Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi

Bu prosedürün genel amacı, zebra balıklarında farklı genotipleri, mutasyonları veya transgenleri hızlı bir şekilde taramaktır. Bu, önce ince kliplerden DNA'nın çıkarılması ve ardından DNA'nın PCR ile amplifiye edilmesiyle gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, yazılım tarafından analiz edilen erime eğrilerini kaydederken PCR Amplikonları denatüre etmektir.

Sonuç olarak, sonuçlar farklı genotipler için ayırt edilebilir erime eğrileri göstermektedir. Bu tekniğin jel elektroforez hacmi PCR gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, tek nükleotid değişikliklerine, küçük yerleştirmeye, tüm delesyonlara duyarlı olması ve bu tekniğin hızlı ve güvenilir olmasıdır. Bu teknik, zebra balıklarını hızlı ve etkili bir şekilde genotiplemek için kullanılabilse de, hücre hatları, fareler ve diğer hayvanlar dahil olmak üzere diğer sistemlere ve model organizmalara da uygulanabilir.

DNA hazırlığının yapıldığı gün, mililitre başına bir miligram konsantrasyonda lizis tamponuna taze proteinaz K ekleyin. Doku, ince bir klips kullanılarak yetişkin bir balıktan veya embriyonik bir balıktan toplanabilir. İlk önce balığı Trica solüsyonunda uyuşturun.

Solungaç hareketleri yavaşlayana kadar bekleyin. Daha sonra balığı bir doku yığınının üzerine koyun ve steril bir tıraş bıçağıyla kuyruk yüzgecinin yaklaşık iki ila üç milimetre uzunluğunda küçük bir parçasını kesin. Balıkları geri kazanım için hızlı bir şekilde temiz su ile etiketli bir tanka yerleştirin.

Kanat klipsini steril bir pipet ucuyla alın ve 100 mikrolitre DNA lizis tamponu ile doldurulmuş bir tüpe aktarın. Hem hayvanın tankını hem de tüpünü etiketlediğinizden emin olun, toplanan tüm dokuları en az dört saat ve inkübasyondan sonra 55 santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. Tüpleri 15 dakika boyunca 95 santigrat derecede ısıtarak ACE K proteinini inaktive edin.

Bu numuneler hemen PCR için kullanılmalıdır, ancak eksi 20 santigrat derecede üç aya kadar saklanabilir. PCR'yi her reaksiyon için 96 veya 384 oyuklu bir plakada gerçekleştirin. Yetişkin DNA'sının bir mikrolitresinden fazlasını dört mikrolitre ışık tarayıcısı ile birleştirmeyin.

Floresan probu ve primerleri her biri beş piko molar nihai konsantrasyonda içeren ana karışım. DNA bir embriyodan geliyorsa, üç mikrolitreye kadar kullanın. Reaksiyonları 30 mikrolitre mineral yağ ile örtün ve ardından kapatın.

Ardından, yüklenen PCR plakasını optik olarak şeffaf bir yapışkan conta ile kapatın. Şimdi PCR döngü koşullarını optimize edin. Tipik bir koşul seti, beş dakikalık erime süresi ile başlar.

Bunu, on saniyelik erime, 25 saniyelik diz çökme süresi ve 30 saniyelik uzama ile 30 PCR döngüsü takip eder. Reaksiyon, eklenen 32. eriyik ile sona ermeli ve ardından 15 santigrat dereceye kadar soğutulmalıdır. PCR plakasını yazılımdaki bir eriyik analiz sistemine yerleştirerek analiz edin.

Sıcaklığı ayarlayın ve yeni bir veri depolama dosyası oluşturun. Bir alt küme ayarlayın. Ekranın sol alt tarafında numunelerin bulunduğu kuyuları seçin.

Floresan varyantlarını ortadan kaldırmak için normalleştirilmiş sekmesini seçin. Paralel çift çizgiyi prem, melt ve post eriyik bölgelerinde manuel olarak konumlandırın ve tüm numunelerin premel ve post melt floresan sinyallerini sırasıyla bir ve sıfır olarak normalleştirin. Daha sonra, önce gruplamayı seçerek genotipleri erime sıcaklıklarına göre ayırt edin.

Ardından standart seçim listesinden otomatik gruplandırmayı seçin. Gruplandırma bölümünde, sırasıyla tek geçişli veya çoklu geçişli eritme profilleri için normal veya yüksek'i seçin. Bunlar, gruplandırma bölümünün altındaki duyarlılık seçimi listesindedir.

Şimdi gruplandırma bölümünün altında hesaplama gruplarını seçin ve ardından dosya menüsüne gidin ve sonuçları kaydetmek için kaydet'e tıklayın. Protokol tek bir gün boyunca gerçekleştirilebilir veya birkaç gün içinde kademeli olarak ayrılabilir. PCR gerçekleştirirken, amplikonun eriyişi için sıcaklıklar boyuta ve GC içeriğine bağlıdır, ancak eriyik gerçekleştirildikten sonra genellikle 60 santigrat derece ve 95 santigrat derece başlangıç ve bitiş sıcaklıkları uygundur.

Floresan eriyik eğrilerinin analizi, tipik olarak, standart olarak erime öncesi ve sonrası bölgeler kullanılarak farklı numune eğrilerinin varyasyonunun normalleştirilmesini gerektirir. Bu, floresan varyasyonunun küçük deneysel varyasyonlarla ilişkili olduğu farklı numunelerden elde edilen sonuçların karşılaştırılmasını iyileştirir. Normalizasyon için her bir sıcaklık çizgisi çifti yaklaşık bir santigrat derece aralıklarla yerleştirilmelidir.

Veriler, erime eğrisi profil dosyalarını gösteren bir grafikle veya HRMA analizini takiben bir referans numuneye kıyasla eksiltici bir fark grafiği gösteren bir grafikle iki şekilde temsil edilebilir: mutasyonlar veya transgenler tespit edilebilir. EIF iki B beş genindeki iki farklı mutasyon kırmızı ve mavi eğrilerle belirtilmiştir. Bu mutant numuneler, standart vahşi tip eğrilerle karşılaştırıldığında erime eğrileri, şekilleri veya floresanstaki değişikliklerindeki önemli farkları ile tanımlanır.

Tek bir embriyo koleksiyonundaki dört farklı genotipin bu örneği, yöntemin gücünü ve hassasiyetini göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik sekiz saatten daha kısa sürede yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, zebra balığı genotiplerinin verimli bir şekilde büyük ölçekli taranması için HRMA'nın nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.