Botulinum nörotoksin Işık Zinciri Modülatörlerin Belirlenmesi ve Karakterizasyonu için bir Yüksek verim uyumlu FRET tabanlı Platformu

Bu prosedürün genel amacı, hafif bir zincir inhibisyonu olan botulinum nörotoksini için küçük molekülleri taramaktır. Bu, önce yüksek doğruluk ve hassasiyetle bileşik seyreltme serilerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, bileşik seyreltmeleri siyah 96 oyuklu bir plakaya aktarmaktır.

Daha sonra seyreltilmiş hafif zincir enzimi plakaya eklenir ve enzim, oda sıcaklığında beş dakika boyunca bileşikle inkübe edilir. Son adım, bir floresan plaka okuyucu ile izlenen reaksiyonu başlatmak için hafif zincir perde substratının eklenmesidir. Sonuç olarak, bileşik aktiviteyi doğrulamak ve inhibitör ayrışma sabiti veya ki gibi daha titiz kinetik sabitleri belirlemek için floresan olmayan bir peptit substratı kullanan ikincil ekranlar kullanılmalıdır.

Bu testin HPLC bazlı veya hücre bazlı yöntemler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, gerçekleştirilmesinin basit olması, kolayca otomatikleştirilmesi ve bir dizi bileşiğin nispi gücünü karşılaştırmak için kullanılabilmesidir. Bireyler, bir bileşik seyreltme serisi hazırlarken ve tüm bileşenler eklendikten sonra plakayı uygun şekilde karıştırırken bu yönteme yeni olduklarında mücadele edebilirler. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi arabellekleri ve reaktifleri hazırlayarak başlayın.

Plaka okuyucuyu, plakayı 10 saniye boyunca orta hızda sallayacak ve ardından floresansı, oda sıcaklığında bir saat 30 dakika boyunca kinetik modda her beş dakikada bir 490 nanometre uyarma dalga boyunda ve 523 nanometre emisyon dalga boyunda izleyecek şekilde yapılandırın. Bileşik konsantrasyon aralığını belirledikten sonra, uygun bileşik adı ve konsantrasyonu ile tüpleri etiketleyin, Eloqua,% 100 dimetil sülf oksit veya DMSO, bileşik tahıl seyreltmesine hazırlamak için tüm tüplere. Daha sonra, standart bir ila üç seyreltme serisi için bileşiklerin seri seyreltmesini hazırlayın.

Seyreltme serisinin ilk tüpündeki dört mikrolitre DMSO'ya seyreltilmemiş bileşiğin iki mikrolitresini ekleyin ve yeni bir pipet ucu ile iyice karıştırın. İlk seyreltmenin iki mikrolitresini çıkarın ve ikinci tüp karışımında dört mikrolitre DMSO'ya ekleyin. Kalan seyreltmeler için tekrarlayın.

Bileşik konsantrasyonlarının doğru olduğundan emin olmak için bileşik seyreltmelerini iyice karıştırdığınızdan emin olun. Bileşik tüpleri örtün ve bir kenara koyun Oda sıcaklığında, düz tabanlı, opak siyah 96 oyuklu bir plaka elde edin. Metin protokolünde bulunabilecek önerilen plaka kurulumunu kullanarak.

Bir ila dokuz arasındaki kuyular için ilgili bileşik seyreltmesinin bir mikrolitresini doğrudan karşılık gelen her bir kuyunun dibine manuel olarak dağıtın, test edilecek en yüksek bileşik konsantrasyonundan bir mikrolitre kuyuya dağıtın.11. Bileşik içsel floresan kontrolü olarak hizmet etmek. Bu kontrol, bileşiklerin kendilerinin floresan olup olmadığını ve/veya substrat hidrolizini etkileyip etkilemediğini belirlemek içindir.

Bilinen güçlü bir inhibitörün bir mikrolitresini kuyuya, 12'sini pozitif kontrol olarak ve bir mikrolitre% 100 DMSO'yu kuyuya manuel olarak dağıtın. Otomatik pipetleyici dağıtımı ile negatif kontrol olarak 10. Kuyuların yan tarafına 79 mikrolitre tahlil tamponu, 10 ve 12 ve 89 mikrolitre kuyu yanına, 11.

Kuyuların çapraz kontaminasyonunu önlemek için, bileşiğin bulunduğu kuyunun dibine uca dokunmadığınızdan emin olun. Seyreltilmiş hafif zincir enzimi olan vorteks ve 11 kuyusu hariç her bir kuyucuğun yanına 10 mikrolitre enzim eklemek için otomatik bir pipetleyici kullanın. Eklenen enzimin toplam hacminin kuyunun dibine gitmesini sağlamak için plakayı hafifçe karıştırın, örtün ve plakayı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Bu inkübasyon, bileşiklerin hafif zincire bağlanması için bir pree denge adımı sağlar. Substrat eklemeden önce, hafif zincirli bir substrat olan botulinum nörotoksini nazikçe girdaplayın. Daha sonra otomatik bir pipet kullanarak, her birinin yanına 10 mikrolitre alt tabaka ekleyin.

Alt tabakayı, enzimin daha önce eklendiği yerin karşısındaki kuyu tarafına eklediğinizden emin olun. Reaktifleri hemen karıştırmak için plakaya hafifçe vurun. Plakayı bir floresan mikrotitre plaka okuyucusuna yerleştirin ve önceden yapılandırılmış programa başlayın.

Program bittikten sonra, bağıl floresan birimini zamana karşı grafiklendirerek ve reaksiyonun doğrusal periyodu boyunca çizginin eğimini hesaplayarak enzim hızlarını hesaplayın. Metin protokolünde açıklandığı gibi yüksek verimli tarama için otomatik çalışmaya hazırlanın, Yüksek verimli tarama protokolünün bir kısmını göstermek, laboratuvarımda genç bir doktora sonrası olacaktır. Laboratuvar otomasyon ekipmanı kullanılarak yüksek verimli tarama için bileşiklerin plakalara nasıl aktarıldığını gösterecek Seyreltilmiş botulinum nörotoksini test plakasına hafif zincirli bir enzim dağıtıldıktan sonra.

Bileşik plakalar, tahlil plakaları ve temizleme solüsyonları içeren kaplar için sıvı işleyici platformunda alanlar atayın. Sıvı işleyiciyi, bileşik plakaları ve tahlil plakalarını belirlenen konumlara yerleştirecek şekilde programlayın ve damgalamadan önce plaka kapaklarını çıkarın. Damgalama programı yazılımını kalibre edin ve damgalama pimlerinin suya daldırıldığından, ancak tahlil plakasının altını çizmediğinden emin olun.

Bileşiğin 50 nanolitresini doğrudan sekiz mikrolitre botulinum nörotoksini içeren tahlil plakasına damgalayın. Hafif bir zincir. Her plakadan sonra pimleri DMSO'ya batırarak ve ardından kurutma kağıdı üzerinde kurutarak ve bu işlemi izopropanol ve metanol ile tekrarlayarak temizleyin.

Son olarak, bileşikler tahlil plakalarına enzim ile damgalandıktan sonra pimleri fanın üzerinde kurutun. Ayrı olarak, stok bileşik plakalarını istifleyin ve tahlil plakaları, buharlaşmayı önlemek için yığındaki üst tahlil plakasını kaplar ve bir kenara koyun. Hafif zinciri bileşiklerle oda sıcaklığında en az beş dakika inkübe ettiğinizden emin olun.

Çok sayıda plaka damgalanırken daha uzun inkübasyon süreleri kullanılabilir. Son olarak, substratı tahlil plakalarına dağıtın ve metin protokolünde açıklandığı gibi floresansı ölçün. FRET bazlı botulinum nörotoksini, bir hafif zincir testinin düşük verimli veya yüksek verimli bir şekilde gerçekleştirilip gerçekleştirilmediği, bir hafif zincir olan botulinum nörotoksini, substrat ile inkübe edildiğinde zamanla floresanda bir artış gözlenmelidir.

Bir bileşiğin seri seyreltmeleri test edilirse, genellikle değişen eğimlere sahip bir dizi çizgi elde edilir. Burada. Hidroksi at bazlı bir bileşiğin nihai konsantrasyonu, mikromolar birimlerde listelenmiştir. Peki, burada açıklanan plaka düzeninde 10, yalnızca aracın eklendiği negatif bir kontrol görevi görür.

Bu reaksiyonun hızı %100 Enzim aktivitesi olarak tanımlanır ve bileşik varlığındaki oranlar, nispi oran veya yüzde inhibisyon elde etmek için bu orana normalleştirilebilir. Tahlil, bir bileşiğin seri seyreltmeleri ile gerçekleştirildiğinde, yarı maksimal inhibitör konsantrasyonu veya IC 50'yi belirlemek için inhibitör konsantrasyonuna karşı reaksiyon hızının bir grafiği kullanılabilir. Seyreltme aralığı, optimum eğri uydurma için grafiğin sigmoid şeklinde görüneceği şekilde seçilmelidir.

IC 50 değeri, tahlilde bulunan enzim konsantrasyonuna bağlı olduğu için en iyi görünen bir KI değeri olarak tanımlanan göreceli bir potens ölçüsüdür. Bu değer daha sonra test edilirse birkaç bileşiğin gücünü karşılaştırmak ve sıralamak için kullanılabilir. Paralel olarak, her bir bileşeni ekledikten sonra plakanın uygun şekilde karıştırılması, zaman içinde floresanda düzgün bir doğrusal artış elde etmek için çok önemlidir, bu da başlangıç hızlarını doğru bir şekilde belirlemek için gereklidir.

Bu grafik, yetersiz karıştırmanın olduğu ve ürün oluşum hızının zaman içinde doğrusal olmadığı temsili bir deneyi göstermektedir. Kafa karıştırıcı veri analizi: Bu tekniğe hakim olduktan sonra, sekiz bileşiğe kadar iki saatten daha kısa sürede yapılabilir. Bu deneyden sonra, bileşiklerin botulinum nörotoksini, hafif zincir ve somatik aktiviteyi inhibe ettiğini doğrulamak için floresan olmayan peptit substratları ile başka testler yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, botulinum nörotoksin hafif zincir inhibitörlerinin nispi gücünü nasıl belirleyeceğinizi iyi anlamalısınız. Protokol üç adımda gerçekleştirildi. İlk olarak, bir bileşik seyreltme serisinin hazırlanması.

İkincisi, rekombinant hafif zincir enziminin eklenmesi ve üçüncüsü, bir floresan substratın eklenmesi ve ardından bir floresan plaka okuyucu üzerinde ölçüm.