Elektron Cryo-tomografi ile Mitokondri ATP Sintazı dimerlerini Görselleştirme

Bu prosedürün genel amacı, C iki'deki mitokondriyal proteinlerin yapısını ve organizasyonunu belirlemektir. Bu, önce numuneyi içeren donmuş bir hidratlı elektron mikroskobu ızgarası oluşturularak gerçekleştirilir. Daha sonra, numunenin bir doz sınırlı eğim serisi, bir elektron kriyo mikroskobunda kaydedilir.

Daha sonra eğim serisi, bir tomografik hacim oluşturmak için işlenir. Son olarak, proteinlerin yapısını belirlemek için protein yoğunluklarının ortalaması alınır ve zarlar, 3 boyutlu yapılarını ortaya çıkarmak için bölümlere ayrılır. Proteinlerin ortalamalarını Tom Grahams'a geri konumlandırarak, zardaki proteinlerin yapısı ve organizasyonu ortaya çıkar.

Bu yüzden mitokondrinin elektron ağlama tomografisini yapıyoruz çünkü moleküler düzeyde nasıl çalıştıklarını anlamak istiyoruz. Bu tekniğin, ince plastik kesitlerin elektron mikroskobu gibi diğer yöntemlere göre en büyük avantajı, çözünürlüğün daha yüksek olmasıdır. Materyal hiçbir şekilde kimyasal olarak sabitlenmemiştir ve proteinlerin moleküler detayları korunur.

Elektron kritografisi tekniğinde ustalaşmak biraz zaman alabilir, ancak deneyimli kullanıcılar seans başına beş ila altı kaliteli TOM zemini elde edebilir. Prosedürün en zor kısmı, optimum buz kalınlığına sahip donmuş hidratlı ızgaralar üretmektir Mitokondriyi izole ettikten ve peletledikten sonra, metin protokolüne göre, peleti toplam protein kızdırma deşarjının mililitresi başına yaklaşık beş miligramlık bir konsantrasyona yeniden askıya almak için 10 milimolar HEPA tamponunda 250 milimolar T triozu kullanın. Tamamen karbon EM ızgaraları, üreticinin talimatlarına göre bir vakum cihazında karbon tarafı yukarı bakacak şekilde, sıvı nitrojen soğutmalı bir alüminyum kabın iç tarafına bir etan gazı akışı yönlendirerek birkaç mililitre etan

Bir kızdırma deşarjı DM ızgarasını almak için bir cımbız kullanın ve mitokondriyal süspansiyon ile bire bir olan konjuge altın referans süspansiyonu olan proteini tezgah karışımına yerleştirin ve hemen ızgaraya üç mikrolitre çözelti uygulayın. Ardından, cımbızları ev yapımı giyotin gibi bir vitrifikasyon cihazına yerleştirin, bir kama filtre kağıdı ile ızgaradaki fazla sıvıyı kurulayın ve ızgarayı hemen sıvı etana daldırmak için tetiği bırakın. Daha sonra ızgarayı sıvı etandan sıvı nitrojene aktarmak için.

Taze bir filtre kağıdı kamasının ucunu sıvı etanın içine yerleştirerek fazla etanı ızgaradan çıkarın. Sıvı yükseldikçe, ızgarayı sıvı ön kısmının altında tutarak filtre kağıdından yavaşça yukarı sürükleyin ve ardından daha sonra kullanmak üzere saklamak üzere hemen sıvı nitrojene aktarın. Izgarayı bir ızgara kutusuna yerleştirin ve bir tomografik eğim serisi kaydetmek için sıvı nitrojen dolgulu bir doer içinde saklayın.

Sıvı nitrojen yapıcıların dolu olduğundan emin olarak başlayın ve numune aşamasının ve ızgara transfer cihazının sıcaklığının 100 kelvin'in altında olduğunu kontrol edin. Bir test ızgarasının görüntüsünü alarak ve diken halkalarının kalitesini kontrol ederek elektron mikroskobunun iyi hizalandığını onaylayın, bu halkalar yuvarlak olmalı ve görüntünün kenarına kadar uzanmalıdır. Ardından, donmuş hidratlı mitokondri içeren bir ızgara yerleştirin.

Ardından arama modunda, uygun buz kalınlığı ve numune kalitesine sahip alanları arayın. Veri toplamaya uygunluğu belirlemek için gelecek vaat eden alanların altı saniyelik bir arama görüntüsünü alın. İyi bir numune alanı bulduktan sonra, benzer görünüme sahip yakındaki buzla doldurulmuş bir delik üzerindeki ızgara çubukları veya buz kristalleri tarafından pozlama veya odak alanını engellemeden kullanılabilen maksimum eğim aralığını belirlemek için sahneyi artı veya eksi 60 derece eğin, pozlama moduna geçin ve ışın yoğunluğunu veya görüntü elde etme süresini ayarlayın.

Bu nedenle, kaydedilen her görüntü, CCD'ler için piksel başına 30 ila 50 elektron veya saniyede piksel başına altı ila sekiz elektron dozuna sahiptir. Doğrudan elektron dedektörleri için, sıfır derecede elde edilen bir saniyelik bir görüntü için ortalama elektron Sayısını boş bir delik üzerinde 60 derecelik bir görüntüye bölerek doz dağılım oranını veya I sıfır üzeri I 60'ı hesaplayın. Pozlama modunda bir saniyelik bir görüntü elde edin ve angstrom kare başına elektron sayısını not edin.

Doz dağılım oranını dikkate alarak, uygun otomatik veri toplama yazılımını kullanarak belirli bir toplam elektron dozu için kaydedilebilecek toplam görüntü sayısını ve eğim aralığını hesaplayın. Az önce belirlenen tipik tomolarla bir Tom Agram kurun ve kaydedin. Bu numuneler için artı veya eksi 20 dereceden başlayın ve yüksek eğimlere ulaşmadan önce sıfır dereceden geçin.

Tomos oluşturmak ve segmentlere ayırmak için, eğim serisini yeniden yapılandırma yazılımına uygun bir dosya formatına dönüştürün. Im mod gibi bir Tom Graham yeniden yapılandırma programı kullanarak, altın referans işaretleyicilerinin konumunu işaretleyerek görüntüleri hizalayın. Hizalandıktan sonra bir Tommo Graham oluşturun.

Görselleştirme için IM o ile dağıtılan doğrusal olmayan bir izotropik difüzyon filtresi gibi bir görüntü filtresi kullanarak tommo Graham'ın kontrastını geliştirin. Tom'u manuel olarak bölümlere ayırmak için piyasada bulunan programları kullanın. İç ve dış zara karşılık gelen vokselleri ayrı katmanlara atayın, atandıktan sonra, zarları görselleştirmek için bir yüzey oluşturun.

Emira için EM paket eklentisindeki tıklama seçeneğini kullanarak, işaretli parçacıkları girdi olarak ve parçacık tahmini gibi uygun bir yazılım paketini kullanarak bir TP sintaz parçacıklarının konumunu işaretleyin. Elektron tomografi programı için, bir çözünürlük tahmini için bir agram ortalaması hesaplayın. Ücretsiz görselleştirme programını kullanarak bağımsız olarak belirlenen iki alt tommo ortalaması arasındaki fuaye kabuğu korelasyonunu hesaplayın.

Chimera, bilinen x-ışını yapılarını önce manuel olarak alt Tom Agram ortalamasına sığdırır, daha sonra bu şekilde görüldüğü gibi komut uyumu ile otomatik olarak, bir mitokondriyal elektron ağlamasında zarların manuel olarak segmentasyonu, bir mitokondrideki Christi'nin yapısını ortaya çıkarır. Belirli proteinlerden yoksun maya nakavt suşlarından mitokondriyi görüntüleyerek. Bu proteinlerin Christi morfolojisi üzerindeki etkisi değerlendirilebilir.

Burada, bir TP sentez dimerlerinin oluşumu için gerekli olan bir TP sentez alt birimi E'den yoksun bir maya suşundan bir mitokondri gösterilmektedir. Yabani tip mitokondrinin normal Lala Christi'sinden farklı olarak, bu organeller bunun yerine ya Christi'den yoksun ya da küçük balon şeklinde zar istilaları içeren bir dizi iç zar yapısı içerir. İyi kontrastlı Ingramlarda, A TP Synthes dimerleri, burada sarı ok uçlarıyla gösterildiği gibi kolayca görülebilir.

Zarları bölümlere ayırarak, şimdi sarı küre ile temsil edilen A TP sentezinin konumu, Christi'nin morfolojisi ile ilişkili olarak görselleştirilebilir. Bu durumda, A TP sentezi, Lo Meer Christi Sub tommo ortalamasının oldukça kavisli kenarları boyunca dimer sıraları oluşturur, proteinlerin yapılarının dört nanometre veya daha iyi çözünürlüklerde belirlenmesine izin verir. Bilinen x-ışını yapılarını alt tomo Graham'a yerleştirerek, protein komplekslerinin ortalama atomik modelleri kendi doğal ortamlarında görüldüğü gibi birleştirilebilir.

Bu örnekte, bireysel komplekslerin birbirine ve zardaki diğer protein komplekslerine göre organizasyonuna yardımcı olmak için ortalama hacimler Tomo Graham'a geri yerleştirilebilir. Protokolümüz, iç mitokondriyal zar içindeki protein komplekslerinin yapısını ve organizasyonunu belirlemek için elektron kriyo tomografisini nasıl kullanabileceğinizi göstermektedir. Bu protokol aynı zamanda farklı hücresel bölmeler içindeki diğer zara bağlı proteinlerin yapısını ve organizasyonunu belirlemek için de kullanılabilir.

Numune hazırlama, iyi termogramlar elde etmenin anahtarıdır. Donmuş hidratlı ızgara, 70 ila 150 nanometre kalınlığında mükemmel camsı gözler içermelidir. Normalde, optimum buz kalınlığı ve numune kalitesine sahip bir alan bulana kadar beş ila altı ızgarayı tararız.

Gram toplama için, özel kriyo aşaması ve enerji filtresi ve doğrudan elektron dedektörlü kamera ile 300 kilovoltluk bir transmisyon elektron mikroskobu en iyisidir, ancak yandan girişli kriyo aşaması ve bir CCD kamerası olan 200 kilovoltluk bir alet de kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir ağlama ızgarasının nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Bir eğim serisi toplayın, termogramı yeniden oluşturun ve bir alt tommo ortalaması hesaplayın.

Bunlar, bir hücredeki proteinlerin organizasyonunun, o hücrenin verimli A TP sentezi gibi biyolojik işlevleri yerine getirme yeteneğini nasıl etkilediğini araştırmak için gereken temel becerilerdir. Sıvı nitrojen ve sıvı Ethan ile çalışmanın çok tehlikeli olabileceğini ve her zaman koruyucu gözlük ve eldiven giyilmesi gerektiğini unutmayın.