Bir Hipotalamik Hücre Modeli Apoptosisi Belirleyen Bir Kaspaz Çoğullama Testi Kullanımı

Bu videonun genel amacı, kaspaz ile ölçülen apoptozun başlangıcını belirlemek için yüksek çıkışlı bir multipleks testi göstermektir. Üç, yedi. İlk olarak, hipotalamik nöronlar, apoptotik indükleyici doymuş yağ asidi olan palmitik asit ile sorgulanır.

Daha sonra nöronların hücre canlılığı, apoptozun başlangıcını takiben floresan bazlı bir reaktif ve bir mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçülür. Kaspaz üç tarafından parçalanan bir amino asit dizisi olan lumino substratı DEVD, hücrelere eklenir. Prosedürün son adımı, apoptoz geçiren hücrelerde artan kaspaz aktivitesini belirlemek için bir mikroplaka okuyucu kullanarak lüminesansı ölçmektir.

Sonuç olarak, canlı hücreler başına kaspaz aktivitesinin bir oranı beş ila altı saatten daha kısa sürede elde edilebilir. 96 kuyu formatında. Bu tekniğin, western blots veya lizis gibi mevcut yöntemlerimizin ana avantajı, kaspaz üç yedi aktivitesini birden fazla kuyu formatında doğrudan ölçebilen hızlı ve ucuz bir test olmasıdır.

Bu yöntem, apoptozun birincil modülatörlerinin belirlenmesi gibi alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin faydası, bu çoğullamanın sitotoksisite ve canlılığı değerlendirmek için doğru bir yöntem olarak kullanılabilmesidir. Test oldukça basit olmasına rağmen, bu yöntemin görsel bir gösterimi kritiktir çünkü testin başarılı bir şekilde tamamlanmasını sağlayacaktır.

Bu yöntem nörodejenerasyon hakkında fikir verebilse de, diğer hastalıklara ve kanser araştırmalarında kullanılanlar gibi in vitro modellere de uygulanabilir. Bu yönteme yeni olan bireylerin bu tekniği optimize etmesi gerekecektir çünkü uç noktalar hücre hattı ve agoniste bağımlıdır. Kaspaz üç yedi aktivitesi geçicidir.

Bu nedenle, hücre stresörünün etkinliğine bağlı olarak, döküm baz aktivitesini test etmek için uygun zamanlamayı belirlemek, hızlı bir şekilde başlamak için biraz çaba gerektirebilir. 37 santigrat derece su banyosunda 12 hücreyi dondurun. Çözüldükten sonra, hücreleri 75 santimetre karelik havalandırmalı bir kültür şişesine nazikçe sıkın ve 10 mililitre ılık delcos, modifiye kartallar, orta veya DMEM ekleyin, şişeyi gece boyunca 37 santigrat derecede% 5'lik bir karbondioksit inkübatörde inkübe edin.

24 saat sonra, ortamı aspire edin ve taze ortamla değiştirin, hücreleri% 70 ila% 80 arasında olana kadar büyütmeye devam edebilir. Hücreleri saymak için önce DMEM'i ısıtın ve bir x tripsin, 37 santigrat dereceye kadar EDTA çözeltisi. Ortamı şişeden aspire edin ve steril fosfat tamponlu tuzlu su ile iki kez yıkayın.

37 santigrat derecede iki ila beş dakika arasında inkübe etmeden önce 500 mikrolitre tryin solüsyonu ekleyin. Bir kazıyıcı kullanarak hücreleri şişeden ayırın ve hücreleri beş mililitre ortamda askıya alın. Hücreleri bir hücre süzgecinden geçirerek 50 mililitrelik temiz bir tüpe geçirin.

Hücreleri süzgeçten bir kereden fazla geçirmek gerekebilir, ancak bir hemo sitometre tohumu kullanarak hücreleri saydıktan sonra üç defadan fazla tekrarlamayın. 100 mikrolitre ortamın son hacminde 96 kuyu berrak dipli siyah veya beyaz duvarlı bir plakada kuyu başına 6.000 hücre, plakayı 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ve 37 santigrat derecede inkübe edin. Palmitik asidi steril beş mililitrelik bir cam şişeye aktarın ve% 100 DMSO'da çözündürün.

Stok palmitik asit çözeltisini DMSO'da bir ila 10 oranında seyrelttikten sonra, kontrol ortamı için 0.1 milimolar palmitik asitlik bir nihai çalışma konsantrasyonu elde etmek için PREWARM DMEM'e ekleyin, palmitik asit içeren ortama eklenen aynı DMSO konsantrasyonunu ekleyin. Her bir oyuktaki ortamı çıkarın ve 50 mikrolitre orta artı veya eksi tik asit ile değiştirin ve plakayı iki saat boyunca% 5 karbondioksit ve 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra beş mikrolitre reçine reaktifi ekleyin ve inkübasyonu takiben oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin, plakayı çok modlu bir Mikroplaka okuyucusuna yükleyin ve 560 nanometre uyarma dalga boyunda ve 590 nanometre emisyon dalga boyunda floresan kaydedin.

Hücre sorumluluğunu ölçmek için sonuçlar aynı plakaya bağıl floresan birimleri olarak sunulur. 55 mikrolitre DEVD dökme reaktifi ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Yine kaspaz üç yedi aktivitesini ölçmek için Mikroplaka okuyucu kayıt lüminesansı kullanılarak, sonuçlar kaspaz ile doğru orantılı lüminesans birimleri olarak sunulur: kaspaz üç yedi aktivitesini hücre sayısına normalleştirmek için üç yedi, hücre canlılığını kaspaz üç yedi aktivitesine bölün.

Bu protokol, apoptoz ile hücre ölümü mekanizmalarını belirlemek için iki ayrı testin çoğullanmasındaki sonuçları açıklar. Palmitik asit ile mücadele edilen hücrelerde kaspaz aktivitesi önemli ölçüde artmıştır. İki saatlik inkübasyondan sonra, hücre zarı bütünlüğü palmitik asit varlığında gözle görülür şekilde değişir.

Burada gösterilen, palmitik asidin apoptozu indüklediği potansiyel yoldur. Apoptozu indüklemek için kullanılan stres etkeninin altında yatan mekanizmaları anlamak, stres etkeninin kuluçka süresinin uzunluğunu belirlemeye yardımcı olur. Kaspaz enzimlerinin DEVD substratı ile etkileşime girmeden önce aktive edilmesi gerektiğinden, bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde gerçekleştirilirse beş ila altı saatten daha kısa sürede yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, bir in vitro hipotalamik nöronal hücre kültürü modeli kullanarak bir multipleks kaspaz üç yedi aktivite testinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, kuluçka sürelerinin hücre tiplerine ve kullanılan stresörlere veya agonistlere bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu tekniğin geliştirilmesi, sinirbilim alanındaki araştırmacıların apoptotik çalışmalar için güvenilir ve zaman kazandıran bir teknik kullanmalarına olanak tanır Bu prosedürü takiben, dejeneratif hastalıkları başlatan altta yatan mekanizmaları tanımlamak için apoptotik süreç içinde spesifik proteinleri hedef alan ek farmakolojik testler yapılabilir.