Kriyo-elektron Tomografisi Uzaktan Veri Toplama ve Subtomogram Ortalaması
July 12th, 2022
Mevcut protokol, Tomo5 kullanılarak yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografisi uzaktan veri toplama ve emClarity kullanılarak sonraki veri işleme ve subtomogram ortalamasını açıklamaktadır. Apoferritin, 2.86 şçözünürlükte bir kriyo-ET yapısı elde etmek için ayrıntılı adım adım süreçleri göstermek için bir örnek olarak kullanılır.
Bu protokol, kriyo elektron tomografisinin giderek daha popüler ancak karmaşık dünyasına kolay bir erişim yolu sağlar. Altı hücresel örnek görüntülenebilir. Yerli devlete yakın bir enstitü.
Mikromoleküller daha sonra CROW, ET ve alt atom ortalaması kullanılarak doğal hücresel ortamlarında yüksek çözünürlükte çözülebilir. Tomo five yazılımını TEM sunucu bilgisayarından başlatarak başlayın. Ön ayarların altındaki hazırlık sekmesinde görüntü alma parametrelerini ayarlayarak oturum kurulumunu başlatın.
Görüntü alma parametrelerini diğer tüm yüksek büyütme ön ayarlarına kopyalayın. Mikroskopa pozlamayı ayarlamak için "Ayarla" ve tek tek seçtikten sonra pozlama ayarlarını diğer tüm yüksek büyütmelere almak için "Al" a basın. Bir atlas toplamak için, "Atlas" sekmesindeki "Yeni Oturum" a tıklayın.
Oturum tercihlerini ayarlayın. Depolama yolunu ve çıktı biçimini girin ve uygula'ya basın. Gösterim'i seçin ve edinilecek tüm atlasları işaretleyin.
Çağrı Vanalarını Kapat'ı Seç "Mikroskop denetimsizse, bu kolon valflerini kapatacaktır. Ardından gösterimi başlatmak için başlat düğmesine basın. Oturum Kurulumu" altındaki sol paneldeki ızgaraya tıklayarak hedefler için tek veya birden fazla atlası inceleyin, ardından hareket etmek için fareyi sol tıklayın ve sürükleyin ve yakınlaştırmak ve uzaklaştırmak için orta kaydırmayı yapın.
Hedef kurulum için ızgarayı seçin. Seçin ve yazılımın içinden "Yük Örneği" ne tıklayın. Görüntü kaydırma kalibrasyonunu gerçekleştirmek için, Otomatik İşlevler" sekmesinde ön ayarı Ösantrik Yükseklik"Otomatik Ösantrik Yüksekliğe Git"Sahne eğimine göre ayarlayın ve başlat düğmesine basın.
Hedefleme sırasında özellik ortalanmış olarak kalırsa, görüntü kaydırma kalibrasyonlarını atlayın. Aksi takdirde, görüntü kaydırmayı kalibre etmek için "Hazırlık" sekmesine gidin ve Görüntü Kaydırmayı Kalibre Et" i seçin ve başlat'a basın. Bu, daha düşük büyütmeleri, pozlama büyütmesinde ortalanan özelliğe hizalar.
Tomografi kurulumu için, biyolojik örnekler için "Oturum Kurulumu"nda yeni bir oturum başlatın. Örnek türü olarak "Levha" yı seçin ve Toplu ve Düşük Doz'u seçin"Ardından Çıktı formatı ve depolama" klasörünü seçin. İsteğe bağlı olarak, bir e-posta alıcısı ekleyin ve Uygula'ya basın"Hedefleri ayarlamak için atlas okuna gidin, ilgilendiğiniz bir bölge bulun ve sağ fare tıklamasıyla açılan seçenekleri belirleyerek hareket edin.
Ösentrik yükseklik ayarı için iyi bir pozisyonu onaylamak üzere bir genel bakış görüntüsü alın. Ardından, ösentrik eğim rutinine göre ösentrik çalıştırmak için "otoesantrik" tuşuna basın, ösentrik yüksekliği güncellemek için yeni bir genel bakış görüntüsü elde edin. Kareye genel bakışı veya edinilen arama haritasını inceleyin.
İlgilendiğiniz bir bölgeye gidin ve arama elde et'e basın. Ardından, ilgilenilen bölge ortalanmamışsa arama görüntüsünü inceleyin, istediğiniz konuma sağ tıklayın ve Aşamayı buraya taşı "ve görüntü elde edin. Odak ve izleme alanlarını ayarlayın.
İzleme ve odak alanlarını sürüklemek için sol tıklayın. Tüm parametreler ayarlandıktan sonra Konum Ekle'ye basın"Otomatik işlevleri gerçekleştirmek için, atlası bir karbon alanına yönlendirerek Otomatik İşlevler" sekmesi aracılığıyla hizalamaları gerçekleştirmek için ayarları kontrol edin. Bu alanı ösentrik yüksekliğe getirin ve metin el yazmasında açıklandığı gibi hizalama sırasını izleyin.
Ardından, tomografi sekmesinin otomatik olarak edinilmesini başlatın. Veri Toplama" levhasını seçin ve istediğiniz parametreleri ayarlayın. Veri toplama parametrelerini ayarlayın: eğim adımı, maksimum pozitif açı, maksimum negatif açı, izleme şeması.
Ardından, ösentrik yükseklik şeması için "Sütun Vanalarını Kapat" ı seçin. Giriş dosyalarını ve dizinleri hazırlayarak başlayın. Proje"klasörü altında bir proje klasörü oluşturun.
Başka bir yeni klasör sabit yığınları oluşturun ve giriş dosyalarını hazırlayın. Eğim serisi bir sabit eğim serisi 1. XF ve tilt serisi 1.tlt.
Bulanıklaştırmayı hesaplamak için, parametre dosyasını mikroskop ve görüntüleme parametreleriyle güncelleyin. Bir parametre dosyasını proje klasörüne kopyalayın. Adını param_CTF olarak değiştirin.
M'yi çalıştırın ve belirtilen komutu çalıştırın. Ardından, CTF tahmin sonuçlarını kontrol edin. Her yığın için, 3D modunu kullanarak hizalanmış yığınları kontrol edin ve referans boncuklarının doğru şekilde silindiğinden emin olun.
Belirtilen komutu çalıştırarak elinizin doğru olduğundan emin olun. Ardından bulanıklaştırma değerini kontrol edin ve teorik CTF tahminiyle eşleştiğinden emin olun. Alt bölgeleri tanımlamak için bir büküm tomogramı oluşturun.
Proje klasöründe, belirtilen komutu çalıştırın. Altı nokta seçerek sınırları belirleyin Xmin Xmax Ymin, Ymax, Zmin ve Zmax, bin10 klasörü altında bir alt bölge oluşturmak için belirtilen komutu çalıştırın. Ardından, her alt bölge için parçacık toplamayı çalıştırın.
Apoferritin veri kümesi için bin altıda bir şablon araması yapın. Şablon alt çizgi açısını değiştirin. Düzlem içi veya düzlem dışı aramanın açısını, aralığını ve aralıklarını derece cinsinden belirlemek için arama parametreleri.
Proje klasöründe belirtilen komutu çalıştırın. Klasörün altındaki 3D modunu kullanarak yanlış parçacıkları çıkarın. Convmap_wedge_Type2_bin6. Belirtilen komutu çalıştırın.
Ardından, projeyi başlatın. Proje klasöründe, EM netliği için AppoF.mat için bir veritabanı oluşturmak üzere belirtilen komutu çalıştırın. Bin4'te CTF düzeltilmiş alt bölge tomogramları oluşturmak için alt tomo ortalaması ve hizalamasından önce tomogram rekonstrüksiyonu gerçekleştirin, belirtilen komutu çalıştırın.
Daha sonra, alt tomo ortalamasını ve hizalamasını gerçekleştirmek için, bin4'ten başlayan CTF düzeltilmiş alt telgrafları kullanarak ortalamayı gerçekleştirin. Proje klasöründe, belirtilen komutu çalıştırın. Hizalamalar yapmaya devam edin ve komutu çalıştırın.
Belirtilen komutu çalıştırarak üst üste binen parçacıkları temizleyin. İki yarım veri kümesini birleştirerek son yeniden yapılandırmayı gerçekleştirin. Proje klasöründe belirtilen komutları çalıştırın.
Hücresel ve moleküler tomografi için tomografi iş akışına genel bakış, hücresel ve lamel örnekleri için burada gösterilmiştir, veri toplama stratejisi büyük ölçüde örneğe ve görüntüleme çalışmasının amacına bağlıdır. Birkaç kriyo ET çalışması için toplama parametreleri burada gösterilmiştir. Apoferritin, ince hücresel süreçler ve kalın hücresel numunenin odaklanmış iyon ışını öğütülmüş lamelleri gibi moleküler örneklerin temsili tomogramları burada gösterilmiştir.
Yüksek çözünürlüklü yapısal analiz, ilaç hedefleri için bağlanma bölgelerinin ortaya çıkarılmasına yardımcı olabilir ve tomografi ve sub-tomogral ortalama, SARS-CoV-2'ye karşı aşı geliştirmeye de yardımcı olmaktadır.
Genel Bakış
Bu protokol, apoferritin'i model sistem olarak kullanarak, yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET) uzaktan veri alımı ve işleme için ayrıntılı adımları belirtmektedir. İş akışı, veri toplamadan alt-tomograf ortalamasına kadar verimli yöntemlerle 2.86 Å çözünürlükte bir kriyo-ET yapısı çözünürlüğü elde eder.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Kriyo-elektron tomografisi
- Yapısal biyoloji
- Hücresel görüntüleme
Arka Plan
- Kriyo-elektron tomografisi tekniklerine giriş.
- Hücresel örneklerin doğal hallerinde görüntülenmesinin önemi.
- Metodolojik gösterim için apoferritin kullanımı.
Kullanılan Yöntemler
- Tomo5 yazılımı ile uzaktan veri alımı.
- Alt-tomograf ortalaması için emClarity kullanarak işleme yöntemleri.
- Biyolojik sistemlerde yüksek çözünürlüklü görüntüleme.
Ana Sonuçlar
- Yüksek çözünürlüklü veri toplama ve işlemeyi başarıyla göstermek.
- Önemli çözünürlükte apoferritinin ayrıntılı görüntülemesini sağlamak.
- Gelecek kriyo-ET çalışmaları için yöntemlerin doğrulanması.
Sonuçlar
- Bu çalışma, yapısal biyolojide yüksek çözünürlüklü görüntüleme için sistematik bir yaklaşım sunar.
- Özgelen yöntemler, kriyo-elektron tomografisi araştırmasını ilerletmek için uygundur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Cryo-electron tomography (cryo-ET) with remote data collection and subtomogram averaging enables high-resolution structural analysis of macromolecules in near-native cellular environments. This capability is critical for target validation, mechanistic de-risking, and accelerating early discovery decisions in biopharma R&D. The integration of robust remote workflows ensures uninterrupted access to advanced imaging infrastructure, supporting portfolio continuity and cross-site collaboration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of molecular complexes in situ, supporting functional target validation.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing native conformations and interactions.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway interrogation.
Screening & Assay Development
- Provides validated structural templates for downstream assay development.
- Supports reproducible, quantitative imaging outputs for screening readiness.
- Enables standardization of sample preparation and imaging parameters across projects.
Translational & Preclinical Research
- Aligns high-resolution imaging with disease-relevant systems for translational biomarker discovery.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by maintaining native-state structural fidelity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on structural insights.
Pipeline & Workflow Integration
This remote cryo-ET workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by providing high-resolution, quantitative structural data accessible from any location.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through direct molecular visualization.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay standardization.
- Analytics: Enables robust measurement of structural parameters and statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Maintains structural continuity for biomarker alignment and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, remote-access imaging capability for multi-program support.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enables remote, scalable data collection.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization and cross-functional advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM instrumentation and data analysis software (Tomo5, emClarity).
- Demands robust IT infrastructure for remote access and data storage.
- Necessitates cross-team standardization of imaging and analysis protocols.
- Adaptation across diverse sample types may require protocol optimization.
- Practical limitations include sample thickness, imaging throughput, and computational resources.
