Name: Verimli üretim ve Model sistem Danio rerio kimlik CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan Gene altını gizleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Öğrenin, Danio rerio kullanarak CRISPR/Cas9 ile gen düzenleme ve gen knock-out'ları oluşturma yöntemlerini. Bu protokol, gelişim biyolojisi araştırmalarında gen fonksiyonlarını incelemek için güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir (R21CA182197) için Albay Ralph W. ve Grace M. Douchez araştırma güven, Purdue tarım bilim ve ekonomik kalkınma (AgSEED) programı için uzantısı tarafından. Sanger sıralama veri P30 CA023168 tarafından desteklenen Purdue genomik çekirdek tesis tarafından satın alınan. Mary Witucki Purdue Üniversitesi Merkezi tarafından Carroll bölgesi Kanser Derneği tarafından desteklenen kanser araştırma yaz lisans araştırma programı için destek verdi. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu. Biz Benjamin Carter, Ellen Denning ve Taylor Sabato el yazması üzerinde kritik geribildirim sağlamak için teşekkür ederiz. Biyokimya Bölümü için destek bu çalışmanın ve onların bağlılığı bakım ve zebra balığı kolonimiz refahı için Purdue Üniversitesi'nde zebra balığı araştırma merkezi teşekkür ederiz. Son olarak, Purdue genomik çekirdek tesisin teşekkür ediyoruz ve Phillip San Miguel katkılarıyla NGS Hizmetleri ile ilgili.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı gen knockouts üretim CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak zebra balığı omurgalı modeli sistemde açıklar. Bir dizi protokolü daha önce zebra balığı15,25,26,50,51,52CRISPR-aracılı genom mühendislik taahhüt tarif edilmiştir. Bu iletişim kuralı önceki çabaları bir takım basit ama tekrarlanarak tutarlı Deneysel teknikler, özellikle bir araya getirerek HMA ve NGS birden çok basit, ekonomik, oluşturmak için Heterozigoz balık ve deneysel olarak sağlam iletişim kuralı oluşturur CRISPR-aracılı ile personel eğitim ve deneyim yanı sıra labs öğretim yelpazesi ile personel labs için uygundur zebra balığı içinde mutagenesis için.
Tasarım ve RNA'ların bu protokol için dahil edilen Kılavuzu sentezi için öneriler. Bir büyük RNA tasarım kılavuzundaki hedef kapalı etkileri indirilmesi noktadır. CRISPR-kullanıcıların hem hedef üzerinde Kılavuzu etkinlik ve hedef kapalı etkileri34, olasılığını tahmin Kullanıcı dostu grafik arayüze sahip hesaplama araçları erişmesine izin vermek için çeşitli tahmin algoritmalar geliştirilmiştir 35,36. Zebra balığı sistemin belirli bir avantajı hedef kapalı etkileri indirdi oranları Cas9 embriyo enjekte edilir ve bu nedenle ifade hangi farelerde azalmış hedef kapalı etkileri53neden olarak gösterilen geçicidir, çünkü. Bununla birlikte, hedef kapalı etkileri zebra balığı54yılında gerçekleşmesi için gösterilmiştir. Bir denetim için hedef sonuç için bu kılavuzların farklı hedef kapalı sitelerini etkileyen büyük olasılıkla olacak gibi bu aynı gen hedefleyen iki bağımsız Kılavuzu RNA'ların tarafından oluşturulan fenotip kurucusu zebra balığı için yoludur. Bu iletişim kuralında tanımlanan hedef kapalı etkileri en aza indirmek için alternatif bir yöntem olan yüksek verimlilik ile tamir tek kırılmalara DNA, target oluşturur bir mutasyona uğramış Cas9 kullanmaktır. Tersi tamamlayıcı DNA nickler birbirine yakınlığı içinde eşleştirme istenen odağı, etkili INDEL oluşumunda sonuçları ayrılmaktadır ve hedef kapalı etkileri55,56en aza indirir.
Hedef kapalı etkileri farklı oranlarda sahip olmanın yanı sıra, farklı sgRNAs mutagenesis istenen hedef57,58,59farklı oranlarda olabilir. Bu protokol heteroduplex band oluşumu33,40kullanarak belirli bir sgRNA mutagenesis verimliliğini analiz etmek HMA kullanır. Heteroduplex grupları ve uyuşmazlıkları içeren jel elektroforez kullanılarak kolayca çözülebilir PCR tarafından oluşturulan DNA iplikçiklerinin hibridizasyon tarafından oluşturulur. INDEL oluşumu ölçmek için yaygın olarak kullanılan diğer yöntemlerin aksine T7 endonükleaz gibi tahlil veya yüksek çözünürlüklü eritmek analiz25,26, HMA eşleşmeyen DNA kesmek için pahalı bir enzim does değil istemek ve does değil istemek karmaşık analizini PCR eğrileri eritebilir. Önemlisi, HMA INDEL oluşumu enjekte nüfus yüksek oranda doğrulamak için kullanmak da bir mutasyon ile belirlenmesi maliyetini azaltan sonraki knock-out satırları, üretim için gerekli balık sayısını en aza indirmek için Dedektif, sağlar istenen özellikleri.
CRISPR tabanlı indels üreten göreli kolaylığı aynı anda birden çok gen birden çok gen oluşturulmasını sağlar. Web tabanlı yazılım, heterozigoz balık Sanger kullanarak tek mutasyon analizi için kullanılabilir PCR ürünleri49sıralama. Nerede üç veya daha fazla CRISPR mutasyona uğramış gen analiz edilir, NGS INDEL doğası karakterize etmek için büyük olasılıkla daha bu yaklaşım olarak INDEL doğası karakterize etmek için uygun maliyetli olmak o karakterize edilebilir için en çok 50 farklı gen havuzu sağlar durum nce (bakınız Tablo reçetesi)60,61,62. Böyle ölçek ekonomisi büyük olasılıkla bir lisans laboratuvar ortamında özellikle yararlı olacaktır.
Özet olarak, bu iletişim kuralı daha az yetişkin balık oluşturulabilir ve başarılı bir şekilde ilgi, mutant gen belirlemek için çözümlenebilir gerekir öyle ki tekrarlanarak yüksek kalitede CRISPR-reaktifler (özellikle sgRNA) oluşturmak için adım adım yönergeler sağlar hangi Ayrıca zaman ve istenen satırlar maliyetini azaltır. Önemlisi, bu iletişim kuralı mutant zebra balığı uygun bir şekilde üretmek için sınırlı kaynaklara sahip laboratuvarlar tarafından uygulanabilir öyle ki tasarlanmıştır. Ayrıca, biz bulduk bu yaklaşım lisans öğrencileri için uygundur ve böylece eğitim ve öğretim lisans öğrencilerinin uygulamalı deneyim genom CRISPR tabanlı düzenleme ilgi için fırsatları genişletir.

Ökaryotlar arasında Moleküler makineler korunması için araştırma model organizmalar kullanarak güç altında yatan. Bu modeli sistemlerin pek çok gen ürünü bir biyolojik veya hastalık işleme ilgi katkısını karakterize etmek için hedeflenen gen altını gizleme gibi ters genetik yaklaşımlar kullanımını kolaylaştırmak. Gene bozulma teknikleri zebra balığı gibi organizmalar üzerinde DSBs1,2imprecise tamiri neden frameshift mutasyonların hedeflenen giriş tarihsel yararlanmıştır. Bir DSB genom tanıttığında, DNA lezyon neredeyse tüm hücre tipleri ve organizmaların evrensel olarak mevcut iki yolları biri aracılığıyla tamir: homolog olmayan sonu (NHEJ) katılma ve Homoloji yönetmen onarım (HDR)3,4 . NHEJ makine imprecise doğası sık sık çeşitli uzunlukları5,6,7,8,9indels üretir. Giriş bir genin kodlama dizisi frameshift mutasyonların kez gen işlevsel olmayan işler bir erken kodonu, üretebilir.
Meganucleases, çinko-parmak nükleaz ve transkripsiyon harekete geçirmek gibi efektör nükleaz, tüm bunların bir nükleaz genomik belirli bir hedef için DNA-protein etkileşimler kullanılan zebra balığı indels tanıtmak için erken genom mühendislik stratejileri dahil hedef nerede DSB10,11,12,13,14,15tanıttı. Ancak, bu teknolojilerin genellikle faiz DNA dizisi hedefleyen bir nükleaz görüntüyü artırmak için gerekli zahmetli ve karmaşık mühendislik nedeniyle uygulamak zordur. Önceki stratejileri gen CRISPR tabanlı düzenleme hedefleme için protein-DNA etkileşimleri dayanmaz. Bunun yerine, CRISPR ilişkili (Cas) endonükleaz nükleotit etkileşimleri eşleştirme temel faiz16,17,18,19 genomik bir site hedeflemek için kullandığı bir RNA Kılavuzu yönlendirilir ,20,21. Bir RNA tasarlama basitliği nedeniyle Kılavuzu ile etkileşimleri bu hedefleme için eşleştirme istenen Bankası Cas endonükleaz istenen odağı için hedef nispeten kolaydır. Tip II CRISPR sistemi özellikle yaygın endonükleaz etkinliği uyarmak için DNA ile etkileşim gerektiren bir tek etki alanlı Cas nükleaz (Cas9) kullanımı da dahil olmak üzere birçok avantajlı özellikleri nedeniyle genom düzenleme uygulamaları için geliştirilmiştir ve soydaş DNA dizisi18için hedef için bir tek Kılavuzu RNA (sgRNA) kullanın. Sıra gereksinimleri soydaş sgRNA hedefleme için gerekli iyi anlaşılan19, ve istenen sgRNA kolayca vitro transkripsiyon tarafından oluşturulur. Sadelik ve sağlamlık CRISPR/Cas9 yaklaşımın büyük zebra balığı ve diğer organizmalar zengin çeşitte hedeflenen genetik değişiklik kolaylaştırır.
Zebra balığı reaktifler CRISPR tabanlı geliştirme sonucu olarak hedeflenen genom düzenleme önemli ölçüde vardır taahhüt yeteneği gelişmiş omurgalı canlıların sinir merkezi geliştirme gibi sembolik işlemler çalışma fırsatı arttı sistem. Zebra balığı genom orthologs insan genomu hem de insanlar22hastalıkları ile ilişkili genlerin % 84 bulundu protein kodlayıcı genlerin % 70 içerir. Zebra balığı geliştirme sergileyen kullanımı ters genetik çalışmalarda geliştirmek birkaç anahtar nitelikler: embriyo büyük debriyajlar koyulur, dışarıdan mikroenjeksiyon ve yetişkin zebra balığı tarafından mükellef genetik manipülasyon geliştirmelerde anneden geliştirmek 3 ay-in yaş, istediğiniz satırları23hızlı yayılması için izin tarafından cinsel olgun.
Çok sayıda iletişim kurallarının yaklaşımlar oluşturmak ve CRISPR elde edilen indels zebra balığı24,25,26,27,28,29 olarak tanımlamak için çeşitli tarif ,30,31. Ancak, bu yordamları birçoğu zaman yoğun, pahalı ekipmanlara erişim gerektiren ve labs ile sınırlı uzmanlık için zor olabilir. Burada açıklanan adımları bir basit, sağlam ve ekonomik CRISPR/Cas9-stratejisi mühendis zebra balığı nakavt satırlarına sağlayabilir. Bu iletişim kuralı DNA oligonucleotides (oligos) kullanarak sgRNAs sentezlemek için son derece verimli bir kit açıklar, benzer olmuştur diğer yaklaşımlar için daha önce açıklanan32. Açıklanan protokol iki adımları özellikle büyük ölçüde kolaylaştıran çizgiler CRISPR mutasyona uğramış analizini içerir: adım adım kolayca genom değişiklikler varlığı ve sıralama Analizi belirlemek için PCR tabanlı HMA33 kullanımı hızla ve kolayca birden çok indels ekonomik bir biçimde sebebini bulmaya Heterozigoz zebra balığı. Buna ek olarak, adım adım yönergeler seçimi sağlam, güvenilir üretim ve Enjeksiyon Kılavuzu RNA'ların için dahil edilir. Burada sağlanan adımlar zebra balığı gen knockouts tanımlaması için katkıda bulunmak laboratuar personeli uzmanlık bir dizi sağlayan sağlam, nispeten ucuz protokol örnekler.

<table><tbody><tr><td>CRISPOR</td><td></td><td></td><td>sgRNA analiz yazılımı. http://crispor.tefor.net/</td></tr> <tr><td>Breaking-Cas</td><td></td><td></td><td>sgRNA analiz yazılımı. https://omictools.com/breaking-cas-tool</td></tr><tr><td>ChopChop</td><td></td><td></td><td>sgRNA analiz yazılımı. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/</td></tr> <tr><td>Primer 3</td><td></td><td></td><td>PCR astar tasarımı. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/</td></tr><tr><td>Rnaz içermeyen teknik</td><td></td><td></td><td>http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf</td></tr><tr><td>RNaz içermeyen su</td><td>Herhangi bir marka</td><td></td><td>Kılavuz RNA'ların sentezi. Thermo Fisher ve Qiagen'in her ikisi de uygun su taşır.</td></tr><tr><td>Rnaz içermeyen etanol</td><td>Herhangi bir marka</td><td></td><td>Moleküler biyoloji sınıfı etanol Rnase içermez. Fischer, VWR uygun etanol satmaktadır.</td></tr><tr><td>Cas9 Proteini</td><td>PNA Bio</td><td>CP01</td><td>Nükleer lokalizasyon sinyalli Cas9 proteini.</td></tr><tr><td>Hedef spesifik oligolar</td><td>Entegre DNA Teknolojileri (IDT)</td><td></td> <td>Rehber RNA'ları sentezleyin.</td></tr><tr><td>PCR primerleri yan kılavuz RNA kesim bölgesi</td><td>Entegre DNA Teknolojileri (IDT)</td> Heterodubleks <td></td><td>analiz için kullanın, 100-300 bp ürün.</td></tr><tr><td>PCR primerleri yan kılavuz RNA kesim bölgesi</td><td>Entegre DNA Teknolojileri (IDT)</td><td></td> <td>CRISPR alellerini sıralamak için kullanın, 300-600 bp ürün önerilir.</td></tr><tr><td>EnGen sgRNA Sentez Kiti</td><td>New England BioLabs</td><td>E3322</td><td>İn vitro transkribe kılavuz RNA'ları.</td></tr><tr><td>Nükleik asitlerin elektroforezi için</td> <td>10X TBE</td><td>Thermo Fisher</td><td>B52</td> RNaz içermeyen tampon.</tr><tr><td>6X Yük Boyası</td><td>New England BioLabs</td><td>B7025S</td><td>Elektroferez için DNA yükleniyor.</td></tr><tr><td>5M Amonyum asetat</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9071</td><td>Kılavuz RNA'ların saflaştırılması için temizleme reaktifi.</td></tr><tr><td>Etanol (200 geçirmez, nükleaz içermez)</td><td>Herhangi bir marka</td><td></td><td>Kılavuz RNA'ların saflaştırılması için temizleme reaktifi. Moleküler dereceli malzemeler RNaz içermez.</td></tr><tr><td>Nükleaz İçermeyen Su</td><td>: Herhangi bir marka</td><td></td><td>: Kılavuz RNA'ların sentezi ve saflaştırılması için.</td></tr><tr><td>RNase away</td><td>Thermo Fisher</td><td>10328011</td><td>Yüzeylerden, ekipmanlardan, cam eşyalardan kaynaklanan RNase kontaminasyonunu ortadan kaldırır.</td></tr><tr><td>DNA Merdiveni, 100 bp</td><td>New England BioLabs</td><td>N0467S</td><td>DNA'nın jel elektroforezi için moleküler ağırlık standartları.</td></tr><tr><td>DNA Merdiveni, 1 kb</td><td>New England BioLabs</td><td>N0552S</td><td>DNA'nın jel elektroforezi için moleküler ağırlık standartları.</td></tr><tr><td>RNA Merdiveni</td><td>New England BioLabs</td><td>N0364S</td><td>Tam uzunlukta sgRNA'nın sentezlendiğini doğrulamak için tek sarmallı RNA markörü</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Thermo Fisher</td><td>17919</td><td>Döküm poliakrilamid jel.</td></tr><tr><td>Amonyum persülfat (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td>Döküm poliakrilamid jel.</td></tr><tr><td>%40 Poliakrilamid (19:1)</td><td>BioRad</td><td>161-0154</td><td>Döküm denatüre edici poliakrilamid jel.</td></tr><tr><td>Üre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-100G</td><td>Döküm denatüre poliakrilamid jel.</td></tr><tr><td>RNA Jel Yükleme Boyası (2x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0641</td><td>Elektroforez için denatüre edici jel üzerine kılavuz RNA yükleme.</td></tr><tr><td>Etidyum bromür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ML</td><td>Nükleik asitlerin görselleştirilmesi.</td></tr><tr><td>SYBER Green</td><td>Thermo Fisher</td><td>S7563</td><td>Agaroz veya poliakrilamid jellerde dsDNA'nın tespiti için etidyum bromüre alternatif yöntem.</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>RNA temizleme, PCR saflaştırması.</td></tr><tr><td>MyTaq Polimeraz</td><td>Bioline</td><td>BIO-21105</td><td>PCR kullanılarak DNA'nın amplifikasyonu için.</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Herhangi bir marka</td><td></td><td>PCR amplifikasyonu.</td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td>: <td>DNA/RNA miktarını ölçmek için herhangi bir marka</td><td></td><td></td> NanoDrop veya ilgili ürün.</tr><tr><td>E3 embriyo ortamı</td><td>Embriyoları</td> büyütmek ve enjeksiyon plakası yapmak için evde <td></td> yapılan <td>ortam. Tarif: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449</td></tr><tr><td>Metilen Mavisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>Embriyolarda mantar üremesini önlemek için 1x E3 ortamına eklenir.</td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB0875711Z</td><td>Embriyoları saklayın, enjeksiyon plakasını dökün.</td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Denville</td><td>CA3510-8</td><td>Döküm enjeksiyon plakası, agaroz jeller.</td></tr><tr><td>Microinection kalıbı</td><td>Uyarlanabilir Bilim Araçları</td><td>TU-1</td><td>Enjeksiyon sırasında embriyoları tutmak için kuyular oluşturmak için.</td></tr><tr><td>Fenol Kırmızı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290&nbsp;</td><td>Enjeksiyonun görselleştirilmesi için boya.</td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904-5ML</td><td>İğne enjeksiyon hacmini kalibre etmek için.</td></tr><tr><td>Transfer pipetleri</td><td>Herhangi bir marka</td><td></td><td>Hareketli embriyolar.</td></tr><tr><td>Jiletli</td><td>Thermo Fisher</td><td>11295-10</td><td>Kesme enjeksiyon iğnesi, kuyruk kırpma yetişkin balık.</td></tr><tr><td>Kuluçka</td><td>makinesi: Herhangi bir marka</td><td></td><td>: Embriyoları 28.5 oC'de tutmak.</td></tr><tr><td>Dikey pipet çektirme</td><td>David Kopf Instruments</td><td>700C</td><td>Enjeksiyon için geneate iğneleri. Ek iğne çekme talimatları:</td></tr><tr><td>http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long Kılcal borular</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>Enjeksiyon için geneat iğneleri.</td></tr><tr><td>Mikro yükleyici uçları</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Solüsyonu enjeksiyon iğnelerine yükleyin.</td></tr><tr><td>Mikroenjektör</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>PV 820</td><td>Embriyoların enjekte edilmesi.</td></tr><tr><td>Diseksiksiyon mikroskobu</td><td>Leica</td><td></td><td>Embriyoların enjekte edilmesi.</td></tr><tr><td>%30 Poliaksilamid (29:1)</td><td>BioRad</td><td>161-0156</td><td>Heterodubleks jel döküm.</td></tr><tr><td>MS-222 (Trikain)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td>Kuyruk kırpma ve embriyolardan gDNA ekstraksiyonu için zebra balığını uyuşturun. Tarif: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE</td></tr><tr><td>Mikrodalga</td><td>Herhangi bir marka</td><td></td><td>Döküm enjeksiyon plakası, agaroz jelleri.</td></tr><tr><td>Ölçek</td><td>Herhangi bir marka</td><td></td><td>Döküm enjeksiyon plakası, agaroz jelleri.</td></tr><tr><td>Eldiven</td><td>Protokolün tüm yönleri için</td> <td>herhangi bir marka</td><td></td>.</tr><tr><td>N2</td><td>Herhangi bir marka</td><td></td><td>Embriyo enjeksiyonu için kılcal damardan sıvıyı dışarı atmak için.</td></tr><tr><td>1.000 ve mikro; L&nbsp; ipuçları</td><td>Herhangi bir marka</td><td></td><td>Protokolün tüm yönleri için.</td></tr><tr><td>200 ve mikro; L ipuçları</td><td>Herhangi bir marka</td><td></td><td>Protokolün tüm yönleri için.</td></tr><tr><td>10 ve mikro; L ipuçları</td><td>Herhangi bir marka</td><td></td><td>Protokolün tüm yönleri için.</td></tr><tr><td>PCR şerit tüpleri</td><td>Protokolün tüm yönleri için</td> <td>herhangi bir marka</td><td></td>.</tr><tr><td>Mikropipetler</td><td>Protokolün tüm yönleri için</td> <td>herhangi bir marka</td><td></td>.</tr><tr><td>NGS Sıralama platformu: Wideseq</td><td></td><td></td><td>Kurumunuz bu hizmeti sunmuyorsa şu adresi ziyaret edin: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (Harici maliyet: 35 $).</td></tr><tr>Heterozigot balıkların Sanger dizilimi <td>için dizi analizi</td><td></td><td></td> için yazılım<td>. Ziyaret: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/</td></tr> <tr><td>Dizi analizi</td><td></td><td></td> için yazılım <td>SnapGene Viewer, NGS diziliminin analizi için Dizi Tarayıcı.</td></tr></tbody></table>

verimli üretim ve model sistem danio rerio kimlik crispr/cas9 tarafından oluşturulan gene altını gizleme

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Kümelenmiş, karakterizasyonu düzenli olarak interspaced, Streptococcus pyogenes (CRISPR) sistemi hızla geniş çeşitli gen değişiklikleri oluşturmak için özelleştirilebilir bir platform gelişimi sağladı kısa, palindromik tekrar organizmalar, zebra balığı da dahil olmak üzere. Genom CRISPR tabanlı düzenleme tek kılavuz RNA (sgRNA) CRISPR ilişkili (Cas) endonükleaz ilgi, genomik DNA (gDNA) hedefine hedeflemek için nerede iki iplikçikli mola (DSB) Cas endonükleaz oluşturur kullanır. DSBs onarım hataya mekanizmaları kurşun eklemeleri ve/veya silme (indels) tarafından. Bu kez erken kodonu böylece bir protein-null alleli oluştururken kodlama dizisi içinde tanıtmak frameshift mutasyonlar neden olabilir. CRISPR tabanlı genom mühendislik yalnızca birkaç moleküler bileşenleri gerektirir ve kolayca zebra balığı embriyo mikroenjeksiyon tarafından tanıtıldı. Bu iletişim kuralı CRISPR kimyasalları zebra balığı mikroenjeksiyon üretmek için ve CRISPR modifiye gen aktarımını germline sergilenmesi balık tanımlamak için kullanılan yöntemleri açıklar. Bu yöntemler, sgRNAs, mikroenjeksiyon, CRISPR reaktifler, indels bir heteroduplex hareketlilik tahlil (HMA), malzemelerin ve indels adı verilen bir PCR tabanlı yöntem kullanarak hedef sitesinde indüklenen tanımlaması içinde vitro transkripsiyon içerir iş hızı düşük ve güçlü yeni nesil sıralama (NGS) kullanarak-Heterozigoz balık toplanan birden fazla PCR ürünleri analiz edebilirsiniz yaklaşım alarak. Bu iletişim kuralı çözümlemesi için gerekli ekipman türleri ve gerekli balık sayısını en aza indirmek için kesintisiz hale getirilir. Ayrıca, bu iletişim kuralı kullanımı için mükellef olarak laboratuvar Kişisel lisans öğrencileri, ekonomik olarak CRISPR tabanlı gerçekleştirmede baktılar herhangi bir araştırma grubu tarafından istihdam edilecek bu güçlü aracı etkinleştirme dahil deneyimi her seviyedeki tarafından tasarlanmıştır zebra balığı genomik değişiklik.

Bu protokol için açıklanan deneysel yaklaşımlar zebra balığı knock-out satırları CRISPR/Cas9 teknolojisini kullanarak verimli, düşük maliyetli üretim için izin. Aşağıdaki şekiller yorumu ve bu iletişim kuralını kullanan elde edilen sonuçları sorun giderme kolaylaştırmak için bu makalede dahil edilmiştir. Başarılı bir üretim ve CRISPR-reaktifler mikroenjeksiyon, zebra balığı embriyo aleni fenotipleri ve HMA kullanarak INDEL oluşumu için analiz edilebilir. CRISPR-deney başarısı görselleştirmek için yardımcı bir denetim içinde adım 1.5-pigment üreten gen hedeflemek için açıklanan sgRNA kullanmaktır tirozinaz. Cas9 kaynaklı INDEL oluşumu tirozinaz , pigmentasyon kaybına neden olur ve 48 tarafından kolayca attı hpf (Şekil 1). CRISPR-reaktifleri o hazırlanması için enjeksiyon başarılı oldu sağlamak için başka bir yararlı olduğu bu tam uzunlukta doğrulamak için (120 nt) sgRNA sentez bir denaturing polyacrylamide jel (Şekil 2, Lane 1 ve 2) kullanarak. RNA bozulmuş o görünür bir smear örneğin enjeksiyon için uygun değildir bozulmuş RNA Lane 3 (resim 2) gösterir.
Tirozinaz, gibi açık fenotipleri neden değil CRISPR-Cas9 tarafından hedef genlerin INDEL oluşumu sıklığı çözümlenecek HMA bir basit ve güvenilir yöntem analizidir. sgRNA/Cas9 heteroduplex Grup oluşumu ve homoduplex grubu (Şekil 4) yoğunluğunu azalması HMA sonuçları kullanılarak analiz embriyo enjekte. Heteroduplex bant varlığı daha fazla potansiyel kurucusu balık microinjected embriyo aldı ve bir kurucu ( germline iletim verimliliğini analiz etmek için yetişkin (Şekil 4 ve Şekil 5), belirlemek için bu iletişim kurallarını kullanılmaktadır Şekil 6) ve bir INDEL Heterozigoz F1 balık (Şekil 7) varlığını doğrulamak için. Bir INDEL içeren Heterozigoz balık NGS INDEL doğasını belirlemek için ve erken kodonu hedef genin kodlama bölgede mevcut olup olmadığını belirlemek için adaylarıdır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig1.jpg"> Resim 1 : Zebra balığı embriyo bir sgRNA tek hücreli aşamada tirozinaz hedefleme ile enjekte edildiğinde bir pigment kusur sergi. (A)vahşi-türü, uninjected embriyo 48 hpf ve (B) enjekte embriyo 48 hpf. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig2.jpg"> Resim 2 : SgRNA sentez seti kullanarak, vitro transkripsiyonu. Oligos vitro transkripsiyon sgRNA sentez kiti talimatlara göre kullanarak sentez. 500 ng RNA'ın açıklandığı gibi bir üre/sayfa jel üzerinde çalıştırmak. 1 ve 2 şerit yüklü sgRNA tam uzunlukta, bozulmadan 120 nt RNA karşılık gelen bir grup gösterir. Şeritte 3 sgRNA enjeksiyon için uygun değildir bozulmuş bir RNA örnek gösterir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig3.jpg"> Şekil 3 : 24 enjekte hpf embriyo sağlık karşılaştırılması. Bir yaşam embriyo(a)geliştirilen 24-hpf, geliştirme (B) iptal edildi bir embriyo kolayca ayırt. (B) benzer veya büyük ölçüde olan embriyo gibi omurilik eğriliği (a), özellikleri değiştirmiş veya değiştirebileceği kafa ve göz geliştirme yemek kaldırılmalıdır. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig4.jpg"> Şekil 4 : SgRNA-Cas9 Heteroduplex hareketlilik tahlil microinjected zebra balığı embriyolar. Örnek başına 5 embriyo takımlık 72 toplanan hpf ve gDNA elde. Heteroduplex çözümlemenin açıklandığı gibi örnekleri eşit 500 ile doluydu ng DNA'ın. Şerit: M = 100 bp işaret; 1 = uninjected denetimi; 2 = enjeksiyon örnek 1; 3 = enjeksiyon örnek 2. Beklenen Grup boyutu = 98 bp.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig5.jpg"> Şekil 5 : Heteroduplex hareketlilik tahlil yetişkin CRISPR enjeksiyonlu zebra balığı kuyruk çıkarılan gDNA. Bir sgRNA ve Cas9 protein enjekte edildi embriyo yetişkinliğe (3 ay) yetiştirilmiştir. Balık B ve C heteroduplex Grup Sergi ve daha sonra iletilen germline indels tanımlamak için bred; bir pozitif heteroduplex grup göstermez çünkü Balık A daha sonraki analiz alışık değildi. Şerit: 1 = vahşi tipi kontrol; 2 balık A; = 3 balık B; = 4 = balık C. beklenen Grup boyutu = 98 bp. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig6.jpg"> Şekil 6 : Heteroduplex hareketlilik tahlil F0 CRISPR enjeksiyonlu zebra balığı aktarılan germline indels tanımlamak için bir vahşi tipli balık yetiştiriciliği tarafından oluşturulan tek embriyo. Zebra balığı çiftleş ve 72 h. tek embriyo için yetiştirilen F1 embriyo toplanmıştır ve heteroduplex çözümleme açıklandığı gibi yapılır. Şerit: 1 = vahşi tipi kontrol; 2-10 lane başına tek bir F1 embriyo =. Bu jel 7 dışarı-in 10 embriyo INDEL % 70'i germline iletim hızıyla belirten bir pozitif heteroduplex grup show gösterir. Beklenen Grup boyutu = 98 bp. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig7.jpg"> Şekil 7 : Heteroduplex hareketlilik tahlil yetişkin F1 zebra balığı kuyruk klip. Yetişkin F1 balık indels tanımlamak için HMA tarafından skorlanmıştır. Bir pozitif heteroduplex grup sergilenen balık mutasyon doğasını belirlemek için güçlendirilmiş ve geniş sıralama analiz için gönderilen PCR vardı. (A)şerit: 1 = vahşi tipi kontrol; 2 balık (4 bp silme, 1 bp uyuşmazlığı) =. (B) bu F1 balık aynı kurucusu tespit edilmiştir ve henüz desenlendirme, tek bir kurucusu birden çok değiştirilmiş gen aktarımını germline gösteren farklı heteroduplex göster. Şerit: 1 = vahşi tipi kontrol; 2 balık (4 bp ekleme, 7 bp uyuşmazlığı), B = 3 balık C (4 bp silme, 4 bp uyuşmazlığı) =. Her biri bu indels NGS tarafından belirlenen hedef gen kodlama dizisi içinde erken kodonu oluşturdu. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Hedeflenen genom modeli sistemi Danio rerio (zebra balığı) düzenleme büyük ölçüde CRISPR tabanlı yaklaşımlar ortaya çıkması tarafından kolaylaştırdı. Burada, akıcı, sağlam bir iletişim kuralı üretimi ve heteroduplex hareketlilik tahlil birleştirmek CRISPR elde edilen saçma allelleri tanımlaması ve yeni nesil sıralama kullanarak mutasyonlar tanımlaması için açıklar.

Verimli üretim ve Model sistem Danio rerio kimlik CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan Gene altını gizleme

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Bu prosedürün genel amacı, zebra balığında CRISPR / Cas9 teknolojisini kullanarak gen nakavtlarını sağlam ve ucuz bir şekilde tasarlamak için hedefli genom düzenlemesi yapmaktır. Bu yöntem, bir genin daha yüksek dereceli ökaryotlarda gelişimsel süreçlere nasıl katkıda bulunduğu gibi, bir omurgalı model sistemi bağlamında bir genin biyolojik rolü hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu basit ve sağlam prosedürlerle, lisans öğrencileri de dahil olmak üzere her deneyim seviyesindeki laboratuvar personeli, zebra balıklarında hedeflenen genomik modifikasyonları gerçekleştirebilir.Bu yönteme yeni olan kişiler, CRISPR mutajenezi için en uygun genomik hedefleri belirlemek, zebra balığı embriyo mikroenjeksiyonu yapmak ve modifiye alelleri tanımlamak için adım adım talimatları takip edebilmelidir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir, çünkü bu yöntem gerekli tekniklerden bir veya daha fazlasına aşina olmayan lisans öğrencileri için tasarlanmıştır. Kılavuz RNA üretimi için şablona özgü oligoların tasarımı için yönergeler metin protokolünde verilmiştir.Başlamak için, mililitre başına bir miligram çözelti oluşturmak için Cas9 proteinini tamponda askıya alın. Bu solüsyonu daha sonra kullanmak üzere eksi 80 santigrat derecede enjeksiyona hazır alikotlarda saklayın. Daha sonra sgRNA'yı, üreticinin talimatlarına göre bu makalenin materyallerinde önerildiği gibi bir in vitro transkripsiyon kiti ile sentezleyin.Sentezlenen sgRNA'yı RNAse içermeyen bir amonyum asetat çökeltmesi kullanarak saflaştırın. Sentezlenen RNA'ya 25 mikrolitre beş molar amonyum asetat ekleyin ve çözeltiyi girdaplama ile karıştırın. Daha sonra, numuneye 150 mikrolitre 200 geçirmez nükleaz içermeyen etanol ekleyin.Ve reaksiyonu en az 20 dakika boyunca eksi 80 santigrat derece dondurucuya koyun. Daha sonra numuneleri maksimum hızda santrifüjleyin. RNA peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı çıkarmak için bir pipet kullanın.Daha sonra bir mililitre% 70 etanol ekleyin ve tüpten kalan tuzu yıkamak için tüpü birkaç kez ters çevirin. Yedi dakika boyunca dört santigrat derecede maksimum hızda tekrar santrifüjleyin. Solüsyonun çoğunu çıkarmak için bir P1000 pipeti kullanın.Ardından, peleti bozmadan kalan çözeltinin mümkün olduğunca fazlasını çıkarmak için bir P200 pipeti kullanın. RNAse kontaminasyonunu önlemeye özen göstererek, tüpte sıvı damlası görünmeyene kadar peleti temiz bir alanda kurutun. Peletleri 30 mikrolitre RNAse içermeyen suda yeniden süspanse edin ve ürünü ölçmek için bir spektrofotometre kullanın.Eksi 80 santigrat derecede uzun süreli depolama için çözeltiyi destekleyin. Daha sonra 300 ila 500 nanogram sgRNA'yı eşit hacimde 2X RNA jel yükleme boyası ile karıştırın. Ardından, bir P1000 pipeti kullanarak, agaroz jel kuyucuklarının her birini birkaç kez çalışan tamponla temizleyin.Çözeltileri agaroz jel kuyucuklarına yükleyin ve jel üzerindeki RNA bantlarını ayırmak için yeterli süre boyunca jeli santimetre başına 10 voltta çalıştırın. Süre, elektroforez cihazına göre değişebilir. Genel olarak, boya cephesi jelin uzunluğunun 2 / 3'üne kadar çalıştırılmalıdır.Ardından bantları görselleştirmek için bir nükleik asit boyası kullanın. Bozulmamış RNA, burada gösterilen birinci ve ikinci şeritte olduğu gibi tek bir bant olarak görünür. Bozulmuş RNA, üçüncü şeritte olduğu gibi bir yayma olarak çalışır.İlk olarak, zebra balığı deneklerini metin protokolünde açıklandığı gibi enjeksiyonları gerçekleştirmeden önceki gece üreme için hazırlayın. Daha sonra Cas9 proteini ve sgRNA'yı ikiye bir oranında birleştirin. Cas9 ve sgRNA bir ribonükleoprotein kompleksi oluştururken, çözeltiyi oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Daha sonra, beş mikrolitrelik bir nihai hacim elde etmek için yeterli RNAse içermeyen suya 0,5 mikrolitre %2,5 fenol kırmızı çözelti ekleyin. Enjeksiyon iğnesini hazırlamak için, bir milimetrelik cam kılcal damarı çekmek için bir mikropipet çektirme kullanın. Daha sonra açılı bir açıklık elde etmek için elde edilen cam iğnenin ucunu bir tıraş bıçağıyla kesin.İğneyi bir mikroenjektöre bağlı bir mikromanipülatöre yerleştirin. Bir ışık mikroskobu kullanarak, iğne Petri kabına tutarlı bir şekilde bir nanometre çözelti enjekte edene kadar enjeksiyon basıncını ayarlayın. Embriyo mikroenjeksiyonu yapmadan önce, iğneler hazırlama ve sadece boya çözeltisi kullanarak kontrol embriyolarını enjekte etme alıştırması yapın ve gelişimden 24 saat sonra hayatta kalmayı kaydedin.Enjekte edilmemiş bir kontrole kıyasla% 90'dan fazla hayatta kalma elde edebilmelisiniz. Daha sonra, kontrol popülasyonu olarak 10 ila 15 embriyo seçin ve bunları ayrı bir etiketli Petri kabına yerleştirin. Bir transfer pipeti kullanarak, kalan embriyoları oda sıcaklığında bir enjeksiyon plakasına dikkatlice hizalayın.Bir diseksiyon mikroskobu altında, çözeltinin bir nanolitresini her embriyonun yumurta sarısı kesesine enjekte edin. Daha sonra enjekte edilen embriyoları etiketli bir Petri kabına geri koyun ve üzerlerini metilen mavisi içeren 1X E3 ortamı ile kaplayın. Enjekte edilen embriyoları 24 saat boyunca 28 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin.Ardından, ölü veya anormal şekilde gelişen bireyleri çıkarmak için enjekte edilen embriyoları inceleyin. İlk olarak, enjekte edilen embriyoları içeren plakalardan iki set 72 saatlik embriyo ve enjekte edilmemiş kontrol grubundan bir set 72 saatlik beş embriyoyu mikrosantrifüj tüplerine toplayın. Her embriyo setinden ortamı nazikçe pipetleyin ve uyuşturun.Anesteziyi iki dakika sonra çıkarın ve 45 mikrolitre 50 milimolar sodyum hidroksit ekleyin. Daha sonra numuneleri 95 derecede 10 dakika inkübe edin. Ardından, numuneleri inkübatörden çıkarın ve oda sıcaklığına soğumalarını bekleyin.Beş mikrolitre bir molar pH tris hidroklorür ekleyin ve numuneleri kuvvetlice girdaplayın. Daha sonra çözeltiyi oda sıcaklığında maksimum hızda üç dakika santrifüjleyin. Genomik DNA'yı içeren süpernatanı yeni bir etiketli tüpe aktarın ve gDNA'yı eksi 20 santigrat derecede saklayın.Heterodupleks analiz için bir PCR fragmanını amplifiye etmek için metinde açıklandığı gibi sgRNA hedef bölgesinin etrafını amplifiye etmek üzere tasarlanmış primerleri kullanın. PCR reaksiyonunun ürünlerini saflaştırmak için bir PCR temizleme kiti kullanın. Numuneleri 30 mikrolitre su ile seyreltin ve DNA'yı ölçmek için bir spektrofotometre kullanın.PCR amplikonları içeren tüpleri kaynar su banyosunda yüzen bir rafa yerleştirin. Ardından, %30 poliakrilamid kullanarak %15'lik bir poliakrilamid TBE jeli hazırlayın. Jel sertleştikten sonra, TBE çalışma tamponu olan bir elektroforez aparatına yerleştirin.Ardından 500 nanogram yeniden tavlanmış PCR ürünü yükleyin ve her bir sgRNA numunesi setinin yanına bir kontrol yükleyin. Jeli 150 voltta iki buçuk saat veya boya önü jelin dibine gelene kadar çalıştırın. HMA'da heterodubleks bantlar gösteren enjekte edilmiş zebra balığı embriyolarını yetişkinliğe kadar büyütün.HMA'yı yorumlamak için, vahşi tip enjekte edilmemiş kontrolün PCR'sinden homodubleks bandın yoğunluğunu karşılık gelen enjekte edilen numunelerle karşılaştırın. Yeterli kesim meydana gelmişse, enjekte edilen balıktan gelen bandın yoğunluğu, yabani tip kontrolünden yaklaşık% 50 daha düşük olmalıdır. Potansiyel kurucu ebeveyn balıklarında indellerin varlığını doğrulamak için, balığı %0.004 trisaf içinde uyuşturun ve kuyruk yüzgecinin 1/2 ila 3/4'ünü çıkarmak için temiz bir tıraş bıçağı kullanın.Ardından kuyruğu 45 mikrolitre 50 milimolar sodyum hidroksit içine yerleştirin. Balıkları bir geri kazanım tankına geri koyun ve daha önce açıklandığı gibi gDNA ekstraksiyonunu gerçekleştirin. Ardından, bireyin CRISPR enjeksiyonu ile başarılı bir şekilde değiştirilip değiştirilmediğini belirlemek için kuyruk klipsi gDNA üzerinde bir HMA gerçekleştirin.Daha sonra kuyruk DNA'sında heterodubleks bantlar sergileyen yetişkinleri vahşi tip balıklara yetiştirin. Havuzların HMA analizine dayalı olarak F1 balığı oluşturmak için kurucu balıkları seçin. Son olarak, indel'in doğasını karakterize etmek için ilgilenilen balığın gDNA'sını sıralayın.CRISPR reaktiflerinin başarılı bir şekilde üretilmesi ve mikroenjeksiyonunun ardından, zebra balığı embriyoları HMA kullanılarak açık fenotipler ve indel oluşumu açısından analiz edildi. Tirozinazda Cas9'un neden olduğu indel oluşumu pigmentasyon kaybına neden olur ve döllenmeden 48 saat sonra kolayca puanlanır. Açık gelişimsel fenotiplerle sonuçlanmayan CRISPR modifiye alellerinin tanımlanması HMA kullanılarak gerçekleştirilir.İlgilenilen genin başarılı bir şekilde hedeflenmesi, heterodubleks bantların oluşumuna ve üçüncü ve dördüncü şeritlerde olduğu gibi homodubleks bandın yoğunluğunun azalmasına neden olur. Omurgalı bir organizma ile çalışmanın etik sorumluluklar taşıdığını unutmayın. Bu protokol, bu prosedürü gerçekleştirirken dikkate alınması gereken bir hedef olan nakavt elde etmek için gereken zebra balığı sayısını en aza indiren stratejileri açıklar.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, germ hattında yüksek verimlilikle iletilecek CRISPR modifiye alelleri taşıyan zebra balıklarını hızlı bir şekilde oluşturmak ve tanımlamak için kullanılabilir. Daha da önemlisi, bu teknik, lisans öğrencileri ve daha önce çok az deneyimi olan diğer kişiler için uygun olan düşük maliyetli bir yaklaşım olacak şekilde optimize edilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, zebra balığı kullanarak CRISPR tabanlı bir gen nakavt yaklaşımının nasıl kolayca tasarlanacağını ve uygulanacağını iyi anlamış olmalısınız.

efficient-production-identification-crisprcas9-generated-gene

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu videoda, bileşikleri Zebra balığı yumurta sarısı kesesine vermek için bir Embriyo mikroenjeksiyon tekniği açıklanmaktadır.

Embriyo Mikroenjeksiyonu: Zebra Balığı Sarısı İçine Bir Bileşik Verme Tekniği

Floresan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) jel elektroforezi kılcal çiftler burada tarif edilen genotipleme tekniği, nükleaz aracılı nakavt klonları yüksek verimli genotipleme için izin verir. Diğer Genotipleme teknikleri karşılaştığı sınırlamaları ortadan ve dizileme yöntemleri maliyet açısından daha etkilidir.

CRISPR genotipine bir Floresan PCR kılcal jel elektroforezi Tekniği / yüksek verimli bir Format Nakavt Mutants Cas9 aracılı

Somatik hücre dizilerini genetik olarak manipüle etme becerisindeki son gelişmeler, temel ve uygulamalı araştırmalar için büyük potansiyele sahiptir. Burada, CRISPR / Cas9'un ürettiği nakavt üretimi ve seçilebilir işaretlerin kullanılıp kullanılmadığı memeli hücre hatlarında tarama için iki yaklaşım sunuyoruz.

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

Burada, CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ve homoloji bağımlı onarım şablonları kullanarak C. elegans genom mühendisi bir yöntem mevcut.

Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

Burada CRISPR/Cas9 genom nakavt elektrikli balık üretimi ve arkası için bir protokol sunulmuştur. Ayrıntılı olarak özetlenen bir gymnotiform ve mormyrid hem de gerekli moleküler biyoloji, Üreme ve hayvancılık gereksinimleri ve cas9 indel F0 larvaları üretmek için enjeksiyon teknikleri vardır.

Kıvılcım Susturma: CRISPR/Cas9 Zayıf Elektrikli Balıklarda Genom Düzenleme

Bu protokolün amacı, C. elegans genomunun monte edilmiş ribonikleoprotein kompleksleri ve tarama için dpy-10 co-CRISPR işaretleyicisi kullanılarak sorunsuz CRISPR/Cas9 düzenlemesini sağlamaktır. Bu protokol, C. elegans'ta eklemeler, silmeler, gen değiştirmeleri ve kodon ikameleri de dahil olmak üzere çeşitli genetik değişiklikler yapmak için kullanılabilir.

CRISPR/Cas9 C. elegans rbm-3.2 Geninin dpy-10 Co-CRISPR Tarama İşaretçisi ve Monte Edilmiş Ribonikleoprotein Kompleksleri kullanılarak düzenlenmesi.

Burada CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi tarafından oluşturulan Helicoverpa armigera (Hübner) embriyo mikroenjeksiyonu ve nakavt mutant tanımlama protokolü sunulmaktadır. Mutant böcekler, in vivo'daki farklı genler arasında gen fonksiyonu ve etkileşiminin daha fazla araştırılmasına olanak tanır.

CRISPR/Cas9 Genom Düzenlemeli Helicoverpa Armigera'nın (Hübner) Embriyo Mikroenjeksiyonu ve Nakavt Mutant Tanımlaması

Bu makalede, sineklerde RNA hedefleme cas13d enzimini (RfxCas13D) kullanmak için ayrıntılı bir protokol özetlenmiştir.

CRISPR/CasRx kullanarak Drosophila Melanogaster'da Her Yerde ve Dokuya Özgü RNA Hedeflemesi

Erken gelişim, maternal kalıtsal ürünlere bağlıdır ve bu ürünlerin çoğunun rolü şu anda bilinmemektedir. Burada, tek bir nesilde anne-etki fenotiplerini tanımlamak için CRISPR-Cas9 kullanan bir protokol tanımladık.

Maternal Crispantlarla Erken Gelişimde Annelik İfade Edilen Genlerin Rolünün Belirlenmesi

CRISPR-Cas teknolojileri, genom düzenleme alanında devrim yarattı. Bununla birlikte, istenen germline düzenlemesini bulmak ve izole etmek büyük bir darboğaz olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, bu protokol, standart PCR, kısıtlama sindirimi ve jel elektroforezi tekniklerini kullanarak germline düzenlemeleri için F0 CRISPR enjekte edilen zebra balığı spermini hızlı bir şekilde taramak için sağlam bir yöntem açıklamaktadır.

Zebra balıklarında germline düzenlemelerinin hızlı izolasyonu için sperm taraması

Öğrenin, Danio rerio kullanarak CRISPR/Cas9 ile gen düzenleme ve gen knock-out'ları oluşturma yöntemlerini. Bu protokol, gelişim biyolojisi araştırmalarında gen fonksiyonlarını incelemek için güvenilir bir yaklaşım sunar.

Verimli üretim ve Model sistem Danio rerio kimlik CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan Gene altını gizleme

Daha fazla video keşfet