BoTest Matrix Tahliller kullanma Kompleksi Matris itibaren İzolasyon ve Botulinum nörotoksin Kantitasyonu

Bu prosedürün genel amacı, farmasötik, çevresel ve gıda örnekleri gibi kompleks matrislerdeki botulinum nörotoksinin proteolitik aktivitesini nicelendirmektir. Bu işlem, öncelikle uygun pH ve viskozite koşullarını sağlamak için gerekirse test ve standart eğri örneklerinin işlenmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, botulinum nörotoksin, antikor kaplı manyetik boncuklar kullanılarak örneklerden immünopresipite edilir.

Ardından, girişim yapan bileşiklerin uzaklaştırılması için manyetik boncuklar iyice yıkanır ve optimize edilmiş bir reaksiyon tamponu içinde yeniden süspanse edilir. Son olarak, yıkanan boncuklar bir protein raporlayıcı ile inkübe edilir ve raporlayıcının zamanla gerçekleşen kesimi spektroskopik olarak ölçülür. Nihayetinde, test örneklerindeki raporlayıcı kesiminin standart eğri örnekleriyle karşılaştırılması, test örneklerindeki botulinum toksinin aktivitesinin, fareye yakın biyolojik deney hassasiyetinde nicelendirilmesi için kullanılır.

Bu tekniğin fare, biyolojik analiz, immünolojik ve diğer floresan yöntemler gibi diğer yöntemlere göre temel avantajları, bu analizinin hayvan kullanımını gerektirmemesi ve gıda, çevre ve farmasötik numunelerde bulunan yüksek derecede karmaşık matrislerde kullanımının kanıtlanmış olmasıdır. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, dikkatli numune işleme ve seyreltme gerekliliği nedeniyle zorluk çekebilirler. Bu prosedürü Bio Sentinel'de bilim insanı olan Dr. Mark Dunning uygulamalı olarak gösterecektir.

Test örneklerini nicelendirmek için bir standart eğri oluşturmak amacıyla tamponları metin protokolüne göre hazırlayın, 50 mililitrelik konik bir tüpe 10 artı veya eksi 0,01 gram katı gıda örneği tartın ve bu örneği kenara ayırın; bu örnek seyreltici olarak kullanılacaktır. İkinci bir tüpe iki artı veya eksi 0,01 gram katı gıda örneği tartın. İki gramlık gıda örneğinin yüzeyine, gıdanın gramı başına 30.000 MLD₅₀ son konsantrasyona ulaşacak şekilde botulinum nörotoksin veya BoNT ekleyin. BoNT'nin gıda matrisi ile etkileşime girmesi için seyreltici ve spike edilmiş örnekleri oda sıcaklığında veya 4 °C'de iki saat boyunca inkübe edin.

Doğal bir kontaminasyonu taklit etmek için ek numune tipleri için metin protokolüne başvurun. Ardından, eklenmiş (spiked) ve eklenmemiş numunelerin her bir gram gıda başına bir mililitre GPB ekleyin ve tamamen karışana kadar bir havan eli kullanarak homojenleştirin. İki gramlık eklenmiş numunenin toplam hacmini, 10 gramlık dilüent numunesinin yaklaşık toplam hacminden ekstrapole edin.

Ardından, 10 gramlık dilüent örneğine ve toplam hacimlerine bağlı olarak iki gramlık spike edilmiş örneğe, 10x nötralizasyon tamponuyla hacmin 1/10'u kadar ekleme yapın. Örnekleri ters çevirerek iyice karıştırın ve her iki örneği de 4 °C'de 6.000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüj ederek kısmen berraklaştırın. Daha sonra süpernatantları hemen uzaklaştırıp yeni tüplere aktarın; spike edilmiş örneği D1, spike edilmemiş örneği ise dilüent olarak kullanın. Kalan standart eğri örneklerini 1,5 mL'lik mikro santrifüj tüplerinde hazırlayın.

Katı gıda örneklerini hazırlamak için, öncelikle 50 mL'lik konik tüpe 2 ± 0,01 g bilinmeyen katı örneği tartarak ekleyin. 2 mL GPB ilave edin ve örneği homojenize etmek için bir havan eli kullanın. Ardından, örneğe hacmin 1/10'ü kadar 10x nötralizasyon tamponu ekleyin ve ters çevirerek iyice karıştırın. Örnek, 4 °C'de 6.000 ×g'de 10 dakika santrifüj edilerek kısmen berraklaştırıldıktan hemen sonra, süpernatantın en az 750 µL'si bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Bu, bilinmeyen dilüsyon bir'dir. Bilinmeyen dilüsyon iki ve üç olarak etiketlenmiş iki tüpe 675 µL dilüent ekleyin. Dilüent, standart eğri oluşturma için kullanılan işlenmiş materyalin aynısı olacaktır.

Dilüsyon birin 75 µL'sini dilüsyon iki tüpüne aktarıp karıştırarak seri dilüsyon yapın. Ardından, dilüsyon ikiden 75 µL'yi dilüsyon üç tüpüne aktarıp karıştırın. Örnekleri berraklaştırmak için, en az 14,000 ×g hızında beş dakika boyunca santrifüj edin.

Süpernatantları hemen uzaklaştırın ve örnekler için bir plak hazırlamak amacıyla yeni tüplere aktarın; her bir bilinmeyen örnek kuyucuğuna 20 µL 10 x bağlama tamponu ekleyin; D1'den D8'e kadar olan standart eğri örnekleri üçer kuyucuk, D9 örneği ise altı kuyucuk gerektirir. Her bir örnekten ilgili kuyucuklara 200 µL ekleyin ve plağı karıştırmak için bir mikroplaka karıştırıcıyı 10 saniye boyunca kullanın. IPA boncuklarını en yüksek hızda veya tamamen süspanse olana kadar 10 saniye boyunca vorteksleyin.

Ardından, her bir örnek kuyucuğuna 20 µL boncuk pipetleyin ve plakayı 30 saniye boyunca karıştırın. Plakayı, otomatik bir plaka yıkayıcı kullanarak yıkamak için döner plaka inkübatöründe 750 RPM ve 25 °C veya oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. Hazırlama (prime) programını çalıştırdıktan sonra, plakayı plaka yıkayıcı üzerindeki 96 kuyucuklu manyetik boncuk ayırma plakasına yerleştirin.

Ardından ana yıkama programını çalıştırın. Program tamamlandığında, plakayı yıkama cihazından çıkarın. Her bir örnek kuyucuğuna 50 µL 1x reaksiyon tamponu ekleyin ve 30 saniye boyunca karıştırın.

Bot test matris analizini başlatmak için, her bir örnek kuyucuğuna 50 µL 0,5 µM AE reporter ekleyin. Kenar etkilerini önlemek için kullanılmayan her bir kuyucuğa 100 µL su ekleyin. Plakayı mühürlemek için tavan bandı kullanın, ışık almayacak şekilde koruyun ve 750 RPM'de 25 °C'de veya oda sıcaklığında inkübe edin.

Her okuma zamanında, plakayı inkübatörden çıkarın. Üst bandı çıkarın ve plakayı hemen 96 kuyucuklu manyetik boncuk ayırma plakası üzerine yerleştirerek boncukların iki dakika boyunca ayrılmasına izin verin. Plakayı mikroplaka okuyucuya yerleştirin ve yaklaşık 434 nanometre eksitasyon altında, yaklaşık 470 ve yaklaşık 526 nanometrelerde emisyonları ölçün.

Ek okuma süreleri istenirse, boncuklar mikroplaka karıştırıcıda 30 saniye boyunca yeniden süspande edildikten sonra plakayı tekrar kapatın ve inkübatöre geri yerleştirin. Burada, PBS'ye spike edilmiş bot holotoksin kullanılarak AE raporlayıcısı ile iki, dört ve 24 saatlik inkübasyonlar sonrası test edilen analiz sonuçları gösterilmiştir. Raporlayıcının bot tarafından kesilmesi, plaka okuyucumuz tarafından ölçülen emisyon oranındaki azalma olarak ölçülür; bu oran sağlam raporlayıcı için yaklaşık 2,7 iken tamamen kesilmiş raporlayıcı için yaklaşık 0,7'dir.

Eğrideki sola kaymadan da görüleceği üzere, plak okuyucular arasında spesifik değerler farklılık gösterecektir; raporlayıcı ile uzatılmış inkübasyon süresi, artmış raporlayıcı parçalanması ile sonuçlanır. Üç paralel olarak test edilen veri noktaları, ortalamanın düşük standart sapmasını göstermekte ve toksin yükü azaldıkça emisyon oranının arttığı beklenen trendi takip etmektedir. Analizin bu beklenen trendi takip etmemesi, dilüsyon hazırlama veya veri çizimi sırasında bir hata olduğunu gösterebilir; bot A içermeyen kontrollerin emisyon oranları da inkübasyon boyunca sabit kalarak spesifik olmayan proteaz aktivitesinin olmadığını göstermektedir.

Bu şekil, herhangi bir bilinmeyen örneği bir standart eğriye karşı tespit etmek veya miktarını belirlemek için kullanılan genel metodolojiyi göstermekte ve farmasötik bot a örneklerini nicelleştirmektedir. PBS içerisinde saflaştırılmış bot, a holo toin ile bir standart eğri oluşturulmuş ve bu analizde, 0,9% salin ile rehidrate edilmiş liyofilize Botox'un tek bir 100 ünitelik flakonundan hazırlanan ilaç ürünü dilüsyonları ile paralel olarak işlenmiştir; standart eğrinin doğrusal kısmı 2,11 ile 1,05 arasındaki bir emisyon oranına denk gelmektedir ve şekilde kesikli kutu ile belirtilmiştir. Bu doğrusal aralığa düşen üç bilinmeyenin konsantrasyonları daha sonra standart eğriden interpolasyon yoluyla belirlenmiştir.

Bu deneyde, katı ve sıvı gıda matrisleri olarak taze domates ve %2 süt kullanılmış ve bunlar core hollo, toin ve nörotoksinle ilişkili proteinlerden oluşan bir kompleks olan bot A ile spiking işlemine tabi tutulmuştur. Bu kombinasyon, burada gösterildiği gibi doğal clostridium kontaminasyonu sırasında üretilen toksine benzediği için seçilmiştir. Her iki matriste de bot A geri kazanımı gözlemlenmiştir.

Ayrıca, raporlayıcı ile inkübasyon süresinin artırılması assay hassasiyetini artırırken, toksin içermeyen kontrollere ait emisyon oranlarında bir azalmaya yol açmamaktadır; bu durum, gözlemlenen kesilmenin bot A'dan kaynaklandığını ve assay'deki gıdalardan gelen spesifik olmayan proteaz taşınımından kaynaklanmadığını göstermektedir. Her iki gıda için gösterilen her zaman noktasındaki bot A-L-O-D-L-O-Q ve EC 50 değerleri bu tabloda özetlenmiştir. LOD ve LOQ sırasıyla, emisyon oranı arka planın üç ve 10 standart sapma altında olan en düşük konsantrasyonlu örnek olarak tanımlanmıştır.

Matris etkileri, toksinin boncuklara bağlanmasını ve yıkama sırasında boncukların geri kazanımını etkileyebileceğinden, LOD ve LOQ değerlerinde matristen matrise değişkenlik beklenmektedir. Verilere bakıldığında %2'lik sütten domatese göre daha fazla toksin geri kazanımı olduğu görülse de, bu farkın büyük bir kısmı domates örneklerini GPB içinde homojenize etmek için gereken ek seyreltmeden kaynaklanmaktadır. Domatesler, katı bir gıda matrisi olmanın yanı sıra, pH ve iyonik güç ayarının analiz başarısı için kritik olduğu dikkat çekici bir örnek türüdür.

Bu şekil, 10 x nötralizasyon tamponu eklenmiş veya eklenmemiş domateslerin test edilmesi durumundaki assay yanıtlarını göstermektedir. Tamponun eklenmemesi, örneklerden bot A'nın düşük düzeyde geri kazanımıyla sonuçlanır ve bu durum, test edilen tüm bot A konsantrasyonlarında sabit bir emisyon oranı ile gösterilmiştir; ancak 10 x nötralizasyon tamponunun eklenmesi, hassas toksin deteksiyonu ile sonuçlanır, spesifik olmayan proteazlar gıda örneğine endojen olabilir veya Clostridium kültürü, süpernatantlar gibi saflaştırılmamış bot preparatları kullanıldığında ortama girebilir ve AE reporter'ını parçalayarak yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir. Bu örnek, bot A tarafından artık parçalanmayan modifiye bir reporter kullanılarak Clostridium bot a kültür süpernatantlarında bulunan spesifik olmayan proteaz aktivitesini göstermektedir. Yüksek düzeydeki reporter parçalanması kültürü belirtir.

Süpernatant önemli düzeyde proteaz aktivitesi içerir ve bu durum, proteaz inhibitörlerinin eklenmesiyle etkili bir şekilde nötralize edilir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik numune tipine ve toksin yüküne bağlı olarak toplam 4 ila 26 saatlik analiz süresi içerisinde gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, floresan tabanlı bir protein raporlayıcı sistemde immünopresipitasyon kullanarak kompleks numunelerden botulinum nörotoksinin nasıl izole edileceği ve miktarının nasıl belirleneceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

Botulinum nörotoksinlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven, laboratuvar önlüğü, kimyasal ve biyolojik güvenlik kabinleri gibi önlemler kullanılmalıdır.