Elektron Cryo-tomografi ile Mitokondri ATP Sintazı dimerlerini Görselleştirme

Bu prosedürün genel amacı, C iki'deki mitokondriyal proteinlerin yapısını ve organizasyonunu belirlemektir. Bu işlem, öncelikle numuneyi içeren dondurulmuş hidratize bir elektron mikroskobu ızgarasının oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, bir elektron kriyomikroskobunda numunenin doz sınırlı bir eğim serisi kaydedilir.

Ardından, tomografik bir hacim oluşturmak için eğim serisi işlenir. Son olarak, proteinlerin yapısını belirlemek için protein yoğunluklarının ortalaması alınır ve membranların 3D yapısını ortaya çıkarmak için membranlar segmente edilir. Protein ortalamalarının Tom Graham'lara yeniden yerleştirilmesiyle, membrandaki proteinlerin yapısı ve organizasyonu ortaya çıkarılır.

Mitokondrilerin moleküler düzeyde nasıl çalıştığını anlamak istediğimiz için mitokondrilerin elektron kriyotomografisini yapıyoruz. Bu tekniğin, ince plastik kesitlerin elektron mikroskopisi gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, çözünürlüğünün daha yüksek olmasıdır. Materyal hiçbir şekilde kimyasal olarak fikse edilmez ve proteinlerin moleküler detayları korunur.

Elektron kriyografisi tekniğinde uzmanlaşmak biraz zaman alabilir, ancak deneyimli kullanıcılar her oturumda beş ila altı adet kaliteli TOM alanı elde edebilirler. Prosedürün en zor kısmı, optimal buz kalınlığına sahip dondurulmuş hidratlanmış gridler üretmektir. Metin protokolüne uygun olarak mitokondrileri izole edip peletledikten sonra, peleti yaklaşık beş mg/mL toplam protein konsantrasyonuna yeniden süspand etmek için 10 mM HEPA tamponu içinde 250 mM T triozları kullanın. Üretici talimatlarına uygun olarak, bir vakum cihazında karbon EM gridleri karbon yüzeyi yukarı bakacak şekilde glow discharge işlemine tabi tutun; sıvı azotla soğutulmuş bir alüminyum konteynerin iç yüzeyine bir etan gazı akışı yönlendirerek birkaç mililitre etanı sıvılaştırın.

Bir cımbız kullanarak akkor boşalımıyla işlem görmüş bir DM ızgarasını alın ve tezgah üzerine yerleştirin; konjuge altın fidüsiyel süspansiyonu, mitokondri süspansiyonu ile bire bir oranda protein karışımında karıştırın ve çözeltiden üç µL'yi hemen ızgaraya uygulayın. Ardından, cımbızı, filtre kağıdı kaması bulunan ev yapımı bir giyotin gibi bir vitrifikasyon cihazına yerleştirin, ızgara üzerindeki fazla sıvıyı emdirin ve ızgarayı anında sıvı etana daldırmak için tetiği bırakın. Daha sonra ızgarayı sıvı etandan sıvı azota transfer edin.

Taze bir filtre kağıdı kamasının ucunu sıvı etana yerleştirerek ızgara üzerindeki fazla etanı temizleyin. Sıvı yükseldikçe, ızgarayı sıvı önünün altında tutarak filtre kağıdı boyunca nazikçe yukarı çekin ve ardından daha sonra kullanmak üzere saklamak için derhal sıvı azota aktarın. Tomografik eğim serisi kaydetmek için ızgarayı bir ızgara kutusuna yerleştirin ve sıvı azotla dolu bir saklama kabında muhafaza edin.

Sıvı azot dozörlerinin dolu olduğundan emin olarak başlayın ve numune tablası ile ızgara transfer cihazının sıcaklığının 100 kelvin'in altında olduğunu kontrol edin. Bir test ızgarasının görüntüsünü elde ederek ve Thon halkalarının kalitesini kontrol ederek elektron mikroskobunun düzgün şekilde hizalandığını onaylayın; Thon halkaları yuvarlak olmalı ve görüntünün kenarına kadar uzanmalıdır. Ardından, donmuş hidrate mitokondriler içeren bir ızgara yerleştirin.

Ardından arama modunda, uygun buz kalınlığına ve numune kalitesine sahip alanları arayın. Veri toplama için uygunluğunu belirlemek amacıyla, gelecek vadeden alanların altı saniyelik bir arama görüntüsünü alın. İyi bir numune alanı belirledikten sonra, pozlama veya odaklama alanının grid çubukları veya benzer görünümlü yakındaki buzla dolu bir delikteki buz kristalleri tarafından engellenmeden mevcut olan maksimum tilt aralığını belirlemek için sahneyi artı veya eksi 60 derece eğin, pozlama moduna geçin ve ışın yoğunluğunu veya görüntü elde etme süresini ayarlayın.

Böylece kaydedilen her görüntü, CCD'ler için piksel başına 30 ila 50 elektron veya saniyede piksel başına altı ila sekiz elektronluk bir elektron dozuna sahiptir. Doğrudan elektron dedektörleri için, sıfır derecede elde edilen bir saniyelik görüntünün boş bir delik üzerindeki ortalama elektron sayısını, 60 derecelik bir görüntününkine bölerek doz dağılım oranını veya I sıfır / I 60 değerini hesaplayın. Pozlama modunda bir saniyelik bir görüntü elde edin ve angstrom kare başına elektron sayısını not edin.

Doz dağılım oranını dikkate alarak, uygun otomatik veri toplama yazılımını kullanarak belirli bir toplam elektron dozu için kaydedilebilecek toplam görüntü sayısını ve eğim aralığını hesaplayın. Tipik tomografiler için az önce belirlenen parametrelerle bir tomogram kurulumu yapın ve kayıt altına alın. Bu numuneler için artı veya eksi 20 dereceden başlayın ve yüksek eğimlere ulaşmadan önce sıfır dereceden geçin.

Tomogramlar oluşturmak ve bunları segmente etmek için, eğim serisini rekonstrüksiyon yazılımına uygun bir dosya formatına dönüştürün. Imod gibi bir tomogram rekonstrüksiyon programı kullanarak, altın fidüsiyel işaretçilerin konumlarını işaretleyerek görüntüleri hizalayın. Hizalama tamamlandıktan sonra bir tomogram oluşturun.

Görselleştirme için IM o ile birlikte dağıtılan doğrusal olmayan izotropik difüzyon filtresi gibi bir görüntü filtresi kullanarak tomogramın kontrastını artırın. Tomogramı manuel olarak segmente etmek için ticari olarak mevcut programlar kullanın. İç ve dış zara karşılık gelen vokselleleri ayrı katmanlara atayın; atama işlemi tamamlandıktan sonra, zarları görselleştirmek için bir yüzey oluşturun.

emira için EM paket eklentisindeki clicker seçeneğini kullanarak, işaretli partikülleri girdi olarak ve partikül kestirimi gibi uygun bir yazılım paketi aracılığıyla TP sentaz partiküllerinin konumlarını işaretleyin. Elektron tomografisi programı için, bir çözünürlük kestirimi adına bir agram ortalaması hesaplayın. Ücretsiz görselleştirme programını kullanarak, bağımsız olarak belirlenmiş iki alt tomo ortalaması arasındaki foyer kabuk korelasyonunu hesaplayın.

Chimera, bilinen x-ışını yapılarını önce manuel olarak, ardından bu şekildeki gibi "fit" komutuyla otomatik olarak sub Tom Agram ortalamasına uydurur; mitokondriyal elektron kriyotomografisindeki membranların manuel segmentasyonu, bir mitokondrideki kristaların yapısını ortaya çıkarır. Belirli proteinlerden yoksun maya nakavt suşlarından mitokondrilerin görüntülenmesiyle, bu proteinlerin krista morfolojisi üzerindeki etkisi değerlendirilebilir.

Burada, TP sentaz dimerlerinin oluşumu için gerekli olan TP sentez alt birimi E'den yoksun bir maya suşuna ait bir mitokondri gösterilmektedir. Yabani tip mitokondrilerin normal Lala Christi yapısının aksine, bu organeller bunun yerine ya Christi içermeyen ya da küçük balon şeklinde membran invajinasyonları içeren bir dizi iç membran yapısı barındırır. Kontrastı yüksek görüntülerde, A TP sentaz dimerleri burada sarı ok başlarıyla belirtildiği gibi kolayca görülebilmektedir.

Membranların segmente edilmesiyle, şu an sarı küre ile temsil edilen ATP sentazın konumu, kristaların morfolojisiyle ilişkili olarak görselleştirilebilir. Bu durumda ATP sentazlar, krista Lo Meer bölgesinin yüksek derecede kavisli kenarları boyunca dimer sıraları oluşturur. Subtomogram ortalaması, protein yapılarının 4 nm veya daha iyi çözünürlüklerde belirlenmesine olanak tanır. Bilinen X-ışını yapıları alt tomogram ortalamalarına yerleştirilerek, görüldüğü üzere protein komplekslerinin doğal ortamlarındaki ortalama atomik modelleri oluşturulabilir.

Bu örnekte, bireysel komplekslerin birbirlerine ve membrandaki diğer protein komplekslerine göre organizasyonuna yardımcı olmak amacıyla ortalama hacimler Tomo Graham'e geri yerleştirilebilir. Protokolümüz, iç mitokondriyal membran içindeki protein komplekslerinin yapısını ve organizasyonunu belirlemek için elektron kriyotomografisini nasıl kullanabileceğinizi göstermektedir. Bu protokol, farklı hücresel bölmelerdeki diğer membran bağlı proteinlerin yapısını ve organizasyonunu belirlemek için de kullanılabilir.

Numune hazırlama, iyi termogramlar elde etmenin anahtarıdır. Dondurulmuş hidrate ızgara, 70 ile 150 nanometre kalınlığında mükemmel vitre gözler içermelidir. Normalde, optimum buz kalınlığına ve numune kalitesine sahip bir alan bulana kadar beş ila altı ızgara taranır.

Gram toplama işlemi için, özel kriyojenik sahne, enerji filtresi ve doğrudan elektron dedektörlü kameraya sahip 300 kilovolt iletim elektron mikroskobu en iyisidir; ancak yan girişli kriyojenik sahne ve CCD kameraya sahip 200 kilovolt'luk bir cihaz da kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir kriyojenik gridin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bir eğim serisi toplayın, tomogramı yeniden yapılandırın ve bir alt tomogram ortalaması hesaplayın.

Bunlar, bir hücredeki protein organizasyonunun, hücrenin verimli ATP sentezi gibi biyolojik fonksiyonları gerçekleştirme yeteneğini nasıl etkilediğini araştırmak için gereken temel becerilerdir. Sıvı azot ve sıvı etan ile çalışmanın çok tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu nedenle her zaman koruyucu gözlük ve eldiven kullanılmalıdır.