksek verimli stratejileri için kullanılabilir. HRMA böylece analiz aşağıdaki PCR amplikonları diğer uygulamalar için de kullanılabilir, yıkıcı olmayan bir. HRMA hücre çizgileri, fare ve insan da dahil olmak üzere pek çok, 9-11 organizmalar ve sistemleri, uygulanmıştır. Kullanımı son çinko parmak nükleazlara (ZFNs) ve TALENS 6,12,13 neden mutasyonları tespit etmek için zebrabalıkları tarif edilmiştir. Bu yazıda, (Şekil 1), embriyonik ve yetişkin zebrabalıkları PCR tabanlı HRMA gerçekleştirmek için nasıl açıklar. Bu protokol si de dahil olmak üzere, SNP, transgenlerin ve mutasyonları tespit etmek için uygundurngle temel-çift değişiklikler, eklemeler veya silmeler.

<table><tbody><tr><td>100 Reaksiyon LightScanner Master Karışımı</td><td>BioFire</td><td>HRLS-ASY-0002</td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Sert Kabuklu PCR 96 kuyulu BLK/WHT Plakaları</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>HSP9665</td><td>www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Microseal 'B' Yapışkan Contalar</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>www.bio-rad.com 96 kuyulu LightScanner Cihazı</td>: <td>BioFire</td><td>LSCN-ASY-0040</td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Call-IT 2.0 ile LightScanner Yazılımı</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Yüksek Çözünürlüklü Erime Analizi 2.0</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>LightScanner Primer Tasarım Yazılımı</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Vector NTI Yazılımı</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>www.invitrogen.com</td></tr><tr><td>Trikain</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

yüksek çözünürlüklü melt analizi ile pcr kullanarak hızlı ve verimli zebra genotiplemesi

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebra balığı, geliştirme eğitimi hastalık modelleme ve uyuşturucu taraması gerçekleştirmek için güçlü bir omurgalı model sistem. En son genetik araçlar çeşitli mutasyonlar neden olan ve transgenik çizgiler üretmek için çeşitli stratejiler de dahil olmak üzere, getirilmiştir. Bununla birlikte, büyük ölçekli tarama zaman alıcı ve emek yoğun olan geleneksel genotipleme yöntemleri ile sınırlıdır. Burada yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRMA) ile birlikte PCR ile Zebrafish genotipleri analiz etmek için bir tekniği açıklar. Bu yaklaşım, kirlenme eserler düşük riski, hızlı, hassas ve ucuzdur. HRMA ile PCR ile genotipleme yüksek verimli tarama protokolleri de dahil olmak üzere, embriyo veya yetişkin balıklar için kullanılabilir.

Protokol (iş akış diyagramı Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir), birkaç gün boyunca tek bir gün boyunca gerçekleştirilen ya da kademeleri içinde ayrılabilir. DNA ekstraksiyon PCR amplikonların eriyik ve analiz takip eder. Amplikonun eriyik için sıcaklıklar büyüklüğü ve GC-içeriğine bağlıdır, ancak genellikle başlangıç ​​ve 50 ˚ C ve 95 ° C ˚ uç sıcaklıkları (Şekil 2A ve 2B) uygundur. Eriyik gerçekleştirildiğinde, floresan erime eğrilerinin analizi, genellikle kullanan önces...

Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRMA) ile bir araya PCR zebrafish genotip için hızlı ve etkili bir yöntem olarak gösterilmiştir.

Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Bu prosedürün genel amacı, zebrafish'lerdeki farklı genotipleri, mutasyonları veya transgenleri hızlı bir şekilde taramaktır. Bu işlem, öncelikle ince doku örneklerinden DNA ekstre edilerek ve ardından bu DNA'nın PCR ile amplifiye edilmesiyle gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, erime eğrileri kaydedilirken PCR amplikonlarının denatüre edilmesidir; bu eğriler daha sonra yazılım aracılığıyla analiz edilir.Sonuç olarak, veriler farklı genotipler için ayırt edilebilir erime eğrileri göstermektedir. Bu tekniğin jel elektroforezi hacimli PCR gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı; tek nükleotid değişimlerine, küçük insersiyonlara ve tüm delesyonlara karşı duyarlı olması, ayrıca hızlı ve güvenilir olmasıdır. Bu teknik, zebra balıklarının hızlı ve etkili bir şekilde genotiplemesi için kullanılabileceği gibi, hücre hatları, fareler ve diğer hayvanlar da dahil olmak üzere diğer sistemlere ve model organizmalara da uygulanabilir.DNA hazırlama gününde, lizis tamponuna mililitre başına bir miligram konsantrasyonunda taze proteinaz K ekleyin. Doku, yetişkin bir balıktan ince bir klips kullanılarak veya embriyonik bir balıktan toplanabilir. Öncelikle balığı Trica solüsyonunda anestezi altına alın.Solungaç hareketleri yavaşlayana kadar bekleyin. Ardından balığı bir peçete yığınının üzerine koyun ve steril bir jiletle, kuyruk yüzgecinden yaklaşık iki ila üç milimetre uzunluğunda küçük bir parça kesin. Balığı iyileşmesi için taze su içeren etiketli bir tanka hızlıca yerleştirin.Fin klibini steril bir pipet ucuyla alın ve 100 µL DNA lizis tamponu ile doldurulmuş bir tüpe aktarın. Hem hayvanın tankını hem de tüpü etiketlediğinizden emin olun; toplanan tüm dokuları 55 °C'de en az dört saat ve gece boyunca inkübe edin. Tüpleri 95 °C'de 15 dakika ısıtarak ACE K proteinini inaktive edin.Bu örnekler PCR için hemen kullanılmalıdır, ancak -20 °C'de üç aya kadar saklanabilir. PCR işlemini her reaksiyon için 96 veya 384 kuyucuklu bir plakada gerçekleştirin. Bir µL'den fazla erişkin DNA'yı, dört µL light scanner ile birleştirin.Her biri beş pikomolar nihai konsantrasyonda floresan prob ve primerler içeren master mix. Eğer DNA bir embriyodan elde edilmişse, üç mikrolitreye kadar kullanın. Reaksiyonların üzerini 30 mikrolitre mineral yağ ile kapatın ve ardından kapaklarını sıkıca kapatın.Ardından, doldurulmuş PCR plakayı optik olarak şeffaf bir yapışkan mühürle kapatın. Şimdi PCR döngü koşullarını optimize edin. Tipik bir koşul seti, beş dakikalık bir eritme süresi ile başlar.Bunu, on saniyelik denatürasyon, 25 saniyelik bağlanma süresi ve 30 saniyelik uzama aşamalarından oluşan 30 PCR döngüsü takip eder. Reaksiyon, ek olarak 32. denatürasyon aşamasıyla sona ermeli ve ardından 15 °C'ye soğutulmalıdır. Yazılımdaki erime analizi sistemine yerleştirerek PCR plağını analiz edin.Sıcaklığı ayarlayın ve yeni bir veri depolama dosyası oluşturun. Bir alt küme belirleyin. Ekranın sol alt tarafında bulunan numuneli kuyucukları seçin.Floresan varyantlarını gidermek için normalize sekmesini seçin. Paralel çift çizgiyi prem, melt ve post melt bölgelerinde manuel olarak konumlandırın ve tüm örneklerin premel ve post melt floresan sinyallerini sırasıyla bir ve sıfıra normalize edin. Ardından, önce gruplandırmayı seçerek genotipleri erime sıcaklıklarına göre ayırt edin.Ardından standart seçim listesinden auto group seçeneğini belirleyin. Gruplandırma bölümü altında, tek geçişli erime profilleri için normal, çoklu geçişli erime profilleri için ise high seçeneğini belirleyin. Bu seçenekler, gruplandırma bölümündeki hassasiyet seçim listesinde yer almaktadır.Şimdi gruplandırma bölümünden hesaplama gruplarını seçin, ardından dosya menüsüne giderek sonuçları kaydetmek için kaydet'e tıklayın. Protokol tek bir günde gerçekleştirilebileceği gibi, birkaç güne yayılan adımlara da ayrılabilir. PCR gerçekleştirilirken, amplikonun erime sıcaklıkları boyuta ve GC içeriğine bağlıdır; ancak erime işlemi gerçekleştirildiğinde genellikle 60 °C başlangıç ve 95 °C bitiş sıcaklıkları uygundur.Floresan erime eğrilerinin analizi, genellikle ön erime ve son erime bölgelerinin standart olarak kullanılmasıyla farklı örnek eğrilerindeki varyasyonun normalizasyonunu gerektirir. Bu işlem, floresan varyasyonunun küçük deneysel farklılıklara bağlı olduğu farklı örneklerden elde edilen sonuçların karşılaştırılmasını iyileştirir. Normalizasyon için kullanılan her bir sıcaklık çizgisi çifti, yaklaşık olarak bir °C arayla yerleştirilmelidir.Veriler, erime eğrisi profili dosyalarını gösteren bir grafik ile veya HRMA analizi sonrası bir referans numune ile karşılaştırmalı olarak çıkarılmış fark grafiği ile iki şekilde temsil edilebilir; bu sayede mutasyonlar veya transgenler tespit edilebilir. EIF2B5 genindeki iki farklı mutasyon, kırmızı ve mavi eğrilerle belirtilmiştir. Bu mutant numuneler, standart yabanıl tip eğrileriyle karşılaştırıldığında erime eğrisi şekillerindeki veya floresan değişimlerindeki belirgin farklarla tanımlanır.Tek bir embriyo koleksiyonundaki dört farklı genotip örneği, yöntemin gücünü ve hassasiyetini göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik sekiz saatten kısa sürede tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, zebrafish genotiplerinin verimli ve geniş ölçekli taraması için HRMA'nın nasıl uygulanacağı konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız.

rapid-efficient-zebrafish-genotyping-using-pcr-with-high-resolution

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makalede, zebra balığı kuyruk klipsinden DNA ekstraksiyonu açıklanmaktadır. Protokol, zebra balığı genotiplerini analiz etmek için hızlı ve verimli bir yöntem göstermektedir.

Kuyruk Klibinden DNA Ekstraksiyonu: Zebra Balığı Genotiplemesinde Kullanılan Bir Yöntem

Bu videoda, erime sıcaklığı analizine dayalı olarak farklı dizi uzunluklarına sahip DNA fragmanlarının uzunluk polimorfizmini belirlemek için yüksek çözünürlüklü bir erime PCR tekniğini açıklıyoruz.

Mutant DNA Dizilerindeki Dizi Varyasyonlarını Belirlemek için Yüksek Çözünürlüklü Eritme PCR

Yüksek çözünürlüklü erime analizi heterojen nüfus içinde tek nükleotid polimorfizmlerinin ayırt yeteneği sunarken, mutant alel amplifikasyon önyargı, bir numune içinde nispeten düşük oranlarda bulunan allel tespit kabiliyetini artırabilir. Bu protokol, yüksek çözünürlüklü erime analizinin duyarlılığını artırmak geliştirmeleri açıklanır.

Yöntemler sıtma Tek Nükleotid Polimorfizm Genotipleme Erime Yüksek Çözünürlük Duyarlılığının Artırma

Floresan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) jel elektroforezi kılcal çiftler burada tarif edilen genotipleme tekniği, nükleaz aracılı nakavt klonları yüksek verimli genotipleme için izin verir. Diğer Genotipleme teknikleri karşılaştığı sınırlamaları ortadan ve dizileme yöntemleri maliyet açısından daha etkilidir.

CRISPR genotipine bir Floresan PCR kılcal jel elektroforezi Tekniği / yüksek verimli bir Format Nakavt Mutants Cas9 aracılı

Hedeflenen genom modeli sistemi Danio rerio (zebra balığı) düzenleme büyük ölçüde CRISPR tabanlı yaklaşımlar ortaya çıkması tarafından kolaylaştırdı. Burada, akıcı, sağlam bir iletişim kuralı üretimi ve heteroduplex hareketlilik tahlil birleştirmek CRISPR elde edilen saçma allelleri tanımlaması ve yeni nesil sıralama kullanarak mutasyonlar tanımlaması için açıklar.

Verimli üretim ve Model sistem Danio rerio kimlik CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan Gene altını gizleme

Zebra balığı son kullanılan bir vivo içinde modeli sistemi olarak DNA çoğaltma zamanlaması geliştirme sırasında çalışmaya. İşte Zebra balığı embriyo profili çoğaltma zamanlaması için kullanarak iletişim kurallarını ayrıntılı. Bu iletişim kuralı kolayca çoğaltma zamanlaması mutantlar, tek hücre türleri, hastalık modelleri ve diğer türler çalışmaya adapte edilebilir.

Zebra balığı bir Vivo içinde Model sistemi olarak kullanarak DNA çoğaltma zamanlaması profil oluşturma

Zebra balığı güvenilir genetik canlılar arasında gen düzenleme teknolojileri advent ile özellikle Biyomedikal araştırma olarak kullanılmıştır. Larva fenotipleri bekleniyor, DNA ekstraksiyon ve genotip kimlik zor olabilir. Burada, biz bir verimli Genotipleme zebra balığı larva için kuyruk, 72-h sonrası döllenme gibi erken kırpma tarafından açıklayınız.

Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

Gen düzenleme teknolojileri, araştırmacıların gen fonksiyonlarını göreceli kolaylıkla araştırmak için zebra balığı mutantları oluşturmalarını sağlamıştır. Burada, zebra balıklarında in situ hibridizasyon sinyallerinin paralel embriyo genotiplemesi ve nicelemesi için bir kılavuz sa¤l›k sa¤l›k sa¤l›¤ › sa¤l›yor. Bu tarafsız yaklaşım, in situ hibridizasyona dayalı fenotipik analizlerde daha fazla doğruluk sağlar.

Zebrabalığında Situ Hibridizasyon Boyamada Genotibrasyon ve Nicelik

İskelet kas rejenerasyonu, kas distrofisi gibi birçok kas hastalığında bozulan doku yerleşik kas kök hücreleri tarafından yönlendirilir ve bu da kasın yenilenememesi ile sonuçlanır. Burada, kas hastalığının zebra balığı modellerinde kas yenilenmesinin incelenmesini sağlayan bir protokol açıklıyoruz.

Kas Hastalığının Zebra Balığı Modellerinde Kas Yenilenmesinin İncelenmesi

CRISPR-Cas teknolojileri, genom düzenleme alanında devrim yarattı. Bununla birlikte, istenen germline düzenlemesini bulmak ve izole etmek büyük bir darboğaz olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, bu protokol, standart PCR, kısıtlama sindirimi ve jel elektroforezi tekniklerini kullanarak germline düzenlemeleri için F0 CRISPR enjekte edilen zebra balığı spermini hızlı bir şekilde taramak için sağlam bir yöntem açıklamaktadır.

Zebra balıklarında germline düzenlemelerinin hızlı izolasyonu için sperm taraması

Burada, özellikle zebra balıklarında düşük bolluktaki proteinleri görselleştirmek için yararlı olan, yeni geliştirilen ve modifiye edilen bir in vivo sistem olan zebra balığı larvalarında proteinleri floresan protein etiketi ile etiketlemek için bir protokol sunuyoruz.

Zebra balıklarında düşük eksprese edilen proteinleri görselleştirmek için floresan etiketleme

Öğrenin, yüksek çözünürlüklü erime analizi ile PCR kullanarak Danio rerio genotiplemesini hızlı ve verimli şekilde gerçekleştirmeyi. Bu yöntem, genetik varyasyonları tespit etmek için hassas ve güvenilir bir alternatif sunar.

Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi

Daha fazla video keşfet