Hepatit C Virüsü Çoğaltma Analizi için Protokol

Bu prosedürün genel amacı, Hepatit C virüsü replikasyon döngüsünün çeşitli aşamalarını araştırmaktır. Bu, önce HCV genomik RNA'sı, Doğrusallaştırılmış HCV plazmit yapılarından transkriptler üretilerek gerçekleştirilir. İkinci adım, hücreleri H-C-V-R-N-A ile transfekte etmektir.

Daha sonra, hücreler çeşitli zaman noktaları ve tahliller için kaplanır. Son adım, viral titreyi ölçmek için hücre kültürü süpernatantını toplamak ve protein ve RNA için transfekte edilmiş hücreleri hasat etmektir. Sonuçta ters transkripsiyon, PCR Western blotting immünofloresan testi ve HCV titresi gerçekleştirilir ve sağlam bir HCV enfeksiyöz hücre kültürü sistemi gösterir.

Bu enfeksiyöz hepatit C virüs hücre kültürü sisteminin HCV replikant sisteme göre en büyük avantajı, viral giriş ve çıkış basamaklarının araştırılabilmesidir. Bu protokol, Vion, morfogenez ve bir patojen etkileşimine ev sahipliği yapma gibi hepatit C virolojisi alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, potansiyel aşı adayları olarak değerlendirilebilecek zayıflatılmış viral suşların karakterizasyonuna izin verdiği için aşı geliştirmeye kadar uzanır.

Bu yöntem hepatit C virüsü hakkında bilgi verebilse de, laboratuvar verde ailesindeki diğer RNA virüslerine de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler, yüksek kaliteli HCV genomik RNA çalışması üretme zorluğuyla karşı karşıya kalacaklardır. HCV'nin tam replikasyon döngüsü, iki A HCV Japon fulminan Hepatit bir izolat genotipinin keşfini takiben hücre kültüründe mümkün hale geldi.

Virolojik testin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü test hem moleküler hem de hücresel tekniklerde uzmanlık gerektirecektir İntra genotip iki A kimerik virüsü, F-N-X-H-C-V ve F-N-X-H-C-V kullanarak viral replikasyonun değerlendirilmesi için boş HCV yoklaması. Daha önce üretilen viral plazmitleri, iki mililitrelik bir tüpte XBA bir kısıtlama enzimi ile sindirim yoluyla doğrusallaştırın. Daha sonra künt uçlar oluşturmak için plazmitleri maş fasulyesi nükleazı ile muamele edin.

Sindirilmiş plazmitleri anyon değişim kromatografisi ile saflaştırın. DNA'yı AROS jel elektroforezine tabi tutarak doğrusallaştırılmış plazmitin bütünlüğünü doğrulayın. Daha sonra, doğrusallaştırılmış plazmit DNA şablonunu, HCV genomik RNA transkriptlerini sentezlemek için T yedi RNA polimeraz reaksiyon bileşenleri içeren 0.2 mililitrelik bir tüpe ekleyin.

Yeni sentezlenen DNA'ları bir RNA saflaştırma kiti kullanarak muamele edilmiş RNA'yı saflaştırın. Ardından Agros jel elektroforezi ile RNA üretimini doğrulayın. Bunu takiben, RNA'yı spektral fotometri ile ölçün.

Tripsin enzim tedavisi kullanarak HU yedi bazlı yapışkan hücreleri ayırın ve hücreleri 50 mililitrelik bir konik halinde toplayın. Santrifüj resüsünü takiben iki. Hücre peletini soğuk düşük serum ortamı ile askıya alın Santrifüjlemeyi tekrarladıktan sonra, hücreleri düşük serum ortamındaki hücreleri mililitre başına 10 ila yedi hücre arasında bir kez yeniden süspanse edin.

Daha sonra, toplam 10 mikrogram kopyalanmış viral RNA'yı 400 mikrolitre yeniden süspanse hücre ile önceden soğutulmuş 0.4 santimetrelik bir elektroporasyon veterinerine karıştırın ve viral RNA'yı 270 volt, 100 ohm ve 950 mikro ferrde bir elektroporasyon kullanarak hücrelere iletin. Bittiğinde, elektroporasyonlu hücreleri 10 mililitre tam büyüme ortamında %15 FBS ile yeniden süspanse edin, bu noktada hücreleri her iki T 25 şişesinde yaklaşık 1.2 kez 10 ila altı hücre ve 48 kuyucuklu plakalarda bir kez 10 ila dördüncü hücreler için 4, 48 ve 96 saatlik zaman noktaları için. Kültürlenmiş şişelerden ve plakalardan ölü hücre kalıntılarını çıkarmak için ortamı, transfeksiyondan dört ila sekiz saat sonra% 10 FBS ile taze takviye edilmiş büyüme ortamı ile değiştirin.

Serolojik bir pipet kullanarak, hücre kültürü süpernatantlarını 48 N 96 saatlik zaman noktalarında 15 mililitrelik konik bir tüpe hasat edin. Daha sonra, santrifüjlemeyi takiben dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 15.000 RPM'de santrifüjleme yoluyla toplanan numunelerden hücresel kalıntıları çıkarın. Hücresiz süpernatanları eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Belirtilen zaman noktalarında western blot ve ters transkripsiyon kantitatif PCR veya R-T-Q-P-C-R ile protein ve RNA analizi için hücreleri lyce. Ters transkriptaz enzimi ve 0.2 mililitrelik bir tüpte beş asal çevrilmemiş bölgeye bağlanan HCV duyu ipliği için spesifik bir primer kullanarak toplam hücresel RNA'nın bir mikrogramını ters transkribe edin. Ayrıca, gerçek zamanlı bir PCR sistemi kullanarak bir HCV algılama iplikçik primeri kullanarak bilinen genom kopyalarının F-N-X-X-H-C-V-R-N-A'sını ters çevirin.

Spesifik HCV primerleri ve QPCR süper karışımı içeren DNA bağlayıcı yeşil boya kullanarak elde edilen kopyalanmış CD NA'nın 50 nanogramını kullanarak QPCR'yi gerçekleştirin. QPCR'yi takip eden H-C-V-R-N-A kopya numarasını belirlemek için QPCR'yi çalıştırırken aşağıdaki koşulları kullanın. 96 saatte transfekte edilen viral RNA'dan hücre lizatını çözün.

SDS sayfasını kullanarak transfeksiyon sonrası. Daha sonra jel içindeki çözülmüş proteinleri trans plot turbo yöntemi ile bir poli asma di florür membranına aktarın. PBS'de %5 yağsız süt ve %0,2 ara 20 içeren bir bloke edici solüsyon kullanarak membranı bloke edin ve bir kaba koyun.

Membranı, dört santigrat derece soğuk odada 1000'de bir seyreltmede birincil fare monoklonal antikoru ve S3 ve 5.000'de bir seyreltmede beta aktin ile inkübe edin. İnkübasyondan sonra, 5.000'de bir seyreltmede at turpu peroksidaz ile konjuge keçi anti fare immünoglobulin G ekleyin ve kemilüminesans ile tespit edin. Bu noktada, immünofloresan testi için negatif 20 santigrat derecede 30 dakika boyunca metanol kullanarak H-C-V-R-N-A transfekte edilmiş hücreleri sabitleyin.

Bittiğinde, hücreleri PB S3 ile yıkayın, immünofloresan tahlil bloke edici tampon ile bloke ettikten sonra, tavşan poliklonal anti NS beş, bir birincil antikor ve fare monoklonal anti DS RNA antikoru J iki, bir ila 200 seyreltmede kullanın ve dört santigrat derece soğuk odada beş saat ila gece boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, birincil antikordan sonra hücreleri PB S3 ile yıkayın. Daha sonra keçi anti tavşan immünoglobulini G 4 8 8 poliklonal ikincil antikoru ve keçi anti ilham perisi immünoglobulin 5 9 4 poliklonal ikincil antikoru 1000'de bir seyreltmede ekleyin ve bir masa üstü külbütör üzerinde oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Hücreleri PB S3 ile yıkadıktan sonra, çekirdekleri herx kalıbı kullanarak boyayın ve bir floresan mikroskobu kullanarak görüntüleyin. Sonraki plaka naif renk tonu, 7.5 0.1 hücre yaklaşık üç kez 10 ila üçüncü hücreler. Ertesi gün 96 oyuklu bir plaka kullanarak, büyüme ortamı kullanılarak H-C-V-R-N-A transfekte edilmiş hücrelerden hasat edilen hücre içermeyen kültür süpernatantının on kat seri seyreltmesini gerçekleştirin ve renk tonu üzerine üç kopya halinde aşılayın.

7.5 0.1 hücreler Hücreleri dondurucudan çıkardıktan sonra negatif 20 santigrat derecede 30 dakika boyunca metanol kullanarak enfeksiyondan 72 saat sonra hücreleri sabitleyin, bir floresan mikroskobu kullanarak daha önce açıklanan koşulları kullanarak H-C-V-N-S beş A proteini için amino leke. NS beşini, en yüksek viral seyreltmeye sahip kuyudaki pozitif hücre odaklarını sayın ve mililitre başına ortalama odak oluşturan birim sayısını hesaplayın. Doğrusallaştırılmış HCV plazmit kalitesi jel elektroforezi ile değerlendirildi.

H-C-V-D-N-A, 9.6 Kilobazda tek bir RNA ürünü veren in vitro transkripsiyon aracılı T yedi RNA polimeraza tabi tutuldu. R-T-Q-P-C-R Sonuçlar, vahşi tip virüsün genomu verimli bir şekilde kopyaladığını gösterdi. Vahşi tip, poll null virüsüne kıyasla bir ila üç log daha yüksek düzeyde genom replikasyonu sergiledi.

Yabani tip virüs, viral protein bölünmesi ve genom replikasyonunda yer alan NS üç proteinini üretti. Yabani tip virüs ayrıca NS beşi bir proteini ve NS beşi bir protein ve vahşi tip transfekte edilmiş hücrelerin hücresel sitoplazmasında lokalize edilmiş çift sarmallı RNA ko'sunu eksprese etti, bu da aktif viral replikasyon virüsü titresi ölçümlerinin vahşi tip virüsün bulaşıcı olduğunu ve transfeksiyondan altı saat sonra mililitre enfeksiyöz parçacık başına 10.000'den fazla odak oluşturan birim ürettiğini gösterdi. Hem vahşi tip hem de kutup boş virüsler, benzer bir transfekte giriş seviyesini gösteren benzer lusiferaz aktivitelerine sahipti.

Bununla birlikte, RNA, transfeksiyondan 48 saat ve 96 saat sonra çevrildi. Yabani tip virüs, poll null virüsüne kıyasla artmış genom replikasyon seviyeleri sergiledi. Yabani tip virüs ayrıca viral NS üç proteini üretti.

Poll null virüsü, temel seviye lusiferaz aktivitesine sahipken, vahşi tip virüs, poll null reporter virüsüne kıyasla iki ila üç günlük daha yüksek replikasyon seviyesine sahipti. Bir kez ustalaştıktan sonra, Hepatit TC virolojik tahlilleri, uygun şekilde yapılırsa iki hafta içinde yapılabilir Bu prosedürü denerken, sağlam hücrelere ve yüksek kaliteli HCV genomik RNA transkriptlerine sahip olmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, HCV suşlarının karakterizasyonu, in vivo uygunluk ve konakçı patojen etkileşimlerini araştırmak için hayvan model sistemlerinde test edilebilir.

Enfeksiyöz bir HCV hücre kültürü sisteminin geliştirilmesi, araştırmacıların HCV replikasyon döngüsünün virion, morfogenez ve viral çıkış adımlarını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, Hepatit C virüsü replikasyon döngüsünün farklı aşamalarını karakterize etmek için çeşitli virolojik tahlillerin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Hepatit C virüsü ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman giymek gibi güvenlik önlemlerinin alınması gerektiğini unutmayın.