Name: Elektron Cryo-tomografi ile Mitokondri ATP Sintazı dimerlerini Görselleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Öğrenin, elektron kriyotomografi ile mitokondri ATP sentazı dimerlerinin yapısını ve organizasyonunu nasıl belirleyeceğinizi. Bu yöntem, proteinlerin yerel durumdaki moleküler detaylarını koruyarak yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Max Planck Kurumu (KMD, BD, AWM&#39;nin, TB, TBB, DJM ve WK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (WK) ve bir doktora sonrası EMBO Uzun Vadeli tarafından finanse Excellence Frankfurt &quot;makromoleküler kompleksleri&quot; bir Kümesi tarafından desteklenen Bursu (VAMG).

Diferansiyel Santrifüj ile hücreler ya da dokulardan Mitokondri hazırlanması 1. Bu bölüm, çeşitli ökaryotik sağlam mitokondri izolasyonu için genel bir prosedürü anlatmaktadır. Tampon parçaları ve santrifüj hızları hassas, her doku için optimize edilmesi gerekir / türler okudu. <ol><li> Izotonik tampon hücreleri Ayrılma (örneğin, 250 mM sakaroz, 10 mM HEPES, pH 7.4) içinde bir cam boncuk öğütücüsü kullanılarak (mantar miselyumu), 28, enzimatik hücre duvarı (Saccharomyces cerevisiae) 29, bir bilyalı homojenleştirici sindirimi (tek cell ökaryotlar / kültür hücre / nematodlar) 30 veya blender (hayvan veya bitki dokuları) 31. </li><li> Düşük hızlı santrifüj (2000 x g, 4 ° C, 10 dakika) ve ardından da müslin içinden süzme ile hücre kalıntıları uzaklaştırılmıştır. </li><li> 9000 xg, 4 ° C (yüksek hızda santrifüj ile yüzer madde ve topak mitokondri toplayın, 10 dakika). </li><li> Gerekli olduğu takdirde, mitokondrial fraksiyonu 32, ilave saflaştırma için izotonik yoğunluk basamaklı bir derece kullanın. </li></ol> Elektron Cryo-tomografi için Mitokondri 2. hazırlanması Aşağıdaki bölümde, cryo-ET için dondurulmuş hidratlanır örnekleri elde açıklamaktadır. Not: Bu yöntem ciddi deri yanıklarına neden olabilmektedir derece soğuk sıvı azot ve etan kullanılmasını da gerektirir. Koruyucu gözlük ve cryo-koruma eldiven giyilmelidir. Ayrıca yanıcı sıvı etan, davlumbaz içerisinde ele alınmalıdır. <ol><li> 250 mM Trehaloz, yaklaşık 5 mg / ml toplam protein konsantrasyonunda, pH 7.4 &#39;de 10 mM HEPES tamponu içerisinde yeniden süspanse topak mitokondri. </li><li> Glow-deşarj holey karbon EM ızgaraları, üreticinin talimatlarına göre bir vakum cihazı karbon tarafı yukarı. </li><li> Bir sıvı azot serin iç tarafı üzerine etan gazı akımının yönlendirilmesi ile etan birkaç mililitre sıvılaştırılmasıed alüminyum kap. </li><li> Mitokondriyal süspansiyon ile 1 ve hemen cımbız düzenlenen kızdırma deşarj EM ızgara 3 ul geçerlidir: protein A-konjuge altın yanlılık süspansiyon 1 karıştırın. </li><li> Bir vitrifikasyon cihaz örneğin, bir ev yapımı giyotin içinde cımbız yerleştirin. Filtre kağıdı bir kama ile (~ 5 saniye veya sıvı durduktan yayma kadar) ve hemen tetiği bırakmadan tarafından sıvı etan içine ızgara dalma aşırı sıvı kurulayın. </li><li> Sıvı azot içine sıvı etan ızgara aktarın. Taşıma sırasında, filtre kağıdı ile ızgara fazla etan çıkarın. Sıvı etan içine bir filtre kağıdı kama şeklindeki parçanın ucu ile. Sıvı etan yükseldikçe, hafifçe filtre kağıdı ızgara sürükler ancak sıvı ön altında tutun. Sıvı etan kılcal hareket ile ızgara çıkarılır ve tüm sıvı etan çıkarıldıktan sonra, hemen sıvı azot içine ızgara aktarılmaktadır. </li><li> , Izgara saklama kutusu içine vitrifiye ızgara yerleştirin, birnd uygun şekilde daha sonraki kullanım için sıvı azot altında depolayın. </li></ol> Tomografik Tilt Serisi 3. Kaydı Aşağıdaki bölümde kurmak ve bir post-kolon enerji filtre ve CCD kamera ile donatılmış bir Polara elektron mikroskobu ile bir mitokondrinin bir tomografik eğim dizi toplamak açıklamaktadır. Benzer protokolleri CCD veya doğrudan elektron dedektör kameralarla donatılmış tüm elektron cryo mikroskopları kullanılır. <ol><li> Mikroskop hizalayın <ol><li> Testi takın örnek, örneğin, grafit ve holey karbon film altın adalar. </li><li> Mikroskobun düşük doz sisteminde seçiniz arama modu. </li><li> Eucentric yüksekliğe örnek getirin. Numune tutucu eğildiğinde bu minimal xy hareket noktasıdır. , 0 ° eğimde ilgi noktasını ortalamak 20 ° sahne eğin ve z yüksekliğini değiştirerek noktasını yeniden ortalamak. 0 ° dönün ve yanal ofset minimize edilinceye kadar tekrarlayın. </li><li> Seçinizpozlama modu. Bir tomogram toplamak için istenen büyütme seçin (örneğin, piksel boyutunu numune nm dedektör ≈ 0.6 üzerinde 25,000X). </li><li> Küçük bir kondansatör diyaframı (50-70 mm) seçin ve ışın görüntüleme cihazı yerine sadece daha geniş ve 60 e bir piksel okuma verir, böylece bir nokta boyutu ve ışın yoğunluğunu seçmek - / piksel (CCD) veya 14 e - / piksel / sn (doğrudan elektron dedektörü, sayma modu). </li><li> Merkezi kondansatör diyafram. </li><li> Gauss odak örneğin minimal kontrast noktasını bulun. Sıfırlama mikroskop bulanıklaştırma okuma ve doğru mafsal noktalarını ve üreticinin talimatlarına göre rotasyon merkezi. </li><li> Tomogram kayıt için istenen flulaştırmayla olarak çevirin. NOT: Düşük odaksızlık (2-4 mikron) kontrast pahasına çözünürlüğü artar ise Yüksek odaksızlık (8 mikron), kontrastı artırır ama çözünürlüğü azaltır. </li><li> Boş bir çukurun üzerine, göre üreticinin yeni kazanç referans oluşturmak ve enerji filtresi hizalamatalimatları. </li><li> Arama ve pozlama modları hizalayın. Pozlama modunda, bir ilgi noktasını ortalamak ve arama moduna geçmek. Seç 1,500X büyütme (dedektör üzerinde numunenin 0.033 mm / piksel) ve (artmış kontrast için) 100 mikron odaksızlık. Görüntü kaydırma bobinleri kullanarak ortalamak için faiz arka noktaya getirmek. </li><li> / Piksel (CCD) veya ~ 8 - e - ışın görüntüleme cihazı yerine sadece daha geniş ve 20 e ~ piksel okuma verir böylece arama modunda, spot boyutu ve ışın yoğunluğunu ayarlayın / piksel / sn (doğrudan elektron dedektörü, ) modunu sayma. </li></ol></li><li> İyi bir Numune Alanı bulma <ol><li> Sıvı azot sıcaklığında elektron mikroskop içine donmuş hidratlanır mitokondri ile ızgara yerleştirin (EM üreticinin talimatlarına bakın). </li><li> Arama modunda, uygun buz kalınlığı ve örnek kalitesi alanları için ızgara arayın. Tomogram koleksiyon için uygunluğunu belirlemek umut verici alanlarından bir 6 saniye arama görüntüsünü alın. Both iç ve dış mitokondrial membran bu büyütme görünür olmalıdır. </li></ol></li><li> Bir Tomografik Tilt Serisi Kayıt <ol><li> İyi bir örnek alanı bulunduktan sonra 60 ° pozlama herhangi bir engel olmadan kullanılabilir maksimum eğim aralığı belirlemek veya ızgara çubukları veya buz parçaları ile odak alanı için ±, sahne yatırın. </li><li> / CCD veya 6-8 e piksel - - ​​benzer görünüm yakındaki bir buz dolu delik, böylece her kaydedilen görüntü 30-50 e bir elektron dozu var ışın yoğunluğu veya görüntü alma zamanı pozlama moduna geçmek ve ayarlayın / piksel / modu sayma, doğrudan elektron dedektörleri s. </li><li> 60 ° görüntünün o ile 0 ° edinilen 1 sn görüntü için ortalama elektron sayısının bölünmesiyle doz dağılımı oranını (I 0 / I 60) hesaplayın. Bu oran (tutma süresi = 1 / C eğim açısı arttığında görüntü başına sabit bir elektron sayılmasını sağlamak için gerekli maruz kalma süresinde artış demektiros (α) n burada (I 0 / I 60) = 2 n). Oranı da buz kalınlığı iyi bir göstergesi olarak hizmet vermektedir. Mitokondri İyi tomografi genellikle I 0 / I 60 = 2.3-2.6 ile kaydedilir. </li><li> Boş bir çukurun üzerine, pozlama modu 1 sn görüntü elde ve Å 2 başına elektron sayısını unutmayın. Dikkate doz dağılımı oranını alarak, belirli bir toplam elektron doz için kaydedilebilir resimlerin toplam sayısını hesaplamak (örneğin, &lt;40 e - yapı tayini için / Å 2 &amp; ~ 160 e - morfoloji için / Å 2). </li><li> Toplam eğim aralığı bölünmesi ile tomogram toplanması için uygun bir eğim aralığını belirlemek (örneğin, ± 60 °, 120 °) 3.3.4 hesaplanan görüntülerin toplam sayısına göre. </li></ol></li><li> Set up ve uygun otomatik veri toplama yazılımı 3 kullanılarak yukarıda belirlenen parametreler ile bir tomogram kayıt3, 34. Tilt dizi genellikle ± 20 ° başladı ve artan elektron doz tarafından tahrip düşük eğim görüntülerin bilgi içeriğini maksimize etmek için yüksek tilts ulaşmadan 0 ° geçmesi edilir. </li></ol> 4. Oluşturma ve Tomografi Ciltler Segmentasyon Bu bölüm mitokondri tomografik hacimleri eğim serisi ve hacimleri genel görüntüleme için mevcut ne üretilir açıklamaktadır. <ol><li> Uygun bir dizine tomografik tilt dizi kaydedebilirsiniz. Görüntü yığını oluşturmak ve mrc yığınlarının .dm3, .dm4 veya .tif dosyalarını dönüştürmek gibi dm2mrc veya tif2mrc (IMOD paket) gibi açık kaynak yazılım, uygun bir dosya biçimi, dönüştürün. mrc yığınları imod 35 tomografik yeniden yapılanma için gereklidir. Diğer paketler farklı biçimleri gerektirir. </li><li> (Görüntüleri hizalayın ve IMOD öğretici ayrıntılı adımları izleyerek bir tomogram oluşturmak <ahref=&quot;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html&quot;&gt;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ). </li><li> Imod ile dağıtılan doğrusal olmayan anizotropik difüzyon filtresi kullanılarak tomografisinde kontrastını arttırmak. Bu filtre membranlar ve bu ATP sentaz gibi membran-ilişkili parçacıklar için de çalışıyor. </li><li> Görselleştirme için, el ile kademeli tomogram, örneğin, ticari olarak temin edilebilir Amira programları kullanılarak. Iç ve dış zar tekabül eden vokseller atama ve bir yüzey oluşturur. Amira 36 için EM-paket eklenti tıkırtı seçeneğini kullanarak ATPsentaz parçacıkların konumunu işaretleyin. </li></ol> 5. Subtomogram ATP Sintazı dimerlerinin ortalamasının ve X-Ray Yapılarının Dizaynı Aşağıdaki bölümde ATPsentaz dimerlerinin subtomogram ortalamaları elde edilebilir anlatılmaktadır. <ol><li> Böyle &#39;Kapsamında girdi ve uygun bir yazılım paketi olarak işaretlenmiş parçacıklar kullanılarakElektron Tomografi &#39;programı için icle Tahmini, bir subtomogram ortalamasını hesaplamak. </li><li> Bir çözünürlük tahmini için, Fourier kabuk korelasyon 37 iki bağımsız olarak belirlenir subtomogram ortalamalarının karşılaştırılması. </li><li> Rijit gövde tarafından subtomogram ortalama içine mevcut, rıhtım bilinen X-ışını yapılar, ya elle uydurma veya programda Chimera 38 gibi otomatik sıralı yerleştirme rutinleri kullanıyorsanız. </li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Burada sunulan protokol ve mitokondri subtomogram ortalamasını ET-kriyo bir giriş sağlar, ancak esas itibariyle aynı prosedürü herhangi bir başka hücre bölmesi veya membrana uygulanabilir. Mümkün olan en iyi verileri elde etmek için, işlem sırasında kritik adımlar numune hazırlama, dalma dondurma işlemi ve veri toplama stratejisi vardır. Başarı için kritik olan örnek kalitesi, iyi görüntü kontrastı için büyük önem taşımaktadır uygun buz kalınlığının sağlanması için optimize edilmiş bir donma protokolü bağlıdır. En iyi veri elde etme stratejisi cihaz ve örnek bağlıdır. Optimize edilmesi Parametreler görüntü başına elektron doz, eğim düzeni ve bulanıklaştırma bulunmaktadır. İyi bir örnek iyi bir tomogram Kazanılması bütün işleme kolay adımları ve tatmin edici bir uç sonuç sağlar yapar. Cryo-ET subtomogram ortalama alma ve atom modeli montaj ile kombine protein kompleksleri inci nasıl düzenlenir ayrıntılarını sağlarEIR yerli hücresel ortamı. Bu teknik, örneğin solunum zinciri supercomplexes (1.7 MDA), ATP sentetaz dimerlerinden oluştuğunu gösterir (2x500 kDa), ya da çekirdek gözenek kompleks (~ 120 MDA) 8, 9, 17 gibi büyük bir zar protein kompleksleri, yapısını araştırmak için de aynı derecede uygundur. Dimer satırlar izolasyonu gerekli bir adımdır deterjan ekstraksiyon, bozulur çünkü satır içine ATPsentaz dimerlerinin organizasyonu, örneğin X-ışını kristalografisi, NMR veya tek-parçacık cryo-EM gibi yüksek çözünürlüklü teknikleri ile görülemez ve membran protein komplekslerinin saflaştırılması. Kristalarında sırtlarda dimerlerinin satır ATP sentaz düzenlemesi bütün türlerin mitokondri evrensel bir örgütlenme ilkesidir. Elektron nakil zincirinin proton pompalama kompleksleri, özel komplekse, I (NADH dehidrojenaz), ya da yan satır 8 zarı alanları bulunur9. Solunum zinciri Bu organizasyon mitokondriyal Bioenerji üzerinde derin bir etkisi vardır. Dimer satır bağlı dimer özel protein alt birimlerinin olmaması oluşturamazsa, Şekil 3 41&#39;de gösterilen maya mutant de görüldüğü gibi, hücreler daha uzun üretim süresi ve düşük hücresel uygunluk gösterirler. Mitokondriyal hastalıklarda artan ilgi ile, detaylı bir mitokondriyal ultrastrüktürünü ve işlevini yöneten moleküler temeli anlaşılması önem taşımaktadır. Elektron cryo tomografi nanometre ölçeğinde zar protein yüksek çözünürlüklü metodlarla tespit yapısı ve dağılımı ve bu proteinlerin düzenleme arasında bir bağlantı sağlar. Bu cryo-ET sağlığı ve hastalıkları, mitokondriyal yapısını ve işlevini anlamak için gerekli bir araç yapar. Cryo-ET de teknik ilerlemeler ve gelişmeler Protei konumunu belirlemek için protein etiketleme stratejileri içerirmakromoleküler kompleksleri n alt üniteleri veya hücrelerde daha küçük veya daha az farklı proteinlerin yeri (&lt;0.5 MDa). Ayrıca, tek parçacık analizi veya sarmal imarlı subtomogram ortalamasını birleştiren hibrid EM işleme yöntemleri, son zamanlarda protein yapılarını tespit ettik Å 42, 43 8 ~ için. Bu işleme yöntemleri şu anda iyi buz ayrılmış veya sarmal meclisleri oluşturmak ve şu anda mitokondri gibi kalabalık ortamlarda hücresel için geçerli değildir ve membranlar kristalarında olan saflaştırılmış proteinlerin, kısıtlanır. Veri toplama için yeni bilgisayar ve donanım araçları, otomatik tomogram satın izin görüntü kontrastını artırmak ve gereken toplam elektron dozu azaltmak için geliştirilmektedir. Kriyo-ET tek temel sınırlama elektron ışını ile radyasyon numuneye zarar verir. Bu, sadece çok düşük dozlarda elektron zayıf sinyal-t ile sonuçlanan bir tomografik eğim serinin her görüntüyü kaydetmek için kullanılan anlamına gelirO-gürültü sonuçta elde çözünürlüğünü sınırlar oranı. Bir yıl önce daha az piyasaya yeni doğrudan elektron dedektörleri, şu anda tek parçacık cryo-EM 44, 45 alanında devrim vardır. Bu yeni detektörler düşük elektron dozlarda daha yüksek kontrast ve daha iyi çözünürlük sağlar. Elektron cryo-tomografi için, bu aşırı radyasyon hasarı (bir CCD görüntü 5 doğrudan elektron dedektörü görüntüleri elektron dozunda eşdeğer) endişe olmadan alınabilir küçük adım boyutlarda hatta çift eksenli tomogramları ile Eğim dizi anlamına gelir. Bu dedektörler tarafından üretilen verilerin büyük miktarlarda üstesinden gerekecektir veri işleme, saklama ve işleme kendi zorlukları, oluşturun. Buna ek olarak, faz kontrastı arttırmak için ışık mikroskobu rutin olarak kullanılanlar gibi benzer prensipler ile çalışır faz plakaları şu anda, transmisyon elektron mikroskopisi 46, 4 için geliştirilmektedir7. Bu tomografi odaklanmak yakın toplanmış ve dolayısıyla daha yüksek çözünürlükte, aynı zamanda düşük çözünürlüklü koruyarak uyum ve tomografik hacimleri yorumlanması için gerekli özellikleri izin vermelidir. Birlikte ele alındığında, bu teknolojik gelişmeler büyük ölçüde cryo-ET tarafından ele alınabilir biyolojik sorular yelpazesini genişletmek olacaktır.

Mitokondri hücrenin güç evler. Kimyasal bağ enerji içine iç mitokondrial membran genelinde bir elektrokimyasal proton degrade dönüştürerek, mitokondriyal ATP sentaz hücresel süreçleri sürücüler ATP&#39;nin en üretir. Mitokondrial enerji dönüşümü arkasındaki mekanizmaları anlamak için, biz yerinde ATP sentaz yapısını belirlemek için, ve düzenlenmiş ve iç mitokondrial membran nasıl dağıldığını bulmak gerekir. Tüm karmaşık 4 mitokondrial ATP sentetaz bileşenleri 1-3 ve düşük çözünürlüklü haritalar çoğu yüksek çözünürlüklü yapılar mevcut olmakla birlikte, bu membran, işçi enzimin yapısını ve bir biçimini oluşturmaktır önemlidir. Iç mitokondrial membran ATP sentaz dağılımı yaygın olarak rastgele olduğu varsayılır, ancak 6 bu t değil belirtti 5 ve kendi ilk sonuçları erken olmuşturO durumda. Elektron taşıma zincirinin proton pompa her iki tarafında bulunduğu görülür iken sonradan bizim gruptan çalışmalar ve diğerleri 7, ATP sentaz iç mitokondrial membran kristalarında 8 sıkıca kavisli sırtlar boyunca dimerlerinin uzun sıralar halinde düzenlenmiş olduğunu doğruladı Sıralar 9. Bu düzenleme mitokondriyal enerji dönüşüm mekanizmalarının önemli etkileri vardır. Biz bu düzenlemeyi belirlemek için kullandık tekniği elektron cryo-tomografi (cryo-ET) &#39;dir. Cryo-ET şu anda moleküler çözünürlükte hücreler, hücre bölmeleri veya organellerin doğru üç boyutlu (3D) hacimlerini veren tek yöntemdir. Zarlar iyi kontrast görünür ve 3D tomografik hacimlerde iz kolay çünkü cryo-ET, biyolojik zarların büyük kompleksleri eğitim için uygundur. Diğer yöntemler, hücrelerin veya organell 3D yapısını incelemek içines moleküler detay vermeyin. Süper çözünürlük ışık mikroskobu 10, 11 pozisyon veya nm onlarca hassasiyetle ilgi proteinlere bağlı ışık yayan etiketler arasındaki mesafeleri ortaya çıkarmayı mükemmel, ama bu bile düşük çözünürlükte, proteinin kendi yapısını ortaya koymuyor . Plastik-gömülü biyolojik numunelerin elektron mikroskobu 13 taramalı seri bölümleri 12 ya da blok-yüz görüntüleme transmisyon elektron mikroskopisi, hücre hacimlerinin düşük çözünürlüklü manzaralar sunar ama aynı şekilde moleküler detay ortaya koymuyoruz. Atomik kuvvet mikroskobu 14 prensip moleküler hatta atomik çözünürlük sunuyor, ama sadece bir atomik düz, katı destek nesnelerin yüzeyinde olabilir. Son olarak, X-ışını tomografisi 15 ya da serbest elektron lazerleri yoğun X-ışını palslarının saçılma örneğin 16 m bütün hücrelerin veya organel olarak büyük, kompleks, aperiyodik nesne yapısını ortaya çıkarmak için pek mümkün değildiröngörülebilir gelecekte olecular çözünürlük. Böylece şu anda, nanometre çözünürlükte hücreleri veya organellerin 3D yapı çalışmaları için-ET cryo için hiçbir alternatif yoktur. Kriyo-ET, çekirdek gözenek kompleks 17, grip başak 18 kompleksleri de dahil olmak üzere zara bağlı protein düzeneklerinin yapısını ve şeklini incelenmesi için tercih edilen bir yöntem, ve kamçı motor proteinleri, 22, 23, aynı zamanda, tüm bakteri hücreleri 19 arasında organizasyon hücrelerde 20-23 ile HIV gibi patojenik virüslerin ve giriş. Cryo-ET aktin filamentler 24 veya axonemes 25 dahil ipliksi proteinler ve hücre içindeki etkileşimleri, görselleştirmek için paha biçilmezdir. Çözünürlüğü tekrar düzenli özellikler hacimler tek parçacık Image Pro bir tomografik birimin kesilmiş ve ortalaması alınır ve bu sayede subtomogram, 26, ortalama 2 nm ya da daha iyi arttırılabilircessing teknikleri. Cryo-ET transmisyon elektron mikroskobu (TEM) farklı tilt açıları alınan ince bir örneğinin (&lt;250nm) projeksiyon görüntüleri bir dizi satın içerir. Madde ile kuvvetli bir etkileşimi elektronlar, birden fazla dağılmış şekilde örnek ince olmalıdır. Çoklu saçılma yorumlamak çıkan görüntülerin zorlaştırır ve kontrastı azaltır. Seçilen örnek alanın Görüntüler her bir diğerine göre hizalanmış ve numunenin bir 3D hacmi üretme, uygun bir bilgisayar programı tarafından 3D uzaya yansıtılır. Görüntülerin hizalama dondurma öncesi numune ile karıştırılır altın yanlılık belirteçleri tarafından desteklenir. İdeal olarak 10 ya da daha fazla eşit dağıtılmış yanlılık belirteçler iyi bir uyum elde etmek için, her bir görüntü mevcut olmalıdır. Moleküler ayrıntı gözlemek için, numuneler dalma-dondurulmuş onların yerli hidrate durumunu korur sıvı etan, vardır. Bir sıvı içinde dondurulmasıetan kadar hızlı (~ 5 ° 10 ° C / sn) su kristalize ama vitrifiye, cam benzeri durumda kalır değil 27. Buz kristallerinin oluşması zarar verir ve hassas biyolojik yapıları. Biyolojik örnekler radyasyon hasarı muzdarip gibi, numune tahammül saçılma olaylarının toplam sayısı için bir sınır yoktur. Görüntüler böylece düşük doz modunda edinilen: ilgi alanı 1 e altında bir elektron doz düşük büyütme (1,500X) tespit edilir - / 2 nm (arama modu). Görüntü daha sonra faiz (odak modu) alanı kapalı, yüksek büyütmede odaklanmıştır. Bir görüntü elde edilir sadece, ilgi alanı yüksek bir elektron dozda (pozlama modu) ile ışınlanır. Burada, bir örnek olarak iç mitokondrial membran ATP sentaz dimerleri kullanarak toplama ve proses elektron cryo-tomografi için nasıl bir bakış sunacak. Aşağıdaki protokol cryo-ET için mitokondri nasıl hazırlanacağını anlatır, nasıl kurmakve belirli bir toplam elektron dozu ve nasıl ilgi alanındaki bir 3 boyutlu hacim elde etmek için tenteli serisi işlemek için olan bir eğim dizi toplamak. Işlem bir genel görünüşü Şekil 1&#39;de gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Sükroz</td><td>Roth</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>Trehaloz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9449</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Zimülaz</td><td>biyomol</td><td>Z1000.1</td><td></td></tr><tr><td>Yoğunluk gradyan ortamı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556 veya P1644</td><td></td></tr><tr><td>Protein A altın</td><td>Aurion</td><td>810.111</td><td>10 nm</td></tr><tr><td>Nitrojen Hava</td><td>Sıvısı</td><td>P0502S02R0A001</td><td></td></tr><tr><td>Azotlu</td><td>Hava Sıvısı</td><td>I4150RG</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Sarf malzemeleri</td></tr><tr><td>Filtre kağıdı</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1004 090</td><td>Nr 4</td></tr><tr><td>Cımbız</td><td>Dumont</td><td>T506</td><td>Manyetik olmayan, desen #5</td></tr><tr><td>EM kombine test ızgarası</td><td>Plano GmbH</td><td>S142</td><td>delikli karbon film üzerinde grapite ve altın adalar</td></tr><tr><td>Holey karbon ızgaralar</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH veya C-flat</td><td></td><td>R2/2 300 Cu ağ</td></tr><tr><td>Cryo ızgara kutuları</td><td>Plano GmbH</td><td>160-42</td><td>Alternatif ev yapımı metal kutular</td></tr><tr><td>Potter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7984</td><td></td></tr><tr><td>Blender</td><td>Waring</td><td>8011S</td><td></td></tr><tr><td>Cam boncuk değirmeni - boncuk çırpıcı</td><td>BioSpec Ürünler</td><td>1107900-105</td><td>0,5 mm boncuklar dahil</td></tr><tr><td>Bilyalı rulmanlı (Balch) homojenizatör</td><td>isobiotec</td><td>H8</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td>46915</td><td>Sorvall RC6 +</td></tr> <tr><td>Kızdırma deşarj aparatı</td><td>Bal-Tec AG</td><td>CTA 010</td><td></td></tr><tr><td>Izgara vitrifikasyon cihazı</td><td>FEI, Gatan veya Leica</td><td></td><td>Alternatif ev yapımı piston</td></tr><tr><td>Transmisyon elektron mikroskobu</td><td>FEI veya Jeol</td><td></td><td>300 keV</td></tr><tr><td>Doğrudan elektron dedektörü</td><td>Gatan</td><td>K2 zirvesi</td><td>4k x 4k piksel, sayılan mod</td></tr><tr><td>Şarj bağlantılı cihaz (CCD)</td><td>Gatan</td><td>US4000</td><td>4k x 4k piksel (Doğrudan elektron dedektörüne alternatif)</td></tr><tr><td>Enerji filtresi</td><td>Gatan veya Jeol</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>Image acquisition yazılımı</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tomogram edinme yazılımı</td><td>Gatan, FEI, USCF veya UC-Boulder</td><td></td><td>4 alternatif</td></tr><tr><td>Tomogram işleme yazılımı</td><td>FEI, UCSF veya UC-Boulder</td><td></td><td>3 alternatif</td></tr><tr><td>Subtomogram ortalama alma yazılımı</td><td>UC-Boulder veya Basel</td><td></td> Üniversitesi <td>2 alternatif</td></tr><tr><td>Tomogram görselleştirme yazılımı</td><td>UC-Boulder, FEI veya Utah</td><td></td> Üniversitesi <td>3 alternatif</td></tr><tr><td>Görselleştirme yazılımı eklentisi</td><td>Goethe üniversitesi</td><td></td><td>http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/</td></tr> <tr><td>Yapı görselleştirme yazılımı</td><td>UCSF</td><td></td><td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td></tr> <tr><td>Sayısal hesaplama yazılımı</td><td>MathWorks</td><td></td><td>http://www.mathworks.de/academia/</td></tr></tbody></table>

elektron cryo-tomografi ile mitokondri atp sintazı dimerlerini görselleştirme

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Elektron cryo tomografi gibi moleküler ayrıntılı olarak hücrelere, organel, zar veziküllerinin ya da virüsler gibi biyolojik örnekler, üç-boyutlu bir yapıya sahip görselleştirme yapısal biyolojide güçlü bir araçtır. Bunu elde etmek için, sulu bir örneği hızla bir yakın-yerli, dondurulmuş sulu halde de korur sıvı etan, içinde vitrifiye edildi. Elektron mikroskobu, tilt serisi 3D tomografi yeniden oluşturulmasını sağlayan sıvı azot sıcaklığında kaydedilir. Tomografik hacminin sinyal-gürültü oranı doğal düşüktür. Tanınabilir, yinelenen özellikleri, bireysel hacimler, kesip hizalanmış ve gürültüyü azaltmak için ortalama tarafından hangi subtomogram ortalamaya tarafından geliştirilmiş. Bu şekilde, 3 boyutlu elde edilebilir 2 nm ya da daha iyi bir çözünürlüğe sahip eşleştirir. 3D hacmine kullanılabilir yüksek çözünürlüklü yapıların bir uyum sonra kendi doğal ortamında protein kompleksleri atom modelleri üretiyor. Burada biz elektron cryo-tomograp kullanımı nasıl göstermekhy mitokondri büyük membran protein kompleksleri yerinde organizasyonu incelemek. Karmaşık rasgele sıraların her iki tarafında membran bölgeleri dağıtılır ise ATP sentez, iç membran krista derece eğimli uçları dışa boyunca dimerlerin sıralar halinde organize olduğunu bulmak. Subtomogram ortalama alma terimi ile krista zarı içinde mitokondriyal ATP sentetaz dimerinin bir yapı elde edilmiştir.

Mitokondri elektron cryo-tomografi açıkça (Şekil 2) organelinin 3D morfolojisini ortaya koymaktadır. Tomografik hacimde zarların manüel olarak bir mitokondride krista yapısını göstermektedir. Belirli bir protein bileşenleri eksikliği farklı maya nakavt soylarından mitokondri görüntüleme ile, krista morfolojisi bu proteinlerin etki değerlendirilebilir yoluyla elde. 3 ATP sentetaz alt-birimi E eksik maya kökü bir mitokondri göstermektedir. ATP sintaz kompleksinin bu bileşeni, mitokondriyal ATP sentaz dimerizasyonunun için gereklidir. Bu gövdeden mitokondri (Şekil 2), yabani tür mitokondri normal katmanlı krista yoktur ve bunun yerine, iç zar bölümlerine bir dizi içerir. Bu bölmeler, krista ya yoksun olan veya küçük balon şeklinde membran invajinasyonları (Şekil 3) içerir. Tomograms Bu durumda ATP sentaz dimerlerdeki iyi kontrast, geniş mitokondriyal protein kompleksleri ile, kolayca görülebilir (Şekil 4; Film 1). (; Film 2, Şekil 5) komplekslerinin yapıları subtomogram ortalamaya 2-3 nm çözünürlükte belirlenebilir. (; Film 3, Şekil 6), ortalama hacim zar içinde birbirlerine göre ve diğer protein kompleksleri bireysel komplekslerinin organizasyonu değerlendirmek amacıyla tomografisinde geri yerleştirilebilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" width="500" /> Elektron cryo-tomografisinin aşamalarını gösteren 1. Akış şeması Şekil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> Yabanitip S. Cerevisiae&#39;den bir mitokondrinin Şekil 2. Morfoloji. Bir yabanitipte S. bir tomografik hacmi ile Orta dilim cerevisiae Mitokondri (solda) ve ilgili yüzey-render hacmi (sağ). Ancak, dış membranın segmente gri renkle gösterilir ve iç sınır hacimleri ve açık mavi zar krista edilir. Davies ve arkadaşları 8 uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" width="500" /> Bir S 3. Mitokondri Şekil. Cerevisiae suşu için gerekli bir alt birimini eksikATP sentaz Dimerleştirme. Tomografik hacmi (solda) ve S bir mitokondrinin yüzey hale hacmi (sağ) eşlik aracılığıyla dilimleyin. ATPsentaz dimerizasyonundan için gerekli protein alt birimi E eksik cerevisiae suşu. Şekil 2 ile karşılaştırıldığında, mutant suşu olan mitokondri vahşi tipli mitokondri normal katmanlı krista yoksundur. Bunun yerine, herhangi bir Mitokondri ya da balon krista şeklindeki krista ya da birçok iç membran bölmeleri vardır. Böylece elektron cryo-tomografi delesyonlardır nedeniyle membran morfolojisi değişiklikleri vurgular. Davies ve arkadaşları 8 uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" width="500" /> Figurmantar S. e 4. Mitokondri anserina. ipliksi mantar P. bir mitokondrinin tomografik hacmi (sol) ve (sağ) Ekteki yüzey render hacmi ile dilimleyin anserina. Bu tomografisinde, 10 nm&#39;lik bir partikül (sarı ok başları) sıraları, iç membran kristalarında derece eğimli membran sırtlar üzerinde yer alır (Film 1 e bakınız). Bu parçacıklar subtomogram ortalamaya ATPsentaz dimerler olarak tespit edilmiştir. Davies ve ark 9. Den <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" target="_blank">büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig5highres.jpg" width="500" /> Mitokondriyal ATP sentaz Şekil 5. yapısı ve organizasyon. Side ve S&#39;den bir ATPsentaz dimerin elektron yoğunluğunu gösteren üstten görünümü c<html> erevisiae monte atom modelleri (solda) subtomogram ortalama alma ile belirlenmiştir. Satır (sağda) ATPsentaz dimerlerinin organizasyonunu gösteren mitokondriyal iç membran vezikül. Şekil ortalama sırasında hesaplanan koordinatları kullanarak, zar vesikül segmentli hacmi içine ATP sintaz dimerinin subtomogram ortalama konumlandırılmasıyla elde edilmiştir. Davies ve arkadaşları 8 uyarlanmıştır. Atom modelleri: F 1 / rotor-halkası [PDB: 2WPD] 39 (mavi ve mor); duyarlı kazandıran protein OSCP oligomycin [PDB: 2BO5] 40 (yeşil); periferik sapı fragmanı [PDB: 2CLY] N-terminal kalıntıları ile 1 [PDB: 2WSS] 2 (sarı ve kırmızı) (Film 2 bakınız). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig6highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <html> _upload / 51228 / 51228fig6highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Bir P. Şekil 6. İzole krista vezikül anserina Mitokondri. Dilimler P. krista vesikülün tomografik hacmi (sol) ve (sağ) Ekteki yüzey render birimdeki anserina. Zarından çıkıntı yapan protein yoğunlukları açık bir şekilde görülebilir. Subtomogram ortalamaya tanımlanan sarı ok uçları ile gösterilen yoğunlukları, ATPsentaz dimerlerdir. Yeşil ok uçları NADH dehidrojenaz gibi antikor etiketleme tarafından tespit yoğunlukları işaret (1 kompleksi; detayları 9 bakınız). Protein yoğunlukları bölümlendirilmesi (bakınız sıraların her iki tarafındaki zar bölgelerde yüksek kıvrımlı sırtlar boyunca krista sıraları oluşturarak (kırmızı ve sarı) ATP sintaz dimerleri ve NADH dehidrogenaz kompleksleri (yeşil) ile, kristalarında düzenlenmelerini göstermektedir Film 3). Davies ve ark 9&#39;dan.28 / 51228fig7highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın. Bir P. Film 1. Elektron cryo-tomogram anserina Mitokondri. filmi ipliksi mantar P. bir mitokondri alınan tomografik hacmi ile art arda dilimler gösterir anserina. ATP sentaz satırlar sarı ok uçları ile gösterilir. Yüzey-render, bölümlenmiş hacmi 3D kristalarında yapısına göre ATP sentaz (sarı küreler) yerini gösterir. Dış zar, gri; iç sınır zar, saydam mavi; membranlar, opak mavi krista. Davies ve ark 9&#39;dan. Ayrıca Şekil 4 bakınız. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie1.mp4" target="_blank">Videoyu izlemek için burayı tıklayın.</a> S mitokondriyal ATP sentaz dimerinden Film 2. Subtomogram ortalama. Donatılmış atom modelleri ile cerevisiae&#39;de. Ortalama121 hacimler hesaplandı. Yoğunluk üç kontur düzeyde görüntülenir: 1s - örgü, 2s - açık gri ve 3s - koyu gri. Atom modelleri Chimera sıralı uygun rutin kullanılarak yoğunluğu içine monte edildi. Atom modelleri: F 1 / rotor-halkası [PDB: 2WPD] 39 (mavi ve mor); duyarlı kazandıran protein OSCP oligomycin [PDB: 2BO5] 40 (yeşil); periferik sapı fragmanı [PDB: 2CLY] N-terminal kalıntıları ile 1 [PDB: 2WSS]. 2 (sarı ve kırmızı) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie2.mov" target="_blank">Videoyu izlemek için burayı tıklayın.</a> Davies ve arkadaşları 8 uyarlanmıştır. Ayrıca Şekil 5 bakınız. Bir P. Film 3. İzole kristalarında vezikül Mitokondri anserina. ardına dilimleri tomografik hacim ile parçalara ayrılmış yüzey işlenmiş hacim olarak takip etmektedir. Membranın çıkıntı yapan protein yoğunluklarıE açıkça görülebilir. Kırmızı ve sarı yoğunlukları ATPsentaz dimerlerdir. Yeşil yoğunlukları antikor etiketlemesi ile saptandığı haliyle NADH dehidrojenaz (karmaşık I) bileşikleridir. Davies ve ark 9&#39;dan. Ayrıca Şekil 6 bakınız. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie3.mpg" target="_blank">Videoyu izlemek için burayı tıklayın.</a>

Biz toplamak ve tüm mitokondri süreç elektron cryo-tomografi nasıl bir protokol mevcut. Teknik, doğal biyolojik membranların büyük membran protein komplekslerinin yapısı, işlevi, ve organizasyon hakkında detaylı bilgiler sağlar.

Elektron Cryo-tomografi ile Mitokondri ATP Sintazı dimerlerini Görselleştirme

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Bu prosedürün genel amacı, C iki'deki mitokondriyal proteinlerin yapısını ve organizasyonunu belirlemektir. Bu işlem, öncelikle numuneyi içeren dondurulmuş hidratize bir elektron mikroskobu ızgarasının oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, bir elektron kriyomikroskobunda numunenin doz sınırlı bir eğim serisi kaydedilir.Ardından, tomografik bir hacim oluşturmak için eğim serisi işlenir. Son olarak, proteinlerin yapısını belirlemek için protein yoğunluklarının ortalaması alınır ve membranların 3D yapısını ortaya çıkarmak için membranlar segmente edilir. Protein ortalamalarının Tom Graham'lara yeniden yerleştirilmesiyle, membrandaki proteinlerin yapısı ve organizasyonu ortaya çıkarılır.Mitokondrilerin moleküler düzeyde nasıl çalıştığını anlamak istediğimiz için mitokondrilerin elektron kriyotomografisini yapıyoruz. Bu tekniğin, ince plastik kesitlerin elektron mikroskopisi gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, çözünürlüğünün daha yüksek olmasıdır. Materyal hiçbir şekilde kimyasal olarak fikse edilmez ve proteinlerin moleküler detayları korunur.Elektron kriyografisi tekniğinde uzmanlaşmak biraz zaman alabilir, ancak deneyimli kullanıcılar her oturumda beş ila altı adet kaliteli TOM alanı elde edebilirler. Prosedürün en zor kısmı, optimal buz kalınlığına sahip dondurulmuş hidratlanmış gridler üretmektir. Metin protokolüne uygun olarak mitokondrileri izole edip peletledikten sonra, peleti yaklaşık beş mg/mL toplam protein konsantrasyonuna yeniden süspand etmek için 10 mM HEPA tamponu içinde 250 mM T triozları kullanın. Üretici talimatlarına uygun olarak, bir vakum cihazında karbon EM gridleri karbon yüzeyi yukarı bakacak şekilde glow discharge işlemine tabi tutun; sıvı azotla soğutulmuş bir alüminyum konteynerin iç yüzeyine bir etan gazı akışı yönlendirerek birkaç mililitre etanı sıvılaştırın.Bir cımbız kullanarak akkor boşalımıyla işlem görmüş bir DM ızgarasını alın ve tezgah üzerine yerleştirin; konjuge altın fidüsiyel süspansiyonu, mitokondri süspansiyonu ile bire bir oranda protein karışımında karıştırın ve çözeltiden üç µL'yi hemen ızgaraya uygulayın. Ardından, cımbızı, filtre kağıdı kaması bulunan ev yapımı bir giyotin gibi bir vitrifikasyon cihazına yerleştirin, ızgara üzerindeki fazla sıvıyı emdirin ve ızgarayı anında sıvı etana daldırmak için tetiği bırakın. Daha sonra ızgarayı sıvı etandan sıvı azota transfer edin.Taze bir filtre kağıdı kamasının ucunu sıvı etana yerleştirerek ızgara üzerindeki fazla etanı temizleyin. Sıvı yükseldikçe, ızgarayı sıvı önünün altında tutarak filtre kağıdı boyunca nazikçe yukarı çekin ve ardından daha sonra kullanmak üzere saklamak için derhal sıvı azota aktarın. Tomografik eğim serisi kaydetmek için ızgarayı bir ızgara kutusuna yerleştirin ve sıvı azotla dolu bir saklama kabında muhafaza edin.Sıvı azot dozörlerinin dolu olduğundan emin olarak başlayın ve numune tablası ile ızgara transfer cihazının sıcaklığının 100 kelvin'in altında olduğunu kontrol edin. Bir test ızgarasının görüntüsünü elde ederek ve Thon halkalarının kalitesini kontrol ederek elektron mikroskobunun düzgün şekilde hizalandığını onaylayın; Thon halkaları yuvarlak olmalı ve görüntünün kenarına kadar uzanmalıdır. Ardından, donmuş hidrate mitokondriler içeren bir ızgara yerleştirin.Ardından arama modunda, uygun buz kalınlığına ve numune kalitesine sahip alanları arayın. Veri toplama için uygunluğunu belirlemek amacıyla, gelecek vadeden alanların altı saniyelik bir arama görüntüsünü alın. İyi bir numune alanı belirledikten sonra, pozlama veya odaklama alanının grid çubukları veya benzer görünümlü yakındaki buzla dolu bir delikteki buz kristalleri tarafından engellenmeden mevcut olan maksimum tilt aralığını belirlemek için sahneyi artı veya eksi 60 derece eğin, pozlama moduna geçin ve ışın yoğunluğunu veya görüntü elde etme süresini ayarlayın.Böylece kaydedilen her görüntü, CCD'ler için piksel başına 30 ila 50 elektron veya saniyede piksel başına altı ila sekiz elektronluk bir elektron dozuna sahiptir. Doğrudan elektron dedektörleri için, sıfır derecede elde edilen bir saniyelik görüntünün boş bir delik üzerindeki ortalama elektron sayısını, 60 derecelik bir görüntününkine bölerek doz dağılım oranını veya I sıfır / I 60 değerini hesaplayın. Pozlama modunda bir saniyelik bir görüntü elde edin ve angstrom kare başına elektron sayısını not edin.Doz dağılım oranını dikkate alarak, uygun otomatik veri toplama yazılımını kullanarak belirli bir toplam elektron dozu için kaydedilebilecek toplam görüntü sayısını ve eğim aralığını hesaplayın. Tipik tomografiler için az önce belirlenen parametrelerle bir tomogram kurulumu yapın ve kayıt altına alın. Bu numuneler için artı veya eksi 20 dereceden başlayın ve yüksek eğimlere ulaşmadan önce sıfır dereceden geçin.Tomogramlar oluşturmak ve bunları segmente etmek için, eğim serisini rekonstrüksiyon yazılımına uygun bir dosya formatına dönüştürün. Imod gibi bir tomogram rekonstrüksiyon programı kullanarak, altın fidüsiyel işaretçilerin konumlarını işaretleyerek görüntüleri hizalayın. Hizalama tamamlandıktan sonra bir tomogram oluşturun.Görselleştirme için IM o ile birlikte dağıtılan doğrusal olmayan izotropik difüzyon filtresi gibi bir görüntü filtresi kullanarak tomogramın kontrastını artırın. Tomogramı manuel olarak segmente etmek için ticari olarak mevcut programlar kullanın. İç ve dış zara karşılık gelen vokselleleri ayrı katmanlara atayın; atama işlemi tamamlandıktan sonra, zarları görselleştirmek için bir yüzey oluşturun.emira için EM paket eklentisindeki clicker seçeneğini kullanarak, işaretli partikülleri girdi olarak ve partikül kestirimi gibi uygun bir yazılım paketi aracılığıyla TP sentaz partiküllerinin konumlarını işaretleyin. Elektron tomografisi programı için, bir çözünürlük kestirimi adına bir agram ortalaması hesaplayın. Ücretsiz görselleştirme programını kullanarak, bağımsız olarak belirlenmiş iki alt tomo ortalaması arasındaki foyer kabuk korelasyonunu hesaplayın.Chimera, bilinen x-ışını yapılarını önce manuel olarak, ardından bu şekildeki gibi "fit" komutuyla otomatik olarak sub Tom Agram ortalamasına uydurur; mitokondriyal elektron kriyotomografisindeki membranların manuel segmentasyonu, bir mitokondrideki kristaların yapısını ortaya çıkarır. Belirli proteinlerden yoksun maya nakavt suşlarından mitokondrilerin görüntülenmesiyle, bu proteinlerin krista morfolojisi üzerindeki etkisi değerlendirilebilir.Burada, TP sentaz dimerlerinin oluşumu için gerekli olan TP sentez alt birimi E'den yoksun bir maya suşuna ait bir mitokondri gösterilmektedir. Yabani tip mitokondrilerin normal Lala Christi yapısının aksine, bu organeller bunun yerine ya Christi içermeyen ya da küçük balon şeklinde membran invajinasyonları içeren bir dizi iç membran yapısı barındırır. Kontrastı yüksek görüntülerde, A TP sentaz dimerleri burada sarı ok başlarıyla belirtildiği gibi kolayca görülebilmektedir.Membranların segmente edilmesiyle, şu an sarı küre ile temsil edilen ATP sentazın konumu, kristaların morfolojisiyle ilişkili olarak görselleştirilebilir. Bu durumda ATP sentazlar, krista Lo Meer bölgesinin yüksek derecede kavisli kenarları boyunca dimer sıraları oluşturur. Subtomogram ortalaması, protein yapılarının 4 nm veya daha iyi çözünürlüklerde belirlenmesine olanak tanır. Bilinen X-ışını yapıları alt tomogram ortalamalarına yerleştirilerek, görüldüğü üzere protein komplekslerinin doğal ortamlarındaki ortalama atomik modelleri oluşturulabilir.Bu örnekte, bireysel komplekslerin birbirlerine ve membrandaki diğer protein komplekslerine göre organizasyonuna yardımcı olmak amacıyla ortalama hacimler Tomo Graham'e geri yerleştirilebilir. Protokolümüz, iç mitokondriyal membran içindeki protein komplekslerinin yapısını ve organizasyonunu belirlemek için elektron kriyotomografisini nasıl kullanabileceğinizi göstermektedir. Bu protokol, farklı hücresel bölmelerdeki diğer membran bağlı proteinlerin yapısını ve organizasyonunu belirlemek için de kullanılabilir.Numune hazırlama, iyi termogramlar elde etmenin anahtarıdır. Dondurulmuş hidrate ızgara, 70 ile 150 nanometre kalınlığında mükemmel vitre gözler içermelidir. Normalde, optimum buz kalınlığına ve numune kalitesine sahip bir alan bulana kadar beş ila altı ızgara taranır.Gram toplama işlemi için, özel kriyojenik sahne, enerji filtresi ve doğrudan elektron dedektörlü kameraya sahip 300 kilovolt iletim elektron mikroskobu en iyisidir; ancak yan girişli kriyojenik sahne ve CCD kameraya sahip 200 kilovolt'luk bir cihaz da kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir kriyojenik gridin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bir eğim serisi toplayın, tomogramı yeniden yapılandırın ve bir alt tomogram ortalaması hesaplayın.Bunlar, bir hücredeki protein organizasyonunun, hücrenin verimli ATP sentezi gibi biyolojik fonksiyonları gerçekleştirme yeteneğini nasıl etkilediğini araştırmak için gereken temel becerilerdir. Sıvı azot ve sıvı etan ile çalışmanın çok tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu nedenle her zaman koruyucu gözlük ve eldiven kullanılmalıdır.

visualization-atp-synthase-dimers-mitochondria-electron-cryo

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz, moleküler makinelerin yerinde yapılarında yüksek çözünürlük belirlemek için yüksek verimli cryo-elektron tomografisi yararlanmak için nasıl bir protokol mevcut. Protokol ortak darboğazları önler, büyük miktarda veri işlenecek izin verir ve kullanıcı önemli biyolojik sorulara odaklanmak için izin, kaynak çalışmama süresini azaltır.

Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Birçok protein, zar yüzeylerine bağlandığında işlevlerini yerine getirir. Ekstrinsik proteinlerin nanodisk membranları üzerindeki bağlanması, transmisyon elektron mikroskobu ile dolaylı olarak görüntülenebilir. Negatif leke sodyum fosfotungstat tarafından indüklenen nanodisklerin karakteristik istiflenmesinin (rouleau), ekstrinsik proteinin bağlanmasıyla önlendiğini gösteriyoruz.

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Bu protokol için seri-bölüm elektron tomografi uygulanması mitokondrial Drosophila dolaylı uçuş kas yapısında aydınlatmak için göstermektedir.

3D mitokondriyal Ultrastructure Drosophila dolaylı uçuş kas seri-bölüm elektron tomografi tarafından ortaya

Genetik modifikasyondan sonra tüm hücrelerde mitokondri ve endoplazmik retiplinin dağılımını incelemek için bir protokol sunuyoruz, askorbat peroksidaz 2 ve horserpu peroksidaz boyama da dahil olmak üzere bağıntılı ışık ve hacim Elektron Mikroskopisi kullanılarak aynı bölümde hedef geni olan ve olmayan hücrelerin seri bölümlemesi ve elektron mikroskobu ile seri görüntüleme.

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Kriyo-elektron tomografisi ile in situ makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmaları için kriyo odaklı iyon ışını mikromakine ile dalma donmuş biyolojik örneklerin lamel hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. Sunulan protokol, Saccharomyces cerevisiaeiçindeki makromoleküllerin yapısal karakterizasyonu için yüksek tekrarlanabilirlik ile yüksek kaliteli lamel hazırlanması için yönergeler sağlar.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Saccharomyces cerevisiae'nin Hazırlanması ve Kriyo-FIB mikromakinesi

Mevcut protokol, Tomo5 kullanılarak yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografisi uzaktan veri toplama ve emClarity kullanılarak sonraki veri işleme ve subtomogram ortalamasını açıklamaktadır. Apoferritin, 2.86 şçözünürlükte bir kriyo-ET yapısı elde etmek için ayrıntılı adım adım süreçleri göstermek için bir örnek olarak kullanılır.

Kriyo-elektron Tomografisi Uzaktan Veri Toplama ve Subtomogram Ortalaması

Bu protokol, bireysel iyon kanallarını izlemek ve desteklenen lipit membranlarındaki aktivitelerini belirlemek için TIRF mikroskopisinin nasıl kullanılacağını açıklar, böylece yanal membran hareketi ile kanal fonksiyonu arasındaki etkileşimi tanımlar. Membranların nasıl hazırlanacağını, verilerin nasıl kaydedileceğini ve sonuçların nasıl analiz edileceğini açıklar.

Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu Kullanılarak Lipid Çift Katmanlarında Yanal Mobilite ve İyon Kanalı Aktivitesinin Tek Moleküllü Görüntülenmesi

Kriyo-STEM tomografisi, bozulmamış hücrelerin organellerini gömme, kesitleme veya diğer invaziv preparatlar olmadan görselleştirmek için bir araç sağlar. Elde edilen 3D çözünürlük şu anda birkaç nanometre aralığında, birkaç mikrometrelik bir görüş alanı ve 1 μm mertebesinde erişilebilir bir kalınlık ile.

Kriyo-STEM Tomografi ile Organellerin In Situ Görüntülenmesi

Bu protokol, yüksek doğruluk, yüksek çözünürlük ve yüksek verim ile 3D görüntüleme elde etmek için mitokondriyal cristae'nin nasıl yeniden yapılandırılacağını açıklar.

Pankreas Kanseri Hücrelerinde Mitokondriyal Ultrastrüktürel Değişikliklerin Görselleştirilmesi için Üç Boyutlu Bir Teknik

Kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET), hücresel üst yapının nanometre çözünürlükte 3D görselleştirilmesini sağlar, ancak manuel segmentasyon zaman alıcı ve karmaşık olmaya devam etmektedir. Kriyo-ET tomogramlarını segmentlere ayırmak için gelişmiş sanal gerçeklik yazılımını entegre eden ve memeli hücrelerinde mitokondrinin segmentasyonu yoluyla etkinliğini gösteren yeni bir iş akışı sunuyoruz.

Kriyo-elektron tomografi verilerinin sürükleyici segmentasyonu ve analizi için sanal gerçeklikten yararlanma

Öğrenin, elektron kriyotomografi ile mitokondri ATP sentazı dimerlerinin yapısını ve organizasyonunu nasıl belirleyeceğinizi. Bu yöntem, proteinlerin yerel durumdaki moleküler detaylarını koruyarak yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme sağlar.

Elektron Cryo-tomografi ile Mitokondri ATP Sintazı dimerlerini Görselleştirme

Daha fazla video keşfet