Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Bu prosedürün genel amacı, kullanıcıların kriyo-elektron tomografisinin yüksek verimli bir toplama ve işleme boru hattı oluşturmasına yardımcı olmaktır. Bu yöntem, kriyo-elektron tomografisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin: yeni nesil dedektörlerle toplanan verileri nasıl işleyebilirim ve otomatik eğim serisi toplama yazılımı tarafından üretilen büyük miktarda veriyi nasıl işleyebilirim? Bu tekniğin ana avantajı, kullanıcının otomatik eğim serisi işleme için verimli bir boru hattı bulmak için birden fazla yazılım paketini birleştirici bir şekilde yapılandırabilmesi ve tomogram analizine daha fazla zaman harcanmasına olanak sağlamasıdır.

Genel olarak, cryo-ET'ye yeni başlayan bireyler mücadele edecektir çünkü elektron mikroskobundan üretilen büyük verileri işlemek için birçok sıkıcı adım gereklidir. Bu gelişme fikri ilk olarak beş yıl önce, bir bakterinin 3D rekonstrüksiyonunu elde etmek için yüzlerce adımı manuel olarak geçmek zorunda kaldığımızda aklımıza geldi. Önceden, Shigella flexneri mini hücrelerinin hazırlanmasına ilişkin metin protokolüne bakın.

Ardından, elektron mikroskobu ızgaralarını mevcut bir JoVE yayını tarafından açıklandığı ve ayrıca metin protokolünde belgelendiği gibi hazırlayın. EM aşamasını vitrifiye buza gömülü mini hücre koleksiyonuyla yükledikten sonra, eğim serisi için düşük büyütmeli haritaları toplamaya başlayın. Floresan ekranı yaklaşık 2300x gibi düşük büyütme oranlarında görüntülerken, görüntü için kabul edilebilir ızgara kareleri bulun.

Bu konum ince buz içermeli ve ilgilenilen konuyu kirletici madde içermemelidir. Ardından, görünümü ızgara karesinin ortasına ayarlayın ve konumu kaydetmek için Sahne Alanı Konumu Ekle düğmesine tıklayın. Ardından, kabul edilebilir tüm ızgara karelerinin konumları kaydedilene kadar işlemi tekrarlayın.

Bir sonraki adım, yeni bir montaj dosyası açmakla başlar. Kurulum iletişim kutusunda, X ve Y'yi tüm ızgara karesi yakalanacak şekilde ayarlayın. Standart, 200 gözenekli bir ızgara için, sekiz gibi yüksek bir Gruplama değerine sahip 10'a 10'luk bir boşluk yapın.

Ayrıca, görüntüyü kaydırmak yerine hareket aşamasını ve parçaları hizalamak için kullanılan korelasyonları atla seçeneğini değiştirin. Şimdi, Gezgin penceresinde, Edinme düğmesini kullanarak alınacak ilk aşama konumunu seçin. Her aşama konumu için bunu yapmaya devam edin.

Ardından, Gezgin menüsü altında, Puanlarda Edin'e tıklayın. Açılan iletişim kutusunda, harita görüntüsü al ve kaba ötemerkezlilik seçeneklerini açın. Diğer tüm seçeneklerin geçişini kaldırın.

Ardından, devam et'e tıklayın ve her sahne konumu için bir montaj yapılacaktır. SerialEM yazılımıyla çalışmaya devam edin. Navigator'da, alınan haritaları seçin ve Haritayı Yükle'ye tıklayın.

Ardından, Puan Ekle'ye tıklayın ve haritada eğim serisinin edinilmesi gereken noktaları seçin. Seçimleri yaptıktan sonra, Nokta Eklemeyi Durdur'a tıklayın ve toplanan her harita için işlemi tekrarlayın. Ardından, Kamera menüsü altındaki parametreleri açın ve Odak, Deneme ve Kayıt modlarını ayarlayın.

Doz fraksiyonlu verileri kaydetme seçeneği özel bir ilgi alanı olabilir ve bu, Kayıt seçenekleri altında belirtilebilir. Devam etmek için, o anda görüntülenen haritadaki noktalardan birini seçin ve Gezgin penceresinde eğim serisi seçeneğini değiştirin. Açılan iletişim kutusunda, tilt serisi için parametreleri seçin.

Ardından, haritada seçilen noktaların her biri için eğim serisi seçeneğini değiştirme işlemini tekrarlayın. Ardından, Navigator'dan Puanlarda Al seçeneğini başlatın. İletişim kutusunun altında, Ön Görevler, Öğeye yeniden hizala, Otomatik odaklama ve kaba ötemerkezlilik arasında geçiş yapın.

Ardından, eğim serisini almak için Birincil Görev'i ayarlayın ve tüm noktalar toplandığında sütunu kapatmak için sonunda sütun değerlerini kapat'ı seçin. İşlem yürütüldüğünde, her haritada eğim serisi toplama için değiştirilen her noktada bir eğim serisi toplanacaktır. Orijinal tilt serisi, SerialEM'den gelen çıkış günlüğü ve geçerli çalışma dizinindeki tek tek doz parçalı görüntülerin tümü bir terminaldeyken, ışın kaynaklı hareket artefaktını kaldırmak için aşağıdaki komutu yürütün.

Eğim serisini hizalamaya ve yeniden yapılandırmaya devam edin. Terminalde tomoauto komutunu aşağıdaki gibi yazın. Komuta, işlenecek tilt serisinin dosya adını ve ardından nanometre cinsinden referans çapını ekleyin.

CTF işlemesi istenmiyorsa, komutu listeden seçeneği çıkarmanız yeterlidir. Bu komut, tomoauto'nun ana kullanımıdır ve kullanıcıların, başlangıçta manuel kullanıcı müdahalesi gerektiren bir eğim serisini hizalamayla ilgili tüm işlemleri tek bir komutta yürütmesine olanak tanır ve kullanıcıların toplu işlemeyi hızlı bir şekilde komut dosyası haline getirmesine olanak tanır. Şimdi, 3dmod komutunu kullanarak, göze çarpan hatalar için hizalanmış eğim serisine bakın.

Burada dosya adı, eğim serisinin soneksiz adıdır. Ardından, burada gösterilen komutla tahmini CTF'yi inceleyin. Yine, dosya adı, eğim serisinin soneksiz adıdır.

Ayrıca, tomoauto komutu tarafından üretilen çıkış günlüğünde, hizalamanın kalan hatasını kontrol edin. Bu, hizalamanın genel kalitesinin nicel bir ölçüsüdür. Hizalama kabul edilebilirse, yeniden yapılandırmayı hesaplamaya devam edin.

Bu komut, CTF'yi düzeltmek ve hizalamada kullanılan referans işaretleyicileri eğim serisinden silmek için ayarlanmıştır. Görsel incelemeyi atlamak ve doğrudan yeniden yapılandırmaya gitmek için bu komutu kullanın. Tomoauto'nun birçok erişilebilir seçeneği vardır.

Özellikle bir tanesi, tomoauto belgelerine göre, yardımcı bir dosya tarafından açıklanan yerel konfigürasyonları dahil etme yeteneğidir. Tilt serisi dosya adını eklemeden önce yerel yapılandırma seçeneğini kullanarak bu dosyanın adını komut satırı iletişim kutusuna ekleyin. Yerel konfigürasyon dosyaları oluşturma yeteneği, tomoauto'nun en güçlü özelliğidir ve kullanıcıların kullanılan her komutu tam olarak yapılandırmasına, otomatik işlemeyi sürdürürken yürütmeyi belirli veya zor veri kümelerine göre ayarlamasına olanak tanır.

Test protokolü içinde, alt tomogram ortalamasının nasıl yürütüleceğine dair ek talimatlar bulunmaktadır. Açıklanan protokolleri takiben, tomoauto ile iki hizalı eğim serisi yapıldı. İnce hizalama, referans işaretleyici koordinatlarını ideal olarak tanımlayan bir modelden hesaplanır.

50 derecede, bir eğim serisi altın parçacıklarını doğru bir şekilde izledi ve bu da kabul edilebilir bir hizalamayı gösterdi. İkinci eğim serisi söz konusu olduğunda, kırmızı ile gösterilen birkaç model noktası, karşılık gelen altın işaretleyicilerinden sapmış ve modeli gösteren uygun hizalama üretmemiştir. Eğim serileri toplandığında, tomoauto toplanan eğim serilerinin %80 ila %90'ını başarıyla hizalar.

Rekonstrüksiyondan sonra, son tomogram, görüntü örneğinin 3 boyutlu bir hacmidir. Bu daha sonra, numune içindeki moleküler mekanizmanın daha yüksek çözünürlüklü bilgilerini elde etmek için segmentasyon veya alt tomogram ortalaması yoluyla hücresel açıklama için kullanılabilir. EMDB'de biriktirilen ekli Shigella flexneri'nin 2.7 nanometre alt tomogram ortalaması, bu tekniğin, enjeksiyonun tek bir tomogramda görüntülenmesine göre büyük ölçüde iyileştirildiğini göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, SerialEM ve tomoauto kullanarak kriyo-elektron tomografi verilerinin otomatik, yüksek verimli bir şekilde nasıl toplanacağını ve işleneceğini iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse, bir günde yaklaşık 100 eğim serisi toplamak ve bir eğim serisini 20 dakika içinde hizalamak için kullanılabilir. Bu prosedürü denerken, eğim serisi hizalamasının kalitesini her zaman kontrol etmeyi unutmamak önemlidir.

Bir eğim serisi kümesi iyi hizalanmazsa, manuel olarak hizalamayı deneyin ve parametreleri yerel bir konfigürasyona aktarın. Bu prosedürü takiben, makro-moleküler komplekslerin daha yüksek çözünürlüklü yapısını belirlemek gibi ek soruları yanıtlamak için alt tomogram ortalaması gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, kriyo-EM alanındaki araştırmacıların bakteri, virüs ve diğer organizmalardaki yüksek çözünürlüklü in situ yapıları keşfetmelerinin yolunu açtı.