Hepatit C Virüsü Çoğaltma Analizi için Protokol

Bu prosedürün genel amacı, Hepatit C virüsü replikasyon döngüsünün çeşitli aşamalarını incelemektir. Bu işlem, öncelikle doğrusallaştırılmış HCV plazmit yapılandırmalarından HCV genomik RNA transkriptlerinin üretilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, hücrelerin H-C-V-R-N-A ile transfekte edilmesidir. Ardından, hücreler çeşitli zaman noktaları ve analizler için plakalara ekilir. Son adım, viral titreyi ölçmek için hücre kültürü süpernatantının toplanması ve protein ile RNA analizi için transfekte edilmiş hücrelerin hasat edilmesidir. Son olarak ters transkripsiyon-PCR, Western blotting, immünofloresan analiz ve HCV titresi uygulanarak güçlü bir HCV enfeksiyöz hücre kültürü sistemi ortaya konur.

Bu enfeksiyöz hepatit C virüsü hücre kültürü sisteminin HCV replikon sistemine göre temel avantajı; viral giriş, virion birleşimi ve çıkış basamaklarının incelenebilmesidir. Bu protokol, virion morfojenezi ve konak-patojen etkileşimi gibi hepatit C virolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, potansiyel aşı adayları olarak değerlendirilebilen atenüe viral suşların karakterizasyonuna olanak tanıması nedeniyle aşı geliştirmeye kadar uzanmaktadır.

Bu yöntem hepatit C virüsü hakkında bilgi sağlayabilse de, Flaviviridae ailesindeki diğer RNA virüsleri için de uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemi ilk kez kullanan kişiler, yüksek kaliteli HCV genomik RNA üretme zorluğuyla karşılaşacaklardır. Genotip-2A HCV Japon fulminan hepatit bir izolatının keşfinin ardından, hücre kültüründe HCV'nin tüm replikasyon döngüsünün incelenmesi mümkün hale gelmiştir. Virolojik analizin görsel olarak gösterilmesi kritiktir çünkü bu analiz, hem moleküler hem de hücresel teknikler konusunda uzmanlık gerektirmektedir.

Viral replikasyonun değerlendirilmesi için bir intra-genotip 2A kimerik virüs, F-N-X-H-C-V ve pol-null HCV kullanılarak, önceden oluşturulmuş viral plazmitleri iki mililitrelik bir tüpte XBA-one restriksiyon enzimi ile sindirerek lineerize edin. Ardından, küt uçlar oluşturmak için plazmitleri mung fasulyesi nükleazı ile işleme tabi tutun.

Sindirilen plazmidleri anyon değişim kromatografisi ile saflaştırın. Lineerize edilmiş plazmidin bütünlüğünü, DNA'yı agaroz jel elektroforezine tabi tutarak doğrulayın. Ardından, HCV genomik RNA transkriptlerini sentezlemek için, lineerize edilmiş plazmid DNA kalıbını T-seven RNA polimeraz reaksiyon bileşenlerini içeren 0,2 mililitrelik bir tüpe ekleyin.

Yeni sentezlenen DNaz işlem görmüş RNA'yı bir RNA saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın. Ardından RNA üretimini agaroz jel elektroforezi ile doğrulayın. Bunu takiben, RNA miktarını spektrofotometri ile belirleyin.

Trypsin enzim uygulamasıyla Huh-7 tabanlı aderent hücreleri ayırın ve hücreleri 50 mililitrelik konik tüpe toplayın. Ardından iki kez santrifüjleme yaparak hücre peletini soğuk düşük serumlu besiyeri ile yeniden süspande edin. Santrifüjleme işlemini tekrarladıktan sonra, hücreleri düşük serumlu besiyeri içerisinde mililitrede 1 × 10⁷ hücre olacak şekilde yeniden süspande edin.

Ardından, toplam 10 µg transkribe edilmiş viral RNA'yı, 400 µL resüspande edilmiş hücre ile birlikte önceden soğutulmuş 0.4 cm'lik bir elektroporasyon küvetinde karıştırın. Viral RNA'yı, 270 V, 100 Ω ve 950 µF değerlerinde elektroporasyon kullanarak hücrelere aktarın. İşlem tamamlandığında, elektropore edilmiş hücreleri %15 FBS içeren 10 mL komplet büyüme ortamında resüspande edin. Bu aşamada, hücreleri 4, 48 ve 96 saatlik zaman noktaları için, her bir flask başına yaklaşık 1.2 × 10⁶ hücre olacak şekilde T 25 flasklarına ve her bir kuyucuğa 1 × 10⁴ hücre olacak şekilde 48 kuyucuklu plakalara ekimleyin. Kültür flasklarındaki ve plakalarındaki ölü hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için, transfeksiyondan 4 ila 8 saat sonra ortamı %10 FBS içeren taze takviyeli büyüme ortamı ile değiştirin.

Serolojik bir pipet kullanarak 48 ve 96 saatlik zaman noktalarında hücre kültürü süpernatanlarını 15 mililitrelik konik bir tüpe toplayın. Ardından, toplanan örneklerdeki hücresel kalıntıları, 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca 15.000 rpm hızda santrifüj ederek uzaklaştırın. Santrifüj işleminin ardından, hücre içermeyen süpernatanları negatif 80 santigrat derecede saklayın.

Belirtilen zaman noktalarında, western blot ve ters transkriptaz kantitatif PCR veya RT-qPCR ile protein ve RNA analizi yapmak için hücreleri lize edin. 0,2 mililitrelik bir tüp içerisinde, ters transkriptaz enzimi ve HCV sense strand'inin beş prime çevrilmeyen bölgesine bağlanan spesifik bir primer kullanarak bir mikrogram toplam hücresel RNA'yı ters transkribe edin. Ayrıca, HCV sense strand primeri kullanarak bilinen genom kopya sayısına sahip F-N-X-H-C-V-R-N-A'yı ters transkribe edin. Bir gerçek zamanlı PCR sistemi kullanarak, spesifik HCV primerleri ve DNA bağlayıcı yeşil boya içeren qPCR süper karışımı ile elde edilen transkribe cDNA'nın 50 nanogramını kullanarak qPCR gerçekleştirin. H-C-V-R-N-A kopya sayısını belirlemek için qPCR çalıştırırken aşağıdaki koşulları uygulayın. qPCR'ın ardından, transfeksiyondan 96 saat sonra viral RNA transfekte edilmiş hücre lizatını SDS page ile ayrıştırın. Ardından, jeldeki ayrıştırılmış proteinleri trans-blot turbo yöntemiyle bir poliviniliden diflorür membrana aktarın. Membranı, PBS içerisinde %5 yağsız süt ve %0,2 tween-20 içeren bir bloklama çözeltisi kullanarak bloklayın ve bir kaba yerleştirin.

Membranı, 4 °C'lik soğuk odada, 1/1000 dilüsyonundaki primer fare monoklonal antikor NS3 ve 1/5000 dilüsyonundaki beta-actin ile inkübe edin. İnkübasyon sonrası, 1/5000 dilüsyonundaki horseradish peroksidaz ile konjuge keçi anti-fare immünoglobulin-G ekleyin ve kemilüminesans ile tespit edin.

Bu aşamada, immunofloresan analiz için H-C-V-R-N-A transfekte edilmiş hücreleri -20 °C'de 30 dakika boyunca metanol kullanarak sabitleyin. İşlem tamamlandığında, hücreleri üç kez PBS ile yıkayın. Immunofloresan analiz bloklama tamponu ile bloklama yaptıktan sonra, tavşan poliklonal anti-NS5A primer antikoru ve fare monoklonal anti-DSRNA J2 antikoru'nu 1/200 dilüsyonda uygulayın ve 4 °C soğuk odada beş saatten gece boyuna kadar inkübe edin. İnkübasyonun ardından, primer antikordan sonra hücreleri üç kez PBS ile yıkayın. Daha sonra, keçi anti-tavşan immünoglobulin-G 488 poliklonal sekonder antikoru ve keçi anti-fare immünoglobulin 594 poliklonal sekonder antikoru'nu 1/1000 dilüsyonda ekleyin ve oda sıcaklığında, bir masaüstü sallayıcı üzerinde bir saat boyunca inkübe edin. Hücreleri üç kez PBS ile yıkadıktan sonra, çekirdekleri Hoechst boyası ile boyayın ve floresan mikroskobu altında inceleyin.

Bir sonraki aşamada, 96 kuyucuklu bir plaka kullanarak her kuyucuğa yaklaşık 3 × 10³ hücre gelecek şekilde naif Huh7.5.1 hücreleri ekin. Ertesi gün, HCV RNA transfekte edilmiş hücrelerden elde edilen hücre içermeyen kültür süpernatantının büyüme besiyeri ile on katlı seri dilüsyonunu gerçekleştirin ve Huh7.5.1 hücrelerine üç tekrar şeklinde inoküle edin. Enfeksiyondan 72 saat sonra hücreleri, -20 °C'de 30 dakika boyunca metanol kullanarak fikse edin. Hücreleri dondurucudan çıkardıktan sonra, daha önce açıklanan koşulları kullanarak HCV NS5A proteini için immün boyama yapın. Floresan mikroskop kullanarak, en yüksek viral dilüsyona sahip kuyucuktaki NS5A pozitif hücre odaklarını sayın ve mililitre başına ortalama odak oluşturucu birim sayısını hesaplayın.

Lineerleştirilmiş HCV plazmid kalitesi jel elektroforezi ile değerlendirildi. HCV DNA'sı, 9,6 Kilobase boyutunda tek bir RNA ürünü veren T-seven RNA polimeraz aracılı in vitro transkripsiyona tabi tutuldu. RT-qPCR sonuçları, yabanı tip virüsün genomu verimli bir şekilde replike ettiğini gösterdi. Yabanı tip, pol-null virüse kıyasla bir ila üç log daha yüksek düzeyde genom replikasyonu sergiledi.

Yabani tip virüs, viral protein kesimi ve genom replikasyonunda yer alan NS3 proteinini üretmiştir. Yabani tip virüs ayrıca NS5A proteinini eksprese etmiş olup, NS5A proteini ve çift sarmallı RNA, yabani tip transfekte hücrelerin hücresel sitoplazmasında ko-lokalize olmuştur; bu durum aktif viral replikasyonu göstermektedir. Virüs titresi ölçümleri, yabani tip virüsün enfektif olduğunu ve enfektif partikül başına mililitre başına 10.000'den fazla odak oluşturucu birim ürettiğini göstermiştir. Transfeksiyondan sonraki altıncı saatte, hem yabani tip hem de pol-null virüsler benzer lusiferaz aktiviteleri göstermiş, bu da transfekte edilen RNA'nın benzer bir giriş seviyesinde transle edildiğini belirtmiştir. Ancak, transfeksiyondan sonraki 48. ve 96. saatlerde yabani tip virüs, pol-null virüse kıyasla artmış genom replikasyon seviyeleri sergilemiştir. Yabani tip virüs ayrıca viral NS3 proteini üretmiştir. Pol-null virüs bazal seviyede lusiferaz aktivitesine sahipken, yabani tip virüs, pol-null raporlayıcı virüse kıyasla iki ila üç log daha yüksek replikasyon seviyesine sahipti. Uzmanlaşıldığında, Hepatit-C virolojik analizleri uygun şekilde yürütüldüğü takdirde iki hafta içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, sağlıklı hücrelere ve yüksek kaliteli HCV genomik RNA transkriptlerine sahip olmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, karakterize edilmiş HCV suşları, in vivo uygunluğu ve konakçı-patojen etkileşimlerini araştırmak amacıyla hayvan model sistemlerinde test edilebilir.

Enfektöz bir HCV hücre kültürü sisteminin geliştirilmesi, araştırmacıların HCV replikasyon döngüsünün virion morfogenezi ve viral çıkış basamaklarını incelemelerine olanak sağlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, Hepatit C virüsü replikasyon döngüsünün farklı aşamalarını karakterize etmek için çeşitli virolojik analizlerin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Hepatit C virüsü ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanımı gibi güvenlik önlemlerinin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.