Name: BoTest Matrix Tahliller kullanma Kompleksi Matris itibaren İzolasyon ve Botulinum nörotoksin Kantitasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-03T22:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Keşfedin botulinum nörotoksinin karmaşık matrislerden izolasyonu ve kantitasyonu için immunopresipitasyon yöntemini. Bu hassas analiz gıda güvenliği ve çevre izleme alanlarında hızlı, güvenilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar değerli tartışmalar ve tavsiye için H. Olivaresi ve D. Ruge teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma, bir NSF SBIR ödülü (BioSentinel Inc IIP-1127245) ve Savunma Bakanlığı sözleşme (BioSentinel Inc W81XWH-07-2-0045) tarafından kısmen desteklenmiştir.

FM Dunning, TM Piazza, F. Zeytin ve WC Tucker BioSentinel Inc BioSentinel çalışanları veya sahipleri şu anda üretir ve bu raporda sunulan reaktiflerin bazı ticari gelmiştir.

Bu protokol BoNT&#39;yi / karmaşık matrisler bir kompleks, holotoksin veya Clostridium kültür süpernatant ölçülmesi için prosedürler açıklanmaktadır. Deney hassasiyeti serotipleri ve tahliller arasında değişir, ancak ilgili Matrix deneyleri 56,60 diğer BoNT serotipleri (örneğin, BoNT / B, E, ve F) test sırasında protokol, ancak, aynıdır. Bu protokol olası numune her türü için hesap değil ve bazı modifikasyonlar belirli örnek kompozisyon ve arzu edilen uygulamaya bağlı olarak gerekli olabilir...

Botulinum nörotoksinler (BoNTs) 1-3 ng tahmin damar insan öldürücü dozları ile bilinen en ölümcül maddelerdir / 1,2 kg arasındadır. BoNT yedi serotip yapısal olarak benzer, her bir hücre, bir çinko endopeptidaz 3-5 kodlayan sitosol ve bir hafif zincir içine alımı ve translokasyon bağlanması için sorumlu bir ağır zincir alanı kapsayan, biri, G olarak etiketlenmiş. BoNT&#39;nin nefis toksisite kısmen, sonuçları, nöromüsküler kavşağı 6 motor nöronların içine kendi özgül bağlanma ve giriş. Bir kez nöron içinde, hafif zincir endopeptidaz spesifik olarak ayrıştıran, çözünür N-etilmaleimit duyarlı faktör bağlanma protein reseptörü (SNARE) vesikül füzyonu için gerekli proteinler, bir veya daha fazla, nörotransmitter salımını inhibe ve gevşek felce 7-14 yol açar. Yaygın hastalığı &quot;botulizm&quot; BoNT&#39;nin tarafından diyafram ve interkostal kasların felci olarak bilinen sonuçta sonuçlarıErken tanı ve tedavi sürece solunum yetmezliği ve ölüm alınır. İnsan gıda kaynaklı botulizm en yaygın BoNT&#39;den serotip A, B, E ile ilişkili ve genellikle F (BoNT / A, BoNT / B, vb) ve kontamine gıda 15,16 yenmesi sonucu oluşur, ancak yara botulizm birçok davada intravenöz uyuşturucu kullananlar 17,18 arasında rapor edilmiştir. Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde, bir yaşın altındaki çocuklar tarafından Clostridium sporlarının alımından kaynaklanan bebek botulizm botulizm 19-21 en sık görülen şeklidir. Ancak, yanlış ev konserve ve gıda işleme kaynaklanan gıda kaynaklı salgınların BoNT&#39;den yurtdışında Amerika Birleşik Devletleri ve hem de bildirildi. 2000-2009 yılları arasında, gıda kaynaklı botulizm en az 338 olgu altı ölümlerin 22 olmak üzere dünya çapında bildirildi. Hızlı ve hassas gıda kaynaklı botulizm salgınları tespit yeteneği erken tanısına yardımcı olabilecek bir kritik göstergesidir 23,24. Ayrıca, maliyet-etkin ve rutin gıda test izin algılama yöntemleri geliştirilmiş gıda güvenliği sağlayacaktır. BoNT nöronal özgüllük ve uzun biyolojik yarı ömrü, aynı zamanda güçlü bir tedavi sağlar. Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde, BoNT bazlı ilaçlar kozmetik koşulları ve kaş hatları, servikal distoni, migren baş ağrısı, aşırı aktif mesane, ve şaşılık içeren nöromüsküler ile ilgili hastalıkların tedavisi için Gıda ve İlaç İdaresi tarafından onaylanmıştır. Çok sayıda &quot;off-label&quot; uygulamalar şiddetli kas disfonksiyonu 25-28 için yüksek doz tedaviler de dahil olmak üzere, belgelenmiştir. Doz aşımı potansiyel zararlı yan etkileri hastaları risk altına sokar iken düşük dozun etkisiz tedaviye neden olabilir Doğru toksin ölçümü, doğru doz için önemlidir. Ne yazık ki, hiçbir standart gücü tahlil protokolü BoNT-bazlı ilaç süreden arasında birim tanımı eşitsizlikler sonucunda, üreticiler arasında paylaşılırcts 29-31. BoNT için standart deney BoNT içeren örnekler farelere intraperitoneal olarak enjekte edilmiş ve ölüm sayıları 1-7 gün boyunca 16,32,33 kaydedildiği fare deneyidir. Fare biyodeney 5-10 pg BoNT / A 34 algılama sınırları (LOD) ile çok hassas olmakla birlikte, hayvan kullanımı üzerinde etik kaygılar, yüksek eğitim personelinin maliyeti ve hayvan tesisleri, uzun tahlil kez, ve eksikliği sürdürülmesi standartlaştırılmış protokoller standartlaştırılmış, hayvan ücretsiz BoNT&#39;den test ve ölçüm yöntemlerinin 35-39 geliştirmek aramalar sonuçlandı. Son zamanlarda, çeşitli alternatif BoNT&#39;den ölçümü yöntemleri fareyi veya yakınındaki-fare biyodeney hassasiyetini 40-49 sunuyoruz geliştirilmiştir. Bu yöntemler yaygın olarak floresan, kütle-spektrometresi, veya immünolojik yöntemleri kullanmak ve hayvan kullanmadan fare biyolojik deneyi daha kısa deney süresine sahiptir. Kütle spektrometrisi immünolojik techniq kombine yaklaşımlarUes algılamak ve BoNT&#39;den gıda ve diğer karmaşık numunelerde bulunan ölçmek gösterilmiştir, ancak, personel eğitim gereksinimleri ve özel ekipman limiti bu deneyler 50-55. Diğer birçok alternatif deneyler, kompleks numune test kolayca uygulanabilir değildir ya da rutin BoNT test için gerekli olan hacmi yoksundur. BoNT aşırı gücü maç için duyarlılık ile in vitro deney yöntemleri geliştirmek çalışırken gıda örneği viskozite, pH, tuz içeriği ve matris bileşenlerinin son derece değişken doğası özellikle zor bir zorluktur. Ayrıca, bu tür BoNT bazlı ilaç ürünleri yeniden süspansiyon haline getirilmesinden kaynaklanan gibi daha basit ve nispeten iyi huylu tampon sistemleri, önemli in vitro BoNT gücü 56 etki tuzu, albumin ve şeker stabilizatörler (örneğin, katkı maddeleri) içerebilir. Toksin arıtma örnekler 56-59 en basit ama doğru aktivitesi test etmek için gereklidir. BoTest Matrix deneyleri hızlı, yüksek verimlilik için tasarlanmış ve yaygın araştırma laboratuvarlarında 56,60 bulunan ekipman kullanılarak karmaşık örneklerinden BoNT&#39;nin tutarlı ölçümü yapılmıştır. Bu deneyler kovalent olarak bağlamak ve bir numune dışarı BoNT&#39;yi ayırmak ve daha sonra yıkanarak matris müdahale bileşikleri çıkarmak için serotip spesifik anti-BoNT antikorları ile bağlantılı para-manyetik boncuk kullanır. Yıkamanın ardından, bağlı BoNT proteolitik aktivitesi daha sonra BoNT serotip test edilen ile uyumlu bir raportör kullanılarak optimize edilmiş bir reaksiyon tampon maddesi içinde ölçülür. Bu muhabir bir N-terminal siyan flüoresan protein (CFP) yarımı oluşturan bir alt-tabaka BoNT, SNAP25 kalıntıları 141-206 veya sinaptobrevin kalıntıları 33-94 ile bağlantılı bir C-terminal sarı floresan protein türevi (Venus) yarımı kapsayan florojenik proteinlerdir BoTest A / E veya B / D / F / G gazetecilere, sırasıyla 45. BoNT ile Reporter yarılma Förster rezonans enerji transferi (FRET) kullanılarak izlenir. Ne zaman tO muhabir CFP uyarma OBP emisyonu ve heyecan verici Venüs emisyonu söndürme, Venüs FRET sonuçları, bozulmamış. BoNT ile muhabir yarılması CFP yayma ve Venus emisyonunda azalma bir artışa yol açan, FRET önler. BoNT aktivitesi daha sonra kantitatif olarak CFP ve Venüs emisyon oranı kullanılarak ölçülebilir. 3 pg altında LOD yüksek verimli bir 96-yuvalı plaka formatı kullanılarak 56 yiyecekler çok geniş bir yelpazede mümkündür. Tahlil, kürecik yüzeyinde toksin konsantrasyonu sağlar çünkü artan duyarlılık daha büyük örnek hacimleri kullanılarak elde edilebilir. BoNTs A, B, E ve F için BoTest Matrix deneyleri geliştirilmiş ve gıda, ilaç ve çevresel numuneler 56,60 ile test edilmiştir. Burada, (örneğin ilaç, BoNT tamponu içinde) ve yüksek karmaşıklık (örneğin gıda, çevre) örnekleri düşük karmaşıklık BoNT saptanması için bu deneyleri yürütmek için işlemleri tarif eder. Belirli işleme yöntemleriBirkaç örnek türleri bu protokolde ele ve burada tarif değil örnek türleri genellikle sunulan yöntemleri bir arada kullanılarak adapte edilebilir için. Protokol geliştirilmiş ve test BoNT / A ile değil, başka bir yerde 56,60 gösterildiği gibi, ilgili deneyler kullanılarak diğer BoNT serotiplerine uyarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>BoTest Matrix A Botulinum Nörotoksin Tespit Kiti</td><td>BioSentinel</td><td>A1015</td><td>BoNT/B ve F için Tespit kitleri de mevcuttur.</td></tr><tr><td>Varioskan Flash floresan mikroplaka okuyucu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5250040</td><td>434 nm uyarma ve 470 nm ve 526 nm emisyon kapasitesine sahip çoğu monokromatör veya filtre tabanlı ünite kullanılabilir.</td></tr><tr><td>96 kuyulu Manyetik Boncuk Ayırma Plakası</td><td>V& P Scientific</td><td>VP771H</td><td>Diğer manyetik plakalar da kullanılabilir, ancak plaka, boncukları kuyunun kenarına ayıracak şekilde tasarlanmalıdır.</td></tr><tr><td>Manyetik Boncuk Uyumlu Plaka Yıkayıcı</td><td>BioTek</td><td>ELx405 VSRM</td><td>İsteğe bağlı, sadece otomatik plaka yıkama için gereklidir. Diğer manyetik boncuk uyumlu plaka rondelaları da kullanılabilir, ancak kullanımdan önce test edilmelidir.</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td></td><td></td><td>İsteğe bağlı, yalnızca santrifüjleme gerektiren numuneler için gereklidir.</td></tr><tr><td>MixMate plaka karıştırıcı</td><td>Eppendorf</td><td>22674200</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Çalkalayıcı</td><td></td><td></td><td>Oda sıcaklığında veya 25 ° C'de kullanılır; C Sıcaklık kontrolü mevcutsa,</td></tr><tr><td>EDTA içermeyen Proteaz İnhibitör Tabletleri</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>Yalnızca gıda veya çevre testleri için gereklidir. Proteaz inhibitörleri EDTA içermemelidir.</td></tr><tr><td>BoNT/A</td><td>Metabiyolojikler</td><td></td><td>İsteğe bağlı, yalnızca standardizasyon ve miktar tayini için gereklidir</td></tr><tr><td>Siyah, Düz Tabanlı 96 Kuyulu Plakalar</td><td>NUNC</td><td>237105</td><td>Plakaları işlem görmemelidir</td></tr><tr><td>96 Kuyulu Plaka Sızdırmazlık Bandı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr></tbody></table>

botest matrix tahliller kullanma kompleksi matris itibaren İzolasyon ve botulinum nörotoksin kantitasyonu

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Doğru tespiti ve karmaşık matrisler botulinum nörotoksininden (BoNT) ölçümü ilaç, çevresel ve gıda örnek test için gereklidir. Doğru gücü test BoNT-bazlı ilaç ürün üretim ve hasta güvenliği için gerekli ise, gıda maddelerinin hızlı BoNT&#39;den testi salgını adli tıp, hasta tanı ve gıda güvenliği test sırasında gereklidir. BoNT testi için yaygın olarak kullanılan fare biyodeney son derece hassas ama hızlı ve rutin BoNT&#39;den test için gerekli hassasiyet ve üretim yoksun. Ayrıca, hayvanların bioassay kullanımı BoNT&#39;den test için fare biyodeney yerine ABD ve yurtdışında uyuşturucu ürün düzenleyici otoriteler ve hayvan hakları savunucuları tarafından aramalar sonuçlandı. Birçok in vitro tahliller yerine basit tamponlar içinde saflaştırılmış BoNT ile iyi çalışır geliştirilmiştir, ama en çok karmaşık matrisler test edilmesi için geçerli olduğu gösterilmiştir edilmemiştir. Burada, tespit edilmesi için bir protokolBoTest Matrix tahliller kullanılarak kompleks matrislerde BoNT sunulmuştur. Deney üç bölümden oluşur: ilk bölümü test için numune hazırlanmasını gerektirir, ikinci bölümü matris BoNT&#39;yi arındırmak için bir anti-BoNT antikor kaplı paramanyetik boncuklar kullanarak bir immunopresipitasyon adımdır, ve üçüncü bölümü izole BoNT en proteolitik rakamlarla Bir florogenik raportör kullanılarak faaliyet. Protokol, sıvı ve katı hem matrisler kullanılarak 96 oyuklu plakalarda yüksek verimli testler için yazılı ve 4-26 saat arasında, toplam deney katı numune türü, toksin yükü ve arzu edilen duyarlılığına bağlı olarak manuel preparatın yaklaşık 2 saat gerektirir. Veriler, fosfat tamponlu tuzlu su, bir ilaç ürünü, kültür yüzer,% 2 süt, taze domates ile BoNT / A test için sunulan ve deney başarısı için kritik bir parametre içeren bir tartışma vardır.

Açıklanan protokol adımları özetleyen bir diyagramı Şekil 2 de gösterilmiştir. Analiz numunesi tipine ve istenen tahlil duyarlılığına bağlı olarak tamamlamak için 4-26 saat arasında gerektirir, fakat sadece ~ 2 saat süre eller üzerinde. Deney, 96 oyuklu plakalarda ve test yapılmaktadır tipine bağlı olduğu, plaka başına standartlar dahil olmak üzere 20 kadar numune, üçlü test sağlar. Şekil 3, BoNT kullanılarak temsili deney sonuçları göstermektedir / A holoto...

BoTest Matrix botulinum nörotoksin (BoNT) algılama deneyleri hızla arındırmak ve numune matrisleri bir dizi BoNT&#39;yi ölçmek. Burada, katı ve sıvı matrislerden BoNT tayini ve ölçümü için bir protokol mevcut ve BOTOX, domates ve süt ile deneyi göstermektedir.

BoTest Matrix Tahliller kullanma Kompleksi Matris itibaren İzolasyon ve Botulinum nörotoksin Kantitasyonu

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

Bu prosedürün genel amacı, farmasötik, çevresel ve gıda örnekleri gibi kompleks matrislerdeki botulinum nörotoksinin proteolitik aktivitesini nicelendirmektir. Bu işlem, öncelikle uygun pH ve viskozite koşullarını sağlamak için gerekirse test ve standart eğri örneklerinin işlenmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, botulinum nörotoksin, antikor kaplı manyetik boncuklar kullanılarak örneklerden immünopresipite edilir.Ardından, girişim yapan bileşiklerin uzaklaştırılması için manyetik boncuklar iyice yıkanır ve optimize edilmiş bir reaksiyon tamponu içinde yeniden süspanse edilir. Son olarak, yıkanan boncuklar bir protein raporlayıcı ile inkübe edilir ve raporlayıcının zamanla gerçekleşen kesimi spektroskopik olarak ölçülür. Nihayetinde, test örneklerindeki raporlayıcı kesiminin standart eğri örnekleriyle karşılaştırılması, test örneklerindeki botulinum toksinin aktivitesinin, fareye yakın biyolojik deney hassasiyetinde nicelendirilmesi için kullanılır.Bu tekniğin fare, biyolojik analiz, immünolojik ve diğer floresan yöntemler gibi diğer yöntemlere göre temel avantajları, bu analizinin hayvan kullanımını gerektirmemesi ve gıda, çevre ve farmasötik numunelerde bulunan yüksek derecede kar

isolation-quantification-botulinum-neurotoxin-from-complex-matrices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, bir numunedeki birden fazla sitokin hedefini ölçmek için multipleks boncuk tabanlı bir immünolojik testi gösterir. Numunede bulunan sitokinleri bağlamak için sitokin spesifik antikorlara konjuge edilmiş farklı mikrokürelerin bir karışımı kullanılır. Streptavidin etiketli raportörler, biyotinile edilmiş tespit antikorları kullanılarak bağlı sitokinler üzerinde immobilize edilir. Akış sitometrisi, mikrokürelerin benzersiz boyutlarına ve iç floresan yoğunluklarına dayalı olarak bağlı...

Çoklu Sitokin Hedeflerini Ölçmek için Multipleks Boncuk Bazlı İmmünoassay

Botulinum nörotoksin tip A hafif zinciri (BoNT/A LC), motor nöronlara giren, substratı SNAP-25'i parçalayan ve nörotransmisyonu bozan, böylece sarkık felç ile sonuçlanan bir metalloprotazdır. Yüksek verimli uyumlu FRET tabanlı bir tahlil kullanılarak, küçük moleküllerden oluşan büyük kütüphaneler, BoNT/A LC enzimatik aktivitesi üzerindeki etkileri açısından taranabilir.

Botulinum nörotoksin Işık Zinciri Modülatörlerin Belirlenmesi ve Karakterizasyonu için bir Yüksek verim uyumlu FRET tabanlı Platformu

Botulinum nörotoksini, Kategori-A biyolojik tehdit ajanları arasında en güçlü toksinlerden biridir, ancak maruziyet sonrası bir terapötik mevcut değildir. Yüksek içerikli görüntüleme yaklaşımı, bu toksinin birincil hedefi olan biyolojik olarak ilgili motor nöronları kullanarak çok parametreli taramayı mümkün kıldığı için yeni inhibitörleri tanımlamak için güçlü bir metodolojidir.

Botulinum nörotoksininin önleyicilerinin tanımlanmasına daha yüksek bir miktarda Görüntüleme Deneyi

Fare ES hücrelerini, işleyen sinapslar ve ortaya çıkan ağ davranışı sergileyen yüksek saflıkta nöronların tanımlanmış popülasyonlarına ayırmak için özel bir protokol tanımlanmıştır. Elektrofizyolojik analiz, botulinum nörotoksin serotipleri /A-/G ve tetanoz nörotoksinine maruz kaldıktan sonra sinaptik iletim kaybını göstermektedir.

Kök ve Ağ Kültürlerde Biyolojik nörotoksinlerin Fonksiyonel Değerlendirme Merkezi Sinir Sistemi Nöronlar Hücre-türetilmiş

Bu protokol, yakın zamanda yayınlanan Komisyon Yönetmeliği (AB) 2023/915'e uygun olarak gıdalarda ergot alkaloidlerinin varlığını belirlemek için doğrulanmış bir sıvı kromatografisi-iyon hareketliliği-yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi yöntemi sunar.

Sıvı Kromatografisi Tuzaklı İyon Hareketlilik Spektrometresi-Uçuş Süresi Kütle Spektrometresi ile Gıda Matrislerinde Düzenlenmiş Ergot Alkaloidlerinin Tespiti

Ortabeyin dopamin sistemi ve striatum gelen Eksplantlarından için bir kollajen matris deneyde...

Fare Dopaminerjik ve Üç Boyutlu Collagen Matrix Tahliller striatal Eksplantlarından diseksiyonu ve Kültür

Nöral devreler topografik spesifik moleküler profilleri ile fonksiyonel bölme halinde düzenlenmiştir. Burada, çok yönlü bir wholemount immünohistokimyasal yaklaşımını kullanarak global beyin topoğrafya ortaya çıkarılması için pratik ve teknik adımları sağlar. Bu iyi anlaşılmış cytoarchitecture ve beyincik devre kullanarak yöntemin yardımcı göstermektedir.

Revealing Kompleksi Beyin Topografya Wholemount İmmünohistokimya

Bu video 10-12 gün içinde embriyonik ön beyin endotel hücreleri saf kültürlerin hazırlanması için kolay ve güvenilir bir strateji gösterir ve serebral damar birçok açıdan odaklanmış araştırma için yararlı olacaktır.

Embriyonik ön beyin gelen Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü

Bu makale, biyokimyasal ve immünositokimyasal analizler için büyük miktarlarda saf aksonal numune elde etmek için kullanılabilecek bir nöronal kültür sistemini açıklamaktadır. Bu teknik, normal aksonal fizyolojinin ve nörodejenerasyona yol açan sinyal yollarının daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.

Biyokimyasal Analiz için Duyu Nöronlar gelen üretim ve Aksonlar izolasyonu gözenekli Filtre Kullanma

Nöronal kültürler tek nöronlar üzerindeki etkisi veya nöronların nüfusu yoluyla ortaya çıkan beyin stimülasyonu teknikleri incelemek için iyi bir modeldir. Banyo elektrotlar doğrudan üretilen ya da zaman içinde değişen bir manyetik alan tarafından indüklenen bir elektrik alanı ile desenli nöronal kültürler uyarılması için farklı yöntemler burada sunulmuştur.

Bir ve İki Boyutlu Kültürlerde Elektrik ve Manyetik Alanlar Kullanan Nöronların Harici Uyarımı

Keşfedin botulinum nörotoksinin karmaşık matrislerden izolasyonu ve kantitasyonu için immunopresipitasyon yöntemini. Bu hassas analiz gıda güvenliği ve çevre izleme alanlarında hızlı, güvenilir sonuçlar sağlar.

BoTest Matrix Tahliller kullanma Kompleksi Matris itibaren İzolasyon ve Botulinum nörotoksin Kantitasyonu

Daha fazla video keşfet