Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Bu prosedürün genel amacı, kullanıcıların yüksek kapasiteli bir kriyoelektron tomografi veri toplama ve işleme hattı kurmalarına yardımcı olmaktır. Bu yöntem, kriyoelektron tomografi alanındaki şu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir: Yeni nesil dedektörlerle toplanan veriler nasıl yönetilir ve otomatik eğim serisi toplama yazılımları tarafından üretilen devasa miktardaki veri nasıl işlenir? Bu tekniğin temel avantajı, kullanıcının otomatik eğim serisi işleme için verimli bir iş akışı bulmak amacıyla birden fazla yazılım paketini birleştirici bir şekilde yapılandırabilmesi ve böylece tomogram analizine daha fazla zaman ayırabilmesidir.

Genellikle, cryo-ET ile yeni tanışan kişiler, elektron mikroskobundan elde edilen devasa verileri işlemek için gereken birçok zahmetli adım nedeniyle zorluk yaşarlar. Bu geliştirme fikri ilk olarak beş yıl önce, tek bir bakterinin 3D rekonstrüksiyonunu elde etmek için yüzlerce adımı manuel olarak gerçekleştirmek zorunda kaldığımız dönemde ortaya çıktı. Önceden, Shigella flexneri min hücrelerinin hazırlanmasına ilişkin metin protokolüne başvurun.

Ardından, mevcut bir JoVE yayınında açıklandığı ve metin protokolünde belgelendiği şekilde elektron mikroskobu ızgaralarını hazırlayın. Vitrifiye buz içine gömülmüş minihücre koleksiyonu ile EM tablasını yükledikten sonra, eğim serileri için düşük büyütmeli haritaları toplamaya başlayın. Yaklaşık 2300x gibi düşük bir büyütmede floresan ekrana bakarak, görüntüleme için uygun olan ızgara karelerini bulun.

Bu konum, kontaminasyon içermeyen ince buz ve ilgilenilen deneyi içermelidir. Ardından, görünümü ızgara karesinin merkezine ayarlayın ve konumu kaydetmek için Sahne Konumunu Ekle düğmesine tıklayın. Daha sonra, kabul edilebilir tüm ızgara karelerinin konumu kaydedilene kadar işlemi tekrarlayın.

Bir sonraki adım, yeni bir montaj dosyasının açılmasıyla başlar. Kurulum iletişim kutusunda, tüm ızgara karesinin yakalanması için X ve Y değerlerini ayarlayın. Standart, 200 mesh bir ızgara için, sekiz gibi yüksek bir Binning değeriyle 10'a 10'luk bir alan oluşturun.

Ayrıca, görüntüyü kaydırmak yerine sahneyi hareket ettir seçeneğini ve parçaları hizalamak için kullanılan korelasyonları atla seçeneğini etkinleştirin. Şimdi, Navigator penceresinde, Acquire düğmesini kullanarak elde edilecek ilk sahne konumunu seçin. Her bir sahne konumu için bu işlemi yapmaya devam edin.

Ardından, Navigator menüsü altında, Acquire at Points seçeneğine tıklayın. Açılan iletişim kutusunda, acquire map image ve rough eucentricity seçeneklerini etkinleştirin. Diğer tüm seçenekleri devre dışı bırakın.

Ardından, devam et seçeneğine tıklayın; böylece her sahne konumu için bir montaj oluşturulacaktır. SerialEM yazılımı ile çalışmaya devam edin. Navigator kısmından edinilen haritaları seçin ve Haritayı Yükle seçeneğine tıklayın.

Ardından, Add Points seçeneğine tıklayın ve eğim serisinin (tilt-series) alınması gereken noktaları harita üzerinde seçin. Seçimleri yaptıktan sonra Stop Adding Points seçeneğine tıklayın ve bu işlemi toplanan her harita için tekrarlayın. Daha sonra, Camera menüsü altındaki parametreleri açarak Focus, Trial ve Record modlarını ayarlayın.

Doz fraksiyonlu verileri kaydetme seçeneği özel bir ilgi alanı olabilir ve bu seçenek Kayıt seçenekleri altından belirlenebilir. Devam etmek için, mevcut haritadaki noktalardan birini seçin ve Gezgin penceresindeki eğim serisi seçeneğini etkinleştirin. Açılan iletişim kutusunda, eğim serisi için parametreleri seçin.

Ardından, haritadaki seçilen her bir nokta için eğim serisi (tilt-series) seçeneğini açıp kapatma işlemini tekrarlayın. Sonrasında, Navigator üzerinden Acquire at Points seçeneğini başlatın. Diyalog kutusu altında Preliminary Tasks, Realign to item, Autofocus ve rough eucentricity seçeneklerini işaretleyin.

Ardından, Birincil Görevi tilt-serisi edinimi olarak ayarlayın ve tüm noktalar toplandığında kolonu kapatmak için sonundaki yakın kolon değerlerini seçin. İşlem yürütüldüğünde, her haritada tilt-serisi toplama için etkinleştirilen her noktada bir tilt-serisi toplanacaktır. Orijinal tilt-serisi, SerialEM'den gelen çıktı günlüğü ve doz fraksiyonasyonlu bireysel görüntüler mevcut çalışma dizinindeyken, ışın kaynaklı hareket artefaktını gidermek için bir terminalde şu komutu çalıştırın.

Eğim serisinin hizalanması ve yeniden yapılandırılması aşamasına geçin. Terminale şu şekilde tomoauto komutunu yazın. Komutun sonuna, işlenecek eğim serisinin dosya adını ve ardından nanometre cinsinden referans işaretçisi çapını ekleyin.

CTF işlemesi istenmiyorsa, bu seçenek komuttan basitçe çıkarılabilir. Bu komut tomoauto'nun temel kullanımıdır ve kullanıcıların, başlangıçta manuel müdahale gerektiren tilt serisi hizalamasıyla ilgili tüm süreçleri tek bir komutla yürütmesine olanak tanıyarak toplu işlem betiklerinin hızlıca oluşturulmasını sağlar. Şimdi, 3dmod komutunu kullanarak hizalanmış tilt serisinde göze çarpan herhangi bir hata olup olmadığını inceleyin.

Burada filename, soneksiz eğim serisi adıdır. Ardından, burada gösterilen komutla tahmini CTF'yi inceleyin. Yine filename, soneksiz eğim serisi adıdır.

Ayrıca, tomoauto komutu tarafından oluşturulan çıktı günlüğünde, hizalamanın artık hatasını kontrol edin. Bu, hizalamanın genel kalitesinin kantitatif bir ölçüsüdür. Eğer hizalama kabul edilebilirse, rekonstrüksiyon hesaplamasına geçin.

Bu komut, CTF'yi düzeltmek ve hizalamada kullanılan fidüsiyal markerları tilt serisinden silmek için ayarlanmıştır. Görsel incelemeyi atlayıp doğrudan rekonstrüksiyona geçmek için bu komutu kullanın. Tomoauto'nun erişilebilir birçok seçeneği vardır.

Tomoauto belgelerine göre, özellikle dikkat çeken bir özellik, yardımcı bir dosya ile tanımlanan yerel yapılandırmaları dahil edebilme yeteneğidir. Eğim serisi dosya adını eklemeden önce, yerel yapılandırma seçeneğini kullanarak bu dosyanın adını komut satırı iletişim kutusuna ekleyin. Yerel yapılandırma dosyaları oluşturabilme imkanı, kullanıcıların kullanılan her komutu tamamen yapılandırmasına olanak tanıyarak, otomatik işlemeyi sürdürürken yürütmeyi belirli veya zorlu veri setlerine göre optimize edilmesini sağlayan tomoauto'nun en güçlü özelliğidir.

Test protokolü içerisinde, alt-tomogram ortalamasının nasıl yürütüleceğine dair ek talimatlar yer almaktadır. Açıklanan protokoller takip edilerek, tomoauto ile hizalanmış iki eğim serisi oluşturulmuştur. Hassas hizalama, ideal olarak fidüsyal marker koordinatlarını tanımlayan bir modelden hesaplanır.

50 derecede, bir eğim serisi altın parçacıklarını doğru şekilde takip ederek kabul edilebilir bir hizalamaya işaret etmiştir. İkinci eğim serisinde ise kırmızıyla gösterilen birkaç model noktası, karşılık gelen altın belirteçten sapmış ve bunun sonucunda modelin uygun bir hizalama üretmediği görülmüştür. Eğim serileri toplandığında, tomoauto toplanan eğim serilerinin %80 ila %90'ını başarıyla hizalamaktadır.

Rekonstrüksiyon sonrası elde edilen nihai tomogram, görüntü örneğinin 3B hacmidir. Bu hacim daha sonra segmentasyon yoluyla hücresel anotasyon için veya örnek içindeki moleküler mekanizmanın daha yüksek çözünürlüklü bilgilerini elde etmek amacıyla alt-tomogram ortalaması almak için kullanılabilir. EMDB'ye kaydedilen ekli Shigella flexneri'nin 2.7 nanometers alt-tomogram ortalaması, bu tekniğin injektisomu tek bir tomogramda görüntülemeye kıyasla sağladığı büyük iyileşmeyi göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, SerialEM ve tomoauto kullanarak otomatize, yüksek verimli bir şekilde kriyoelektron tomografi verilerinin nasıl toplanacağı ve işleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Doğru şekilde uygulandığında, bu teknik uzmanlaştıktan sonra günde yaklaşık 100 eğim serisi toplamaya ve bir eğim serisini 20 dakikada hizalamaya olanak tanır. Bu prosedürü uygularken, eğim serisi hizalamasının kalitesini her zaman kontrol etmeyi hatırlamak önemlidir.

Bir eğim serisi seti iyi hizalanmazsa, manuel hizalamayı deneyin ve parametreleri yerel bir konfigürasyona aktarın. Bu prosedürün ardından, makromoleküler komplekslerin daha yüksek çözünürlüklü yapısının belirlenmesi gibi ek soruları yanıtlamak için alt-tomogram ortalaması gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, kriyo-EM alanındaki araştırmacıların bakterilerde, virüslerde ve diğer organizmalarda yüksek çözünürlüklü in situ yapıları keşfetmesinin yolunu açmıştır.