Yöntemler sıtma Tek Nükleotid Polimorfizm Genotipleme Erime Yüksek Çözünürlük Duyarlılığının Artırma

Aşağıdaki yüksek çözünürlüklü eriyik deneyinin genel amacı, tek bir numune ile düşük konsantrasyonlarda bulunan mutant alellerin tespit hassasiyetini arttırmaktır. Bu, önce şablonun gerekli hacim ve konsantrasyonlara seyreltilmesiyle ekstrakte edilen DNA'nın hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, şablon prob ürününü arttırmak için ileri ve geri astarın asimetrik oranlarıyla tahlilleri hazırlamaktır.

Reaksiyonları hazırladıktan sonra, tavlama sıcaklığı, yabani tip veya mutant şablona bağlandığında probun erime sıcaklıkları arasında ayarlanır. Son adım, güçlendirilmiş ürünleri uygun HRM platformunda analiz etmektir. Sonuç olarak, mutant alel amplifikasyon yanlılığı ve prob tabanlı asimetrik PCR, numunelerde bulunan düşük konsantrasyonlarda zorlu SNP mutasyonunun daha hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlar.

Bu artan duyarlılık, popülasyonlarda mutasyon sürveyansı için yararlıdır. Bu tekniğin standart yüksek çözünürlüklü eritme veya tac man genotiplemesi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, düşük konsantrasyonlarda bulunan aleller için artan duyarlılığa izin vermesi ve ayrıca genomda birbirine yakın bulunan SNP'lerin genotiplenmesine izin vermesidir. Bu yöntem, sıtma parazitinde ilaç direncinin yayılması hakkında fikir verebilir.

HIV gibi diğer bulaşıcı hastalık türlerinin sürveyansı veya bir hücre popülasyonunda nadir görülen kanser varyantlarının tespit edilmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Prosedürü gösteren Caitlin Durphy olacak. Laboratuvarımızdan bir teknisyen.

Yüksek çözünürlüklü eritme veya HRM için şablonlar, saha saha çalışmalarına katılan hastaların kanından doğrudan elde edilen plasmodium falciparum örneklerinden hazırlanır. Numuneler filtre kağıdında, hızlı tespit testlerinde veya peletlenmiş kırmızı kan hücreleri numuneleri olarak saklanabilir, ayrıca in vitro olarak büyümek üzere kültüre adapte edilebilir. Analiz için bazı standart laboratuvar suşları sıtma araştırma ve referans reaktif kaynak merkezinden sipariş edilebilir Numuneler tam kandan, kırmızı kan hücrelerinden veya filtre kağıdından ekstrakte edilebilir veya peletlenmiş kırmızı kan hücrelerinden doğrudan amplifikasyon için doğrudan peletlenmiş kırmızı kan hücrelerinden veya kültürden kullanılabilir.

İlk olarak, Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezlerinden prosedürü takiben ince yayma mikroskobu kullanarak kırmızı kan hücrelerinin parasını belirleyin. % 0.5'in üzerinde paralara sahip kırmızı kan hücreleri daha sonra bir ila 400 arasında seyreltilir. TE'de, her beş ila 10 mikrolitrelik reaksiyon için üç mikrolitre seyreltilmiş kırmızı kan hücresi kullanılacaktır, çünkü bir değişkenlik arasında pozitif ve negatif kontroller her zaman İKY analizlerine dahil edilmelidir.

Bir mikrolitre plazmid dilüsyonları başına 10 pikogram ila 10 nanogram veya pozitif troller olarak dizi doğrulanmış snip genotipleri ile standartlar hazırlayın. Amplifikasyon reaksiyonları için şablonsuz negatif kontrol olarak PCR sınıfı su kullanın. Bu prosedüre, astarların ve probların 10 x çalışma stoğunu hazırlayarak başlayın.

Aynı protokol, 96 kuyucuklu plaka, 384 oyuklu plaka, sekiz tüp şeridi veya cam kılcal damarlar kullanan tahliller için de geçerlidir. Ancak bu gösterinin amacı için, sadece 96 kuyu plakası ve cam kılcal damarlar kullanılacaktır. Bu tablo, bloke prob bazlı HRM genotiplemesi için önerilen 10 x çalışma stoğu konsantrasyonlarının yanı sıra nihai konsantrasyonları göstermektedir.

Her birine reaksiyon karışımları hazırlayın. 10 x çalışma stoğunun her birinden bir mikrolitre ileri ve geri primer ve prob ekleyin. HRM master'ın dört ila beş mikrolitresi, toplam 10 mikrolitrelik bir reaksiyon hacmi için bir mikrolitre şablon ve PCR sınıfı suyu karıştırır.

Her cam kılcal damar için aynısını yapın. Plakaları ve cam kılcal damarları örtün. Plaka bazlı amplifikasyon için optik plaka contaları ve kılcal tabanlı sistemler için plastik kapaklar kullanın.

Buharlaşmayı önlemek için kaplamanın tamamlandığından ve plakaların ve kapakların tamamen kapatıldığından ve sabitlendiğinden emin olun. Amplifikasyon sırasında. Hava kabarcıklarını gidermek için numuneleri döndürün.

Plakaları bir masa üstü santrifüjde 1.800 kez üç dakika boyunca döndürün G.Spin cam kılcal damarları 10 ila 15 saniye boyunca bir pico fuge'de döndürün. Reaksiyon plakasını ve cam kılcal damarları bir termal döngüleyici çalıştırma standart bloke probuna veya MAAB amplifikasyon protokollerine yerleştirin. PCR amplifikasyonundan sonra, sistem yazılımı arayüzünden erime analizine devam edin.

Hem prob hem de amplikon erime zirveleri elde etmek için plakayı 40 santigrat dereceden 80 santigrat dereceye kadar eritin. Işık döngüleyici dört 80 üzerindeki ilk adım erime analizi, sıcaklık görünümüne göre normalleştirilmiş floresansın negatif türevinden normalleştirmedir. Prob erime bölgesini çevrelemek için normalleştirme çubuklarını hareket ettirin.

Prob erime bölgesi, iki erime bölgesinin daha düşük sıcaklığıdır. Normalizasyon çubukları, eriyik tepe noktalarının tabanında olmalıdır. Normalleştirmeden sonra, gerekirse örnekleri gruplara otomatik olarak atamak için grupları hesapla'yı seçin, örnekleri belirli gruplara manuel olarak yeniden atayın.

Yükseltilmeyen veya pürüzlü erime tepe noktalarına sahip numuneleri seçin. Ardından yeni aramaya gidin ve negatifi seçin. Kalan yanlış sınıflandırılmış örnekleri seçtikten sonra, yeni çağrıya gidin, uygun gruplamayı seçin ve uygula'ya tıklayın Değişikliği uygula Standartlara göre her grup için genotipler atayın.

Hesaplanan grupların doğru olduğunu onayladıktan sonra, gruplandırma sekmesi altında grup adlarını düzenle'yi seçin. Standartların genotiplerini ilgili renkli kutuya girin. Örneğin, standart 3D yedi bilinen bir C genotipine sahipse ve birinci grupta yer alıyorsa, birinci gruptaki tüm numuneler genotip C pres sonuçlarına sahiptir ve genotipler numunelerin yanında görüntülenir.

Son olarak, daha fazla örnek popülasyon analizi için sonuçları bir TXT dosyası olarak dışa aktarın. Light cycler 2.0'da çalışma bittikten sonra, numune adları ve konumları numune verileri altında kaydedin Analize başlamadan önce negatif kontrolleri ve erime standartlarının genotiplerini etiketleyin. Eriyik analizine, analizi seçerek, erime eğrisi analizi altında genotiplemeyi seçerek ve presleyerek başlayın. Tamam.

Otomatik gruplamanın hassasiyetini artırmak için, erime eğrilerindeki ekran çizilecek şekilde tüm örnekleri seçin. Normalleştirme çubuğunu prob erime tepe noktalarının üst sınırına kaydırın. Grup adının altındaki her bir grubu tek tek seçerek örneklerin doğru şekilde gruplandırıldığını onaylayın.

Tüm örnekleri seçerek, verileri kopyalayarak ve bir çalışma sayfasına yapıştırarak her örnek için genotipleri dışa aktarın. Normalleştirilmiş floresanın sıcaklığa göre negatif türevinin grafiği, tipik olarak erime piklerini görselleştirmenin ve genotipleri belirlemenin en basit yoludur. Analiz penceresini yalnızca bir prob bölgesine ayarlamak, belirli SNP'lere karşılık gelen tepe noktalarının net bir şekilde ayırt edilmesini sağlar.

Mükemmel eşleşmeler, kırmızı ile gösterilen daha yüksek erime zirvelerine neden olur. SNP uyumsuzlukları, bir numunede her iki alel de mevcut olduğunda gri ile gösterilen daha düşük erime sıcaklıklarına sahiptir. Prob tabanlı HRM analizi, her iki aleli de turuncu renkle gösterilen iki tepe eğrisi olarak temsil eder ve kırmızı ve gri renkte gösterilen tek alel örnekleriyle eşleşen tepe noktaları ile amplifikasyon sırasında ealing sıcaklığının kademeli olarak düşürülmesi, bir poli genomik veya poli alelik numunede sol taraf tepe tarafından temsil edilen mutant alele doğru bir önyargı ile sonuçlanır.

Bu mutant alel amplifikasyon yanlılığı, poli genomik veya poli alelik örneklerde %1'den daha az bulunan küçük alelleri tespit etmek için HRM duyarlılığı ile sonuçlanır. Bu prosedürü denerken, numune kalitesinin çok önemli olduğunu unutmamak önemlidir. Tampon konsantrasyonlarındaki küçük farklılıklar HRM eğrilerini kaydırabilir.

Denetimleri kullanmak, sonuçları standartlaştırmanın kullanışlı bir yoludur. Bu videoyu izledikten sonra, çeşitli numune türlerinden sıtma SNP'lerini doğru ve hassas bir şekilde genotiplemek için prob tabanlı asimetrik PCR ve mutant alel amplifikasyon yanlılığının nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.