BoTest Matrix Tahliller kullanma Kompleksi Matris itibaren İzolasyon ve Botulinum nörotoksin Kantitasyonu

Bu prosedürün genel amacı, farmasötik, çevresel ve gıda örnekleri gibi karmaşık matrislerde botulinum nörotoksininin proteolitik aktivitesini ölçmektir. Bu, uygun pH ve viskozite koşullarını oluşturmak için önce test ve gerekirse standart eğri numunelerinin işlenmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, botulinum nörotoksini, antikor kaplı manyetik boncuklar kullanılarak numunelerden immüno-çökeltilir.

Daha sonra manyetik boncuklar, enterferans yapan bileşikleri uzaklaştırmak için iyice yıkanır ve optimize edilmiş bir reaksiyon tamponunda yeniden süspanse edilir. Son olarak, yıkanan boncuklar bir protein raportörü ile inkübe edilir ve raportörün zaman içindeki bölünmesini spektroskopik olarak ölçer. Sonuç olarak, test numunelerindeki raportör bölünmesinin standart eğri numuneleri ile karşılaştırılması, test numunelerindeki botulinum toksininin aktivitesini fareden fareye yakın biyo-tahlil duyarlılığı ile ölçmek için kullanılır.

Bu tekniğin fare, biyo-tahlil, immünolojik ve diğer floresan yöntemler gibi diğer yöntemlere göre temel avantajları, bu testin hayvanların kullanımını gerektirmemesi ve gıda, çevre ve farmasötik numunelerde bulunan oldukça karmaşık matrislerde kullanım için gösterilmiş olmasıdır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, dikkatli numune işleme ve seyreltme gerektiğinden mücadele edebilir. Bu prosedürü göstermek, Bio Sentinel'de bir bilim adamı olan Dr.Mark Dunning olacak.

Test numunelerinin miktarını belirlemek için standart bir eğri oluşturmak için metin protokolüne göre tamponları hazırlayın, 10 artı veya eksi 0.01 gram katı gıda numunesini 50 mililitrelik konik bir tüpe tartın ve bu numuneyi bir kenara koyun, ikinci bir tüpte seyreltici olarak kullanılacaktır, iki artı veya eksi 0.01 gram katı gıda numunesi tartılır. Botulinum nörotoksini ekleyin veya iki gram gıda numunesinin yüzeyine, gram gıda başına 30.000 MLD 50'lik bir nihai konsantrasyona satın alın. Seyreltici ve çivili numuneleri oda sıcaklığında veya dört santigrat derecede iki saat boyunca inkübe ederek bota gıda matrisi ile etkileşime girmesi için zaman tanıyın.

Doğal bir kontaminasyonu taklit ederek, ek numune türleri için metin protokolüne bakın. Daha sonra, çivili ve çivisiz numunelere gram gıda başına bir mililitre GPB ekleyin ve iyice karışana kadar homojenize etmek için bir havaneli kullanın. 10 gramlık seyreltici numunenin yaklaşık toplam hacminden çivili bir numune olan iki gramlık botun toplam hacmini tahmin edin.

Daha sonra, 10 gramlık seyreltici numuneye 10'uncu hacimde 10 x nötralizasyon tamponu ekleyin ve iki gram, toplam hacimlerine göre çivili bir numune satın aldı. Karışık numuneler ters çevrilerek iyice karıştırılır, her iki numuneyi de 6.000 kez yerçekimi ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyerek kısmen berraklaştırır. Daha sonra süpernatanları hemen çıkarın ve botu kullanarak yeni tüplere aktarın, D olarak çivili bir numune ve seyreltici olarak çivili olmayan numune, 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerinde kalan standart eğri numunelerini oluşturur.

Katı gıda numuneleri hazırlamak için, iki artı veya eksi 0.01 gram katı, bilinmeyen numuneyi 50 mililitrelik konik bir tüpe tartarak başlayın. İki mililitre GPB ekleyin ve numuneyi homojenize etmek için bir havaneli kullanın. Daha sonra, numuneye 10 x nötralizasyon tamponunun hacminin 10'da birini ekleyin ve numuneyi 6.000 kez yerçekimi ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleme ile kısmen arıttıktan sonra ters çevirerek iyice karıştırın ve hemen en az 750 mikrolitre süpernatanı bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Bu bilinmeyen bir seyreltmedir. Bilinmeyen seyreltme iki ve üç olarak etiketlenmiş iki tüpe 675 mikrolitre seyreltici ekleyin. Seyreltici, standart eğri üretimi için kullanılan aynı işlenmiş malzeme olacaktır.

75 mikrolitre seyreltme bir tanesini seyreltme iki tüpüne aktararak ve karıştırarak seri seyreltme yapmak için bir seyreltme kullanın. Daha sonra 75 mikrolitre seyreltme ikisini seyreltme üç tüpüne aktarın ve karıştırın. Numuneleri netleştirmek için en az 14.000 kez beş dakika santrifüjleyin. Ciddiyet.

Süpernatanları hemen çıkarın ve numuneler için bir plaka oluşturmak için yeni tüplere aktarın, her bilinmeyen numuneye her oyuğa 20 mikrolitre 10 x bağlama tamponu ekleyin ve standart kavisli numuneler D bir ila D sekiz için üç kuyu gerekir ve numune D dokuz altı kuyu gerektirir. İlgili kuyucuklara her numuneden 200 mikrolitre ekleyin ve plakayı 10 saniye karıştırmak için bir mikroplaka karıştırıcı kullanın. IPA boncuklarını en yüksek hızda veya tamamen yeniden askıya alınana kadar 10 saniye boyunca vorteksleyin.

Daha sonra her bir numune kuyucuğuna 20 mikrolitre boncuk pipetleyin ve plakayı 30 saniye karıştırın. Plakayı otomatik bir plaka yıkayıcı kullanarak yıkamak için plakayı 750 RPM ve 25 santigrat derece veya oda sıcaklığında iki saat boyunca dönen bir plaka inkübatörde inkübe edin. Ana programı çalıştırdıktan sonra, plakayı plaka yıkayıcı üzerindeki 96 kuyulu manyetik boncuk ayırma plakasına yerleştirin.

Ardından ana yıkama programını çalıştırın. Program tamamlandığında, plakayı yıkayıcıdan çıkarın. Her numune kuyucuğuna 50 mikrolitre bir x reaksiyon tamponu ekleyin ve 30 saniye karıştırın.

Bot test matrisi testini başlatmak için 50 mikrolitre 0.5 mikromolar AE raportör ekleyin. Kenar etkilerini önlemek için her numune kuyusuna, kullanılmayan her birine 100 mikrolitre su ekleyin. Plakayı kapatmak, ışıktan korumak ve 750 RPM ve 25 santigrat derece veya oda sıcaklığında inkübe etmek için tavan bandı kullanın.

Her okuma zamanında, plakayı inkübatörden çıkarın. Tavan bandını çıkarın ve plakayı hemen 96 kuyulu manyetik boncuk ayırma plakasına yerleştirin, boncukların iki dakika ayrılmasına izin verin. Plakayı mikroplaka okuyucuya yerleştirin ve emisyonları yaklaşık 434 nanometrede uyarma altında yaklaşık 470 ve yaklaşık 526 nanometrede ölçün.

Ek okuma süreleri isteniyorsa, boncukları mikroplaka karıştırıcı üzerinde 30 saniye boyunca tekrar askıya aldıktan sonra, plakayı tekrar kapatın ve inkübatöre geri koyun. Burada test sonuçları gösterilmiştir: Bot a holo toin kullanılarak PBS'ye çivilenmiş ve AE muhabiri ile iki, dört ve 24 saatlik inkübasyonların ardından test edilmiştir. İhbaristin bot tarafından bölünmesi, plaka okuyucumuz tarafından ölçülen emisyon oranında, sağlam muhabir için yaklaşık 2,7 ve tam parçalanmış muhabir için yaklaşık 0,7 olarak bir azalma olarak ölçülür.

Eğrideki sola kayma ile görüldüğü gibi plaka okuyucular arasında belirli değerler farklı olacaktır, raportör ile uzun süreli kuluçka süresi, raportör bölünmesinin artmasına neden olur. Üçlü olarak test edilen veri noktaları, ortalamanın düşük standart sapmasını gösterir ve azalan toksin yükü ile artan emisyon oranının beklenen eğilimini takip eder. Testin bu beklenen eğilimi takip etmemesi, seyreltme üretimi sırasında bir hatayı veya bot A içermeyen kontrollerin emisyon oranlarını çizen verilerin de inkübasyon sırasında sabit kaldığını ve spesifik olmayan proteaz aktivitesinin olmadığını gösteren bir hatayı gösterebilir.

Bu şekil, standart bir eğriye karşı bilinmeyen herhangi bir numuneyi tespit etmek veya miktarını belirlemek için kullanılan genel metodolojiyi gösterir ve farmasötik bot a numunelerinin miktarını belirler. PBS'de saflaştırılmış bot, bir holo toin ile standart bir eğri oluşturuldu ve bu testte% 0.9 salin içinde rehidre edilmiş tek bir 100 birim liyofilize Botoks şişesinden üretilen ilaç ürününün seyreltmelerine paralel olarak işlendi, standart eğrinin doğrusal kısmı 2.11 ile 1.05 emisyon oranı arasındadır ve şekilde kesikli kutu ile gösterilir. Bu doğrusal aralığa giren üç bilinmeyenin konsantrasyonları daha sonra standart eğriden enterpolasyonlu hale getirildi.

Bu deneyde, katı ve sıvı gıda matrisleri olarak taze domates ve% 2'lik süt kullanıldı ve çekirdek hollo, toin ve nörotoksin ile ilişkili proteinlerden oluşan bir kompleks ile çivilendi. Bu kombinasyon, burada gösterildiği gibi doğal bir clostridium kontaminasyonu sırasında üretilen toksine benzediği için seçilmiştir. Bot A'nın geri kazanımı her iki matriste de gözlenir.

Ayrıca, raportör ile artan inkübasyon süresi, tahlil hassasiyetini arttırır, ancak toksin içermeyen kontroller için emisyon oranlarının azalmasına neden olmaz, bu da testteki gıdadan spesifik olmayan proteaz taşınması değil, bot A'dan gözlemlenen bölünme sonuçlarını gösterir. Gösterilen her bir zaman noktasında her iki gıda için bot A-L-O-D-L-O-Q ve EC 50 bu tabloda özetlenmiştir. LOD ve LOQ, arka planın altında sırasıyla üç ve 10 standart sapmadan daha düşük bir emisyon oranına sahip en düşük konsantrasyonlu numune olarak tanımlanır.

Matris etkileri, toksinin boncuklara bağlanmasını ve yıkama sırasında boncukların geri kazanılmasını etkileyebileceğinden, LOD ve LOQ'da bir miktar matristen matrise değişkenlik beklenir. Verilerden elde edilen domateslerden daha fazla% 2 sütten daha fazla toksin geri kazanımı olduğu görülse de, bu farkın çoğu, GPB'deki domates örneklerini homojenize etmek için gereken ek seyreltmeden kaynaklanmaktadır. Domatesler, katı bir gıda matrisi olmasının yanı sıra, pH ve iyonik kuvvet ayarının tahlil başarısı için kritik olduğu dikkate değer bir numune türüdür.

Bu şekil, 10 x nötralizasyon tamponu dahil olsun veya olmasın domatesleri test ederken tahlil tepkilerini göstermektedir. Tamponun eklenememesi, numunelerden bot A'nın zayıf bir şekilde geri kazanılmasına neden olur ve test edilen tüm bot A konsantrasyonlarında 10 x nötralizasyon tamponunun eklenmesi için sabit bir emisyon oranı ile gösterilir, ancak hassas toksin tespiti ile sonuçlanır, spesifik olmayan proteazlar gıda numunesine endojen olabilir veya Clostridium kültürü gibi saflaştırılmamış bot preparatları kullanılırken sokulabilir, süpernatanlar ve AE muhabirini parçalayarak yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir. Bu örnek, artık bot A tarafından parçalanmayan modifiye edilmiş bir raportör kullanan bir kültür süpernatantı olan Clostridium botunda bulunan spesifik olmayan proteaz aktivitesini göstermektedir.

Süpernatant, proteaz inhibitörlerinin eklenmesiyle etkili bir şekilde reddedilen önemli proteaz aktivitesi içerir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, numune tipine ve toksin yüküne bağlı olarak toplam dört ila 26 saatlik test süresi arasında gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, floresan bazlı bir protein raportör sisteminde immünopresipitasyon kullanarak karmaşık örneklerden botulinum nörotoksininin nasıl izole edileceğini ve ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.

Botulinum nörotoksinleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken eldiven, laboratuvar kodları, kimyasal ve biyolojik güvenlik dolapları gibi önlemlerin kullanılması gerektiğini unutmayın.