Name: Hepatit C Virüsü Çoğaltma Analizi için Protokol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Öğrenin, Hepatit C virüsü replikasyon döngüsünü incelemek için HCV genomik RNA üretimi ve hücre transfeksiyonu yöntemlerini. Bu protokol, viroloji ve bulaşıcı hastalıklar alanında yeni tedavi stratejileri geliştirmeye katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Huh-7.5.1 hücre hattını sağladığı için F. Chisari'ye teşekkür ederiz. Makaleyi düzenlediği için Justine Ho'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma, Cedars-Sinai Tıp Merkezi Kurumsal Programatik Araştırma Ödülü ve Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi, V.A.'ya UL1TR000124 tarafından desteklenmiştir.

Protokolün genel hatları Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. 1.. Hücreler <ol><li> 10-15% fetal sığır serumu (FBS), 10 mM esansiyel olmayan amino asitler, 10 mM Hepes, penisilin (100 birim / ml), streptomisin (100 mg / ml) ve 2 mM L-glutamin içeren tam büyüme ortamı hazırlayın. </li><li> Hepatit C viral replikasyon döngüsünün in vitro analizi için, yukarıdaki takviyeleri ihtiva eden tam bir büyüme ortamı içinde Huh-7.5.1 hücreleri 13 koruyun. </li><li> % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de belirtilen desteklenmiş büyüme ortamı ile Huh-7.5.1 hücrelerinde kültür viral suşları. </li></ol> 2.. Virüs ve Plasmid yapılar <ol><li> HCV RNA&#39;nın tamamlayıcı DNA (cDNA) formunu oluşturmak ve genetik manipülasyon kolaylığı için bir plazmid vektörü içine klonlamak. Not: Japon fulminant hepatit 1 keşfi, JFH-1 (genotip 2a HCV), HCV araştırma için kritik olan ve olduğunu sahiptir izolatöncelikle HCV çoğaltma döngüsü 11-13 incelemek için kullanılır. JFH-1 HCV göre arası ve intragenotypic kimerik virüsler genellikle 14-18 araştırma kullanılır. Sentetik intragenotype 2a kimerik virüs, FNX-HCV, ve bir monosistronik kimerik muhabir gerginlik İnşaat önceden 19 ve yapı detayları bu protokol kapsamı dışındadır tarif edilmiştir. </li><li> O (nükleotidler 1-2878) J6CF ana suş (NCBI erişim no. AF177036), yanı bir 5&#39;NTR, yapısal bölgeleri ve P7, NS2 ve yapısal olmayan bölgelerin bir parçası içerdiği pFNX-HCV intragenotype 2a virüsü kullanarak de JFH-1 virüs suşu (NCBI erişim no. AB047639) &#39;in yapısal olmayan bileşenler olarak. Not: FNX-HCV Jc1 intragenotype 2a kimerik HCV&#39;nin sekansına göre sentezlendi önce 15 bildirdi. </li><li> Bir R takarak (adım 2.2 yukarıda) pFNX-HCV gerginlik dayalı bir monosistronik kimerik muhabir viral yapıyı, pFNX-Rluc, üret5 &#39;ve NTR (nt 388 ve 389 arasında) Çekirdek geni arasındaki enilla lusiferaz gen. Daha sonra, bölünme sinyali olarak çalışacak bir ayak ve ağız hastalığı virüsü 2A (F2A) peptid dizisi kullanılarak lusiferaz geni ve bu yapının çekirdek gen bağlayın. </li><li> PFNX-HCV veya pFNX-Rluc viral bir arka plan kullanarak RNA polimeraz null (Pol-) viral yapı mühendisi. , AAG amino asit tortuları ile, bu viral omurgaların birinin, NS5B polimeraz katalitik kalıntıları, GDD (nt 8615-8623 aa 2759-2761) değiştirin. </li></ol> 3.. In Vitro HCV RNA transkripsiyon <ol><li> Bir intragenotype 2a kimerik virüs FNX-HCV ve HCV-FNX Pol, null viral replikasyon (Şekil 2A) değerlendirilmesi için (Pol-) HCV kullanın. </li><li> Xbal kısıtlama enzimi ile linearize plazmid, viral ve sonra kör uçlar elde etmek için mung fasulye nükleaz ile muamele. Anyon değişim kromatografisi ile sindirilmiş plazmid arındırın. O bütünlüğünü doğrulayınf jel elektroforezi (Şekil 2B) agaroz DNA tabi tutulması ile doğrusallaştırılmış plasmid. </li><li> T7-RNA polimerazı kullanılarak doğrusallaştırılmış viral plazmid uyarlamak. </li><li> Bir RNA saflaştırma kiti kullanılarak yeni sentezlenmiş DNase ile muamele edilmiş RNA arındırın. </li><li> , Agaroz jel elektroforezi (Şekil 2C) ile RNA üretimini kontrol edin. </li><li> Spektrofotometresi ile RNA niceliğini. </li><li> 10 ug çalışma alikotlar içinde -80 ° C &#39;de üretilen RNA saklayın. Not: Aynı anda her viral numune ve kontrol için tüm RNA transkripsiyonu ile her bir deney tasarımı içinde RNA kalitesi varyasyonu en aza indirmek için. </li></ol> 4. HCV RNA Transfeksiyonu ve Örnek Toplama <ol><li> Tripsin kullanılarak Huh-7.5.1 hücreler hasat. </li><li> Hücreler, santrifüj yıkayın ve soğuk düşük serum ortamı ile iki kez süspansiyon tekrar süspansiyon. Ml başına 1 x 10 7 hücre düşük serum medya hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> 10 &amp; # toplam Mix956, bir 0,4 cm&#39;lik bir elektroporasyon küveti içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler (4 x 10 6 hücre) 400 ul ile transkribe viral RNA g. , 270 V de elektroporasyon ile 100 Ω ve 950 uF hücreleri transfekte. </li><li> % 15 FBS, 10 ml tam büyüme ortamı içinde elektroporasyona hücrelerin yeniden süspanse edin. Not: Huh-7.5.1 hücreleri% 15 Fetal Bovine Serumu kültürlendiğinde Elektroporasyona tabi tutulan hücrelerin artan hayatta kalma görülmektedir. </li><li> 4, 48 ve 96 saat: her ikisi de T-25 şişelerinde (kap basma 1.2 x 10 ~ 6 hücreleri) ve 48 kuyucuklu plaklar içinde, aşağıdaki zaman noktalarında her biri için (oyuk başına 1 x 10 4 hücreleri) hücrelerin Plate. </li><li> Kültür şişelerinden ve levhalardan ölü hücre kalıntılarını uzaklaştırmak üzere,% 10 FBS katkılı taze büyüme ortamı ile 4-8 saat post-transfeksiyon ile Ortamı değiştirin. </li><li> 48, 96 saat zaman noktalarında, ve 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1500 rpm&#39;de santrifüj ile hücreler toplandı örnekleri hücre tortularını çıkarmak hücre kültürü süpernatanları hasat º C </li><li> -80 ° C de hücresiz süpernatantlar Mağaza Lyse Western blot ile protein ve RNA analizi için ve belirtilen zaman noktalarında transkripsiyon-nicel PCR ters hücreleri. </li></ol> 5.. HCV genom kopyalarının değerlendirilmesi için Transkripsiyon-kantitatif PCR (RT-qPCR) Ters <ol><li> HCV genomik RNA kopya sayısını belirlemek için iki adımlı bir RT-qPCR gerçekleştirin. </li><li> Ters uyarlamak 1 ters transkriptaz ve 5&#39;NTR (JFH RTQ R: 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3 &#39;) bağlanan HCV duyu şeridi için spesifik bir primer kullanılarak toplam hücresel RNA ug veya temizlik gen Peptidilprolil izomeraz G (PPIG R, için özel bir primer : 5&#39;-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 &#39;). Ayrıca, HCV sense iplik primeri kullanılarak bilinen genom kopyalarının (10 1 9 standart 10) (Kademe 3 de üretilen) FNX-HCV RNA nın ters transkripsiyonunu. </li><li> (JFH RT spesifik HCV primerler kullanılarak elde edilen transkripsiyonu cDNA 50 ng kullanılarak qPCR yürütmekQF: 5&#39;CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3 &#39;) ve DNA qPCR süper karışımını içeren yeşil boya bağlayıcı. Hem de temizlik gen PPIG için qPCR yapın (primerler PPIG F: 5&#39;-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 &#39;; PPIG R: 5&#39;-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3&#39;) Not: örnekleri arasında, doğru hücre HCV RNA seviyesini hesaplamak için, cep temizlik geni PPIG kullanımı , normalleşme için ekspresyon seviyesi (Ct çevrimi). Kopya sayısının saptanması için standart olarak FNX-HCV genomunun kopya numarasını kullanın. </li><li> 15 saniye için 95 ° C ve 60: qPCR çalışan HCV RNA kopya sayısını belirlemek için, aşağıdaki koşulları kullanarak &#160; Gerçek zamanlı PCR sistemi kullanılarak 30 saniye (40 devir) için C numara yerine. </li><li> Genom replikasyonu için sonuçları Şekiller 3A ve 3B bakınız. </li></ol> 6.. Western Blot Analizi HCV Protein İfadesi (Şekil 3C) algılama için <ol><li> Hücre lizatları, fr kullanınom viral RNA protein, western blot analizi için 96 saat sonrası transfeksiyon transfekte. </li><li> SDS-PAGE ve poliviniliden difluorür (PVDF) membran transfer kullanılarak hücre lizatı giderin. </li><li> % 5 kaymağı alınmış süt, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde% 0.2 Tween 20 ihtiva eden bir blokaj çözeltisi kullanılarak membran bloke eder. </li><li> Primer fare monoklonal antikoru NS3 ile membran (1 1000 sulandırma) ve beta-aktin (1 5000 sulandırma) inkübe edin. </li><li> Turp peroksidaz (1 5000 sulandırma) konjuge keçi anti-fare IgG&#39;si ilave edin ve kimyasal-ışıma ile tespit. </li></ol> 7. İmmünofloresan Deneyi (IFA) <ol><li> Imüno-flüoresan deneyi için -20 ° C&#39;de 30 dakika boyunca metanol kullanılarak HCV-enfekte edilmiş ve transfekte hücreler düzeltildi. </li><li> PBS ile üç kez yıkanır ve hücre IFA bloklama tamponu ile bloklayın. </li><li> Tavşan poliklonal veya fare monoklonal anti-DSR (lütfen Dr Dasgupta&#39;yı, UCLA tarafından sağlanan), anti-NS5A öncelikle antikor kullanınNA antikoru 1:200 (1 ug / ml) içinde bir seyreltmede J2 ve 5 saat için bir gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin º C </li><li> Üç kez birincil antikor ardından hücrelerin PBS ile yıkayın. </li><li> • Keçi anti-tavşan IgG-488, poliklonal antikor veya ikincil bir 1:1000 seyreltmesi (1 ug / ml) keçi anti-fare IgG-594 poliklonal ikincil antikor ilave edin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> PBS floresan mikroskop (Şekil 3D) kullanarak Hoechst boyası ve görünümü kullanarak üç kez ve leke çekirdekler hücreleri yıkayın. </li></ol> 8. Ölçüm Virüs titresi <ol><li> Levha naif Huh-7.5.1 hücreler yaklaşık 3 x 10 3 hücre / oyuk, 96 oyuklu bir plaka kullanılmıştır. Ertesi gün, büyüme ortamı kullanılarak HCV RNA transfekte edilmiş hücrelerin hasat hücresiz kültür yüzer 10-kat seri dilüsyonları gerçekleştirmek ve Huh-7.5.1 hücreler üzerine, üç kopya halinde inoküle. </li><li> -20 ° C&#39;de 30 dakika boyunca metanol (kullanarak 72 saat sonrası enfeksiyon hücreleri saptamak </suC) ve Bölüm 7&#39;de belirtildiği gibi, HCV NS5A proteini için immunostain ° p&gt;. </li><li> NS5A pozitif odak saymak ve mililitre başına odak noktası oluşturan birimin ortalama sayısı (FFU) hesaplamak için yüksek seyreltme kullanın. HCV titresi için Şekil 4&#39;e bakınız. </li></ol> Viral genom replikasyonu ve enjeksiyon için 9. Renilla Lusıferaz Muhabir Deney <ol><li> Viral genomun replikasyonu, 48 oyuklu plakalarda üç kere levha HCV RNA-elektroporate Huh-7.5.1 hücreleri (1 x 10 4 hücre / çukur) değerlendirilmesi için. </li><li> Lyse 6 saat sonra pasif lizis tamponu 75 ul, 48 saat ve 96 saat post-transfeksiyon ile hücreler. </li><li> -80 ° C, oda sıcaklığı ve mağazada, 15 dakika boyunca yavaşça plakaları sallayın </li><li> , Renilla lusiferaz enzim aktivitesinin ölçülmesi, oda sıcaklığına kadar protein lisat ve Renilla lusiferaz deney reaktif çözülme için. </li><li> , 96 wel oyuk başına protein lizat 20 ul ekle<html> l beyaz ışıldama plakası ve bir luminometre içerisinde plaka yerleştirilir. </li><li> Renilla lusiferaz analiz ayıraçı (coelenterazine + alt-tabaka tamponu) ile kaplanır ve 2 saniye ön okunan bir süre sonra, 100 ul koyun; 10 saniye boyunca yayılan ışık entegre. </li><li> Biyolojik üçlü lusiferaz değerleri her bir numune için ortalama ve standart sapmayı hesaplayın ve istatistik analiz için verileri (Şekil 5) tabi tutulması. </li><li> Enfeksiyon değerlendirmek için, 48-çukurlu plakalarda naif Huh-7.5.1 hücreler üzerine üç kopya olarak belirtilen zaman noktalarında (48 saat ve 96 saat) için HCV RNA-transfekte edilmiş hücrelerden elde edilen hücre içermeyen yüzer 500 ul inokülasyon. </li><li> De sonra 6 saat sonrası enfeksiyon başına taze orta 500 ul ile viral aşının değiştirin. </li><li> Lyse 8,2-8,7 (Şekil 5) adımda tarif edildiği gibi Renilla lusiferaz deneyi için 48 saat post-enfeksiyon ve konuya hücreler. </li></ol>itle &quot;&gt; 10. İstatistiksel Analiz <ol><li> Grafiklerde hata çubukları standart sapmalar (SD) gösterir. P değerleri, eşleştirilmemiş t testi ile hesaplanmıştır. </li></ol>

<ol><li>Alter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J.+Epidemiology+of+hepatitis+C%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology.%22%5BJournal%5D)">J. Epidemiology of hepatitis C.</a> Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).</li>
<li>Alter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J.+Epidemiology+of+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">J. Epidemiology of hepatitis C virus infection.</a> World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).</li>
<li>Lavanchy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+hepatitis+C%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">The global burden of hepatitis C.</a> Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).</li>
<li>Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLindenbach%2C+BD+%22Flaviviridae%3A+viruses+and+their+replication+in+Fields+Virology%22">Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology</a>. , Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).</li>
<li>Ciesek, S., Manns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+in+2010%3A+the+dawn+of+a+new+era+in+HCV+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).</li>
<li>Ghany, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+treatment+of+genotype+1+chronic+hepatitis+C+virus+infection%3A+2011+practice+guideline+by+the+American+Association+for+the+Study+of+Liver+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases.</a> Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).</li>
<li>Choo, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+cDNA+clone+derived+from+a+blood-borne+non-A%2C+non-B+viral+hepatitis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome.</a> Science. 244 (4902), 359-362 (1989).</li>
<li>Kolykhalov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+hepatitis+C+by+intrahepatic+inoculation+with+transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA.</a> Science. 277 (5325), 570-574 (1997).</li>
<li>Lohmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+subgenomic+hepatitis+C+virus+RNAs+in+a+hepatoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line.</a> Science. 285 (5424), 110-113 (1999).</li>
<li>Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+initiation+of+HCV+RNA+replication+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture.</a> Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).</li>
<li>Lindenbach, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+replication+of+hepatitis+C+virus+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complete replication of hepatitis C virus in cell culture.</a> Science. 309 (5734), 623-626 (2005).</li>
<li>Wakita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+infectious+hepatitis+C+virus+in+tissue+culture+from+a+cloned+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome.</a> Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+hepatitis+C+virus+infection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Robust hepatitis C virus infection in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).</li>
<li>Yi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+mutations+in+E1%2C+p7%2C+NS2%2C+and+NS3+enhance+yields+of+cell+culture-infectious+intergenotypic+chimeric+hepatitis+C+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus.</a> J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).</li>
<li>Pietschmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+infectious+intragenotypic+and+intergenotypic+hepatitis+C+virus+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+full-length+hepatitis+C+virus+genotype+1+%28strain+TN%29+infectious+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).</li>
<li>Yi, M., Lemon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype+1a+HCV+%28H77S%29+infection+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genotype 1a HCV (H77S) infection system.</a> Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).</li>
<li>Gottwein, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+hepatitis+C+reporter+viruses+with+genotype+1+to+7+core-nonstructural+protein+2+%28NS2%29+expressing+fluorescent+proteins+or+luciferase+in+modified+JFH1+NS5A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A.</a> J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).</li>
<li>Arumugaswami, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+functional+profiling+of+hepatitis+C+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome.</a> PLoS Pathog. 4 (10), (2008).</li>
<li>Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+enhancer+and+critical+cis-acting+RNA+elements+in+the+protein-encoding+region+of+the+hepatitis+C+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome.</a> J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).</li>
<li>Salloum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab18+binds+to+hepatitis+C+virus+NS5A+and+promotes+interaction+between+sites+of+viral+replication+and+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets.</a> PLoS Pathog. 9 (8), (2013).</li>
<li>Gonzalez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+an+optimal+RNA+transfection+reagent+and+comparison+to+electroporation+for+the+delivery+of+viral+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA.</a> J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).</li>
<li>Phan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+NS2+protein+contributes+to+virus+particle+assembly+via+opposing+epistatic+interactions+with+the+E1-E2+glycoprotein+and+NS3-NS4A+enzyme+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes.</a> J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).</li>
<li>Schaller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+hepatitis+C+virus+superinfection+exclusion+by+using+novel+fluorochrome+gene-tagged+viral+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes.</a> J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).</li>
<li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+hepatitis+C+virus+lacking+the+envelope-encoding+genes+for+single-cycle+infection+by+providing+homologous+envelope+proteins+or+vesicular+stomatitis+virus+glycoproteins+in+trans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans.</a> J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).</li>
<li>Jones, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+p7+and+NS2+proteins+are+essential+for+production+of+infectious+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus.</a> J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).</li>
<li>Steinmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+p7+protein+is+crucial+for+assembly+and+release+of+infectious+virions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions.</a> PLoS Pathog. (7), (2007).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu şekilde, hepatit C virüs çoğaltma döngüsü analiz etmek için bir yöntem tarif eder. HCV insan patojen ve öngörülen biyogüvenlik protokolü kesinlikle takip edilmesi gerekir. Bulaşıcı HCV hücre kültür sistemleri, daha önce 11-13,16,17 tarif edilmiştir. Resimli protokolü takip ederken biz uygulamak birkaç önemli nokta vardır. İlk olarak, alt çalışmalar için olduğu gibi tam uzunlukta viral genomik RNA&#39;nın iyi kalitede olması için büyük önem taşımaktadır. Viral cDNA&#39;yı taşıyan plazmid girişi lineerize ed...

Hepatit C virüsü (HCV), siroz ve karaciğer kanserine neden olur. Bu 350,000 kişi yılda 1-3 ölüyor, dünya çapında 170 milyon kişiyi etkilemektedir. HCV 9.6 kb&#39;lik bir genom boyutuna sahip bir pozitif iplikli bir RNA virüsüdür. HCV genomu, proteolitik olarak 10 polipeptitlere çeşitli hücresel ve viral proteazlar tarafından yarılır ~ 3000 amino asit kalıntıları tek bir poliprotein olarak tercüme edilir. HCV cinsi Hepatit C virüs in prototip virüsüdür ve Flaviviridae familyası 4 aittir. Maruz kalması üzerine, HCV bireylerin% 80, kronik enfeksiyon oluşturur. Enfeksiyon tanısı karaciğer bozulmasını önlemek için terapötik müdahaleye izin verebilir çoğunlukla asemptomatik ve zamanında. Güncel Tedavinin yetersiz olduğunu ve hiç aşı 5,6 mevcuttur. Hepatit C etyolojisi ilk 1989, 7 &#39;de tarif edilmiştir. HCV replikasyonu incelenmesi hepatit C aşısı ve tedavi araştırmalar için önemlidir, ancak bu olmuştuuzun süre etkili bir viral kültür sisteminin olmaması nedeniyle engellenmektedir. HCV&#39;nin moleküler klon intrahepatik, aşılamadan 8 üzerine şempanzelerde enfeksiyon olduğu gösterilmiştir. Daha sonra, HCV alt-genomik replikonlar, bir hücre kültür sistemi 9,10 viral genom çoğaltma aşamasını incelemek için izin verilmiş olan, tarif edilmiştir. Bir genotip 2a HCV Discovery JFH-1 (Japon fulminan hepatit-1) izole, hücre kültürü enfekte edebilen HCV çoğaltma araştırma 11-13 için yeni yollar açtı. Genotip 2a gerginlik JFH-1 arası ve içi genotipik kimerik virüs ve genotip 1 HCV bazlı bazlı bulaşıcı kültür sistemleri de 14-18 vardır. Biz başarıyla protein alanları ve sis etkili RNA elemanlarının 19,20 yüksek çözünürlüklü fonksiyonel profil haritasını elde etmek JFH-1 suşu ve HCV intragenotype 2a kimerik virüs kullandık. Buna göre, burada biz olanak rutin kullanılan etkili bir kültür sistemi açıklanmaktadırHCV çoğaltma döngüsü ve konak-patojen etkileşimi çeşitli aşamaları okuyor. Bu viral genomun replikasyonu ve intragenotype 2a HCV ve bir Renilla lusiferaz raportör göre HCV de novo enfeksiyon değerlendirmek virolojik ölçümlerde mevcut.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta (DMEM)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Azaltılmış Serum Ortamı, Fenol Yok Kırmızı Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>Huh-7.5.1</td><td>Scripps Araştırma Enstitüsü</td><td></td> Hücre hattı, Scripps Araştırma Enstitüsü ile Cedars-Sinai Tıp Merkezi Plazmidleri (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc ve pFNX-Rluc Pol null) <td>arasında yürütülen MTA kapsamında Dr. Francis Chisari tarafından Dr. Arumugaswami'ye nazikçe sağlandı</td></tr><tr><td>.</td><td>Cedars-Sinai Tıp Merkezi</td><td></td><td>HCV plazmitleri, üst üste binen oligo-nükleotidler kullanılarak Dr. Arumugaswami tarafından sentezlendi.</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biyolaboratuvarlar A.Ş.</td><td>R0145S Maş Fasulyesi</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express Büyük Ölçekli RNA Üretim Sistemi</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporasyon Küveti (4 mm)</td><td>Bioexpress</td><td>E-5010-4</td><td></td></tr><tr><td>Gen Pulser Xcell Toplam Sistem</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2660</td><td></td></tr><tr><td>fare monoklonal anti-dsRNA antikoru J2&nbsp;</td><td>İngilizce & Bilimsel Danışmanlık Kft.</td><td></td><td></td>10010200</tr><tr><td>Keçi anti-tavşan IgG Alexa Fluor 488</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan IgG Alexa Fluor 594</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membran paketi</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0263</td><td></td></tr><tr><td>Kurutma Sınıfı Engelleyici Yağsız Kuru Süt</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6404XTU</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531XTU</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hepatit C Virüsü NS3 antikoru [8 G-2]</td><td>Abcam</td><td>ab65407</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hepatit C Virüsü NS3 antikoru [H23]</td><td>Abcam</td><td>ab13830</td><td></td></tr><tr><td>Yaban turpu peroksidaz (HRP) ile konjuge keçi anti-fare IgG&nbsp;</td><td>Jackson İmmüne Araştırma Laboratuvarları A.Ş.</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL Prime Western Blotting Tespit Reaktifleri&nbsp;</td><td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri</td><td>RPN2236</td><td></td></tr><tr><td>SUPERSCRIPT III RT&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>SYBR QPCR SUPERMIX, ROX Yaşam</td><td>Teknolojileri</td><td>11744500</td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 gerçek zamanlı PCR sistemi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Renilla Lusiferaz Test Sistemi kiti</td><td>Promega</td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>RNaz İçermeyen DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>GloMax-Çoklu Algılama Sistemi (Luminometre)</td><td>Promega</td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Fuar

hepatit c virüsü Çoğaltma analizi için protokol

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Hepatit C Virüsü (HCV) dünya nüfusunun% 3 etkiler ve kronik hepatit, siroz ve hepatosellüler karsinom gibi ciddi karaciğer rahatsızlıkları olur. HCV, Flaviviridae ailesine ait zarflı bir RNA virüsüdür. Mevcut tedavi, tam etkili değildir ve istenmeyen yan etkilere neden olur. Hiçbir HCV aşısı yoktur. Bu nedenle, devam eden bir çaba bir aşı ve daha iyi bir tedavi geliştirmek için gereklidir. HCV bir hücre kültür sistemi viral girişi, genom replikasyonu, paketleme, ve çıkış da dahil olmak üzere HCV gelişmesinin çeşitli aşamalarında çalışmaları için önemlidir. Sunulan mevcut prosedüründe, bir vahşi tip intragenotype 2a kimerik virüs, FNX-HCV ve virüs çoğaltma incelemek için bir Renilla lusiferaz haberci genini taşıyan bir rekombinant virüs FNX-Rluc kullanılır. Bir insan hepatoma hücre hattı (Huh-7 göre) in vitro transfeksiyonu için kullanılmıştır HCV genomik RNA transkripsiyonu. Hücresiz kültür üst sıvıları, protein lizatlan ve tla m HCV RNA büyümeyi değerlendirmek için post-transfeksiyon işaret çeşitli zaman hasat edilmiştir. HCV genomu, çoğaltma durum nicel RT-PCR ve HCV varlığının görüntülenmesi iki-şeritli RNA tarafından değerlendirildi. HCV protein ekspresyonu HCV NS3 ve NS5A proteinleri için spesifik antikorların kullanıldığı Western blot ve imüno deneyleri ile doğrulanmıştır. Kültür yüzer ve viral titresi olarak bulaşıcı parçacıklar serbest HCV RNA transfekte edilmiş hücreler ölçülmüştür. Lusiferaz deneyleri, raportör HCV&#39;nin replikasyon seviyesi ve enfeksiyon riskini değerlendirmek için kullanılmıştır. Sonuç olarak, HCV replikasyon döngüsünün farklı aşamalarında karakterize etmek için çeşitli virolojik ölçümlerde mevcut.

Hepatit C virüs, bir RNA virüsüdür. Bu nedenle, genetik manipülasyon amaçla, HCV genomik cDNA bakteriyel bir plasmid vektörüne klonlanmıştır. A T7 RNA polimeraz promotörü sekans, HCV genomunun 5 &#39;ucuna hemen önce başlandı. HCV analiz akışı bir genel hatları Şekil 1 &#39;de sunulmuştur. Tam 3&#39; ucuna sahip HCV genomik RNA oluşturmak için, plazmit ihtiva eden HCV genomu, Xba I kısıtlama enzimi ile oluşturulan tek sarmallı çıkıntı mung fasulye nükleaz sindirim ile köreltildi edildi ile kesi...

Hepatit C Virüsü (HCV), siroz ve kanser dahil olmak üzere karaciğer bozukluklarına neden olan önemli bir insan patojenidir. HCV enfeksiyöz hücre kültürü sistemi, HCV replikasyonunun moleküler mekanizmasını anlamak ve yeni terapötik yaklaşımlar geliştirmek için gereklidir. Burada, HCV replikasyon döngüsünün çeşitli aşamalarını araştırmak için bir protokol açıklıyoruz.

Hepatit C Virüsü Çoğaltma Analizi için Protokol

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

Bu prosedürün genel amacı, Hepatit C virüsü replikasyon döngüsünün çeşitli aşamalarını incelemektir. Bu işlem, öncelikle doğrusallaştırılmış HCV plazmit yapılandırmalarından HCV genomik RNA transkriptlerinin üretilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, hücrelerin H-C-V-R-N-A ile transfekte edilmesidir. Ardından, hücreler çeşitli zaman noktaları ve analizler için plakalara ekilir. Son adım, viral titreyi ölçmek için hücre kültürü süpernatantının toplanması ve protein ile RNA analizi için transfekte edilmiş hücrelerin hasat edilmesidir. Son olarak ters transkripsiyon-PCR, Western blotting, immünofloresan analiz ve HCV titresi uygulanarak güçlü bir HCV enfeksiyöz hücre kültürü sistemi ortaya konur.Bu enfeksiyöz hepatit C virüsü hücre kültürü sisteminin HCV replikon sistemine göre temel avantajı; viral giriş, virion birleşimi ve çıkış basamaklarının incelenebilmesidir. Bu protokol, virion morfojenezi ve konak-patojen etkileşimi gibi hepatit C virolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, potansiyel aşı adayları olarak değerlendirilebilen atenüe viral suşların karakterizasyonuna olanak tanıması nedeniyle aşı geliştirmeye kadar uzanmaktadır.Bu yöntem hepatit C virüsü hakkında bilgi sağlayabilse de, Flaviviridae ailesindeki diğer RNA virüsleri için de uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemi ilk kez kullanan kişiler, yüksek kaliteli HCV genomik RNA üretme zorluğuyla karşılaşacaklardır. Genotip-2A HCV Japon fulminan hepatit bir izolatının keşfinin ardından, hücre kültüründe HCV'nin tüm replikasyon döngüsünün incelenmesi mümkün hale gelmiştir. Virolojik analizin görsel olarak gösterilmesi kritiktir çünkü bu analiz, hem moleküler hem de hücresel teknikler konusunda uzmanlık gerektirmektedir.Viral replikasyonun değerlendirilmesi için bir intra-genotip 2A kimerik virüs, F-N-X-H-C-V ve pol-null HCV kullanılarak, önceden oluşturulmuş viral plazmitleri iki mililitrelik bir tüpte XBA-one restriksiyon enzimi ile sindirerek lineerize edin. Ardından, küt uçlar oluşturmak için plazmitleri mung fasulyesi nükleazı ile işleme tabi tutun.Sindirilen plazmidleri anyon değişim kromatografisi ile saflaştırın. Lineerize edilmiş plazmidin bütünlüğünü, DNA'yı agaroz jel elektroforezine tabi tutarak doğrulayın. Ardından, HCV genomik RNA transkriptlerini sentezlemek için, lineerize edilmiş plazmid DNA kalıbını T-seven RNA polimeraz reaksiyon bileşenlerini içeren 0,2 mililitrelik bir tüpe ekleyin.Yeni sentezlenen DNaz işlem görmüş RNA'yı bir RNA saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın. Ardından RNA üretimini agaroz jel elektroforezi ile doğrulayın. Bunu takiben, RNA miktarını spektrofotometri ile belirleyin.Trypsin enzim uygulamasıyla Huh-7 tabanlı aderent hücreleri ayırın ve hücreleri 50 mililitrelik konik tüpe toplayın. Ardından iki kez santrifüjleme yaparak hücre peletini soğuk düşük serumlu besiyeri ile yeniden süspande edin. Santrifüjleme işlemini tekrarladıktan sonra, hücreleri düşük serumlu besiyeri içerisinde mililitrede 1 × 10⁷ hücre olacak şekilde yeniden süspande edin.Ardından, toplam 10 µg transkribe edilmiş viral RNA'yı, 400 µL resüspande edilmiş hücre ile birlikte önceden soğutulmuş 0.4 cm'lik bir elektroporasyon küvetinde karıştırın. Viral RNA'yı, 270 V, 100 Ω ve 950 µF değerlerinde elektroporasyon kullanarak hücrelere aktarın. İşlem tamamlandığında, elektropore edilmiş hücreleri %15 FBS içeren 10 mL komplet büyüme ortamında resüspande edin. Bu aşamada, hücreleri 4, 48 ve 96 saatlik zaman noktaları için, her bir flask başına yaklaşık 1.2 × 10⁶ hücre olacak şekilde T 25 flasklarına ve her bir kuyucuğa 1 × 10⁴ hücre olacak şekilde 48 kuyucuklu plakalara ekimleyin. Kültür flasklarındaki ve plakalarındaki ölü hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için, transfeksiyondan 4 ila 8 saat sonra ortamı %10 FBS içeren taze takviyeli büyüme ortamı ile değiştirin.Serolojik bir pipet kullanarak 48 ve 96 saatlik zaman noktalarında hücre kültürü süpernatanlarını 15 mililitrelik konik bir tüpe toplayın. Ardından, toplanan örneklerdeki hücresel kalıntıları, 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca 15.000 rpm hızda santrifüj ederek uzaklaştırın. Santrifüj işleminin ardından, hücre içermeyen süpernatanları negatif 80 santigrat derecede saklayın.Belirtilen zaman noktalarında, western blot ve ters transkriptaz kantitatif PCR veya RT-qPCR ile protein ve RNA analizi yapmak için hücreleri lize edin. 0,2 mililitrelik bir tüp içerisinde, ters transkriptaz enzimi ve HCV sense strand'inin beş prime çevrilmeyen bölgesine bağlanan spesifik bir primer kullanarak bir mikrogram toplam hücresel RNA'yı ters transkribe edin. Ayrıca, HCV sense strand primeri kullanarak bilinen genom kopya sayısına sahip F-N-X-H-C-V-R-N-A'yı ters transkribe edin. Bir gerçek zamanlı PCR sistemi kullanarak, spesifik HCV primerleri ve DNA bağlayıcı yeşil boya içeren qPCR süper karışımı ile elde edilen transkribe cDNA'nın 50 nanogramını kullanarak qPCR gerçekleştirin. H-C-V-R-N-A kopya sayısını belirlemek için qPCR çalıştırırken aşağıdaki koşulları uygulayın. qPCR'ın ardından, transfeksiyondan 96 saat sonra viral RNA transfekte edilmiş hücre lizatını SDS page ile ayrıştırın. Ardından, jeldeki ayrıştırılmış proteinleri trans-blot turbo yöntemiyle bir poliviniliden diflorür membrana aktarın. Membranı, PBS içerisinde %5 yağsız süt ve %0,2 tween-20 içeren bir bloklama çözeltisi kullanarak bloklayın ve bir kaba yerleştirin.Membranı, 4 °C'lik soğuk odada, 1/1000 dilüsyonundaki primer fare monoklonal antikor NS3 ve 1/5000 dilüsyonundaki beta-actin ile inkübe edin. İnkübasyon sonrası, 1/5000 dilüsyonundaki horseradish peroksidaz ile konjuge keçi anti-fare immünoglobulin-G ekleyin ve kemilüminesans ile tespit edin.Bu aşamada, immunofloresan analiz için H-C-V-R-N-A transfekte edilmiş hücreleri -20 °C'de 30 dakika boyunca metanol kullanarak sabitleyin. İşlem tamamlandığında, hücreleri üç kez PBS ile yıkayın. Immunofloresan analiz bloklama tamponu ile bloklama yaptıktan sonra, tavşan poliklonal anti-NS5A primer antikoru ve fare monoklonal anti-DSRNA J2 antikoru'nu 1/200 dilüsyonda uygulayın ve 4 °C soğuk odada beş saatten gece boyuna kadar inkübe edin. İnkübasyonun ardından, primer antikordan sonra hücreleri üç kez PBS ile yıkayın. Daha sonra, keçi anti-tavşan immünoglobulin-G 488 poliklonal sekonder antikoru ve keçi anti-fare immünoglobulin 594 poliklonal sekonder antikoru'nu 1/1000 dilüsyonda ekleyin ve oda sıcaklığında, bir masaüstü sallayıcı üzerinde bir saat boyunca inkübe edin. Hücreleri üç kez PBS ile yıkadıktan sonra, çekirdekleri Hoechst boyası ile boyayın ve floresan mikroskobu altında inceleyin.Bir sonraki aşamada, 96 kuyucuklu bir plaka kullanarak her kuyucuğa yaklaşık 3 × 10³ hücre gelecek şekilde naif Huh7.5.1 hücreleri ekin. Ertesi gün, HCV RNA transfekte edilmiş hücrelerden elde edilen hücre içermeyen kültür süpernatantının büyüme besiyeri ile on katlı seri dilüsyonunu gerçekleştirin ve Huh7.5.1 hücrelerine üç tekrar şeklinde inoküle edin. Enfeksiyondan 72 saat sonra hücreleri, -20 °C'de 30 dakika boyunca metanol kullanarak fikse edin. Hücreleri dondurucudan çıkardıktan sonra, daha önce açıklanan koşulları kullanarak HCV NS5A proteini için immün boyama yapın. Floresan mikroskop kullanarak, en yüksek viral dilüsyona sahip kuyucuktaki NS5A pozitif hücre odaklarını sayın ve mililitre başına ortalama odak oluşturucu birim sayısını hesaplayın.Lineerleştirilmiş HCV plazmid kalitesi jel elektroforezi ile değerlendirildi. HCV DNA'sı, 9,6 Kilobase boyutunda tek bir RNA ürünü veren T-seven RNA polimeraz aracılı in vitro transkripsiyona tabi tutuldu. RT-qPCR sonuçları, yabanı tip virüsün genomu verimli bir şekilde replike ettiğini gösterdi. Yabanı tip, pol-null virüse kıyasla bir ila üç log daha yüksek düzeyde genom replikasyonu sergiledi.Yabani tip virüs, viral protein kesimi ve genom replikasyonunda yer alan NS3 proteinini üretmiştir. Yabani tip virüs ayrıca NS5A proteinini eksprese etmiş olup, NS5A proteini ve çift sarmallı RNA, yabani tip transfekte hücrelerin hücresel sitoplazmasında ko-lokalize olmuştur; bu durum aktif viral replikasyonu göstermektedir. Virüs titresi ölçümleri, yabani tip virüsün enfektif olduğunu ve enfektif partikül başına mililitre başına 10.000'den fazla odak oluşturucu birim ürettiğini göstermiştir. Transfeksiyondan sonraki altıncı saatte, hem yabani tip hem de pol-null virüsler benzer lusiferaz aktiviteleri göstermiş, bu da transfekte edilen RNA'nın benzer bir giriş seviyesinde transle edildiğini belirtmiştir. Ancak, transfeksiyondan sonraki 48. ve 96. saatlerde yabani tip virüs, pol-null virüse kıyasla artmış genom replikasyon seviyeleri sergilemiştir. Yabani tip virüs ayrıca viral NS3 proteini üretmiştir. Pol-null virüs bazal seviyede lusiferaz aktivitesine sahipken, yabani tip virüs, pol-null raporlayıcı virüse kıyasla iki ila üç log daha yüksek replikasyon seviyesine sahipti. Uzmanlaşıldığında, Hepatit-C virolojik analizleri uygun şekilde yürütüldüğü takdirde iki hafta içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, sağlıklı hücrelere ve yüksek kaliteli HCV genomik RNA transkriptlerine sahip olmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, karakterize edilmiş HCV suşları, in vivo uygunluğu ve konakçı-patojen etkileşimlerini araştırmak amacıyla hayvan model sistemlerinde test edilebilir.Enfektöz bir HCV hücre kültürü sisteminin geliştirilmesi, araştırmacıların HCV replikasyon döngüsünün virion morfogenezi ve viral çıkış basamaklarını incelemelerine olanak sağlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, Hepatit C virüsü replikasyon döngüsünün farklı aşamalarını karakterize etmek için çeşitli virolojik analizlerin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Hepatit C virüsü ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanımı gibi güvenlik önlemlerinin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

a-protocol-for-analyzing-hepatitis-c-virus-replication

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Heterokaryon Oluşumu İki Yöntemleri HCV Sınırlayıcı Etkenler Discover

Source: Allaire, A., et al. Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus. J. Vis. Exp. (2015).The video demonstrates the procedure for preparing cells to assess the intracellular uptake and activity of an antiviral agent against the hepatitis C virus.

Preparing Cells to Analyze Intracellular Uptake and Activity of an Antiviral Agent

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates the procedure for quantifying Hepatitis C viral RNA using quantitative reverse transcription PCR to measure viral load in infected cell cultures.

Measuring Hepatitis C Viral Load Using Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Immunofluorescence Assay to Detect Hepatitis C Virus Replication Complexes in Infected Cells

Bu video, antiviral bileşiklerin taranması için bir viral bağlanma testini göstermektedir. Genetiği değiştirilmiş hepatit C virüsü ve lusiferaz kullanarak, tek başına virüsle tedavi edilen kuyucuklara kıyasla birlikte tedavi edilen kuyucuklarda daha düşük ışık yoğunluğu ile belirtildiği gibi, viral bağlanma üzerindeki inhibitör etkileri değerlendirir.

Antiviral Bileşiklerin Taranması için Bir Viral Bağlanma Testi

Bu video, konakçı hücrelere viral girişin belirli adımlarını ve endozomla füzyonu hedefleyen antiviral ajanları değerlendirmek için bir testi göstermektedir. Hücreler düşük bir sıcaklıkta inkübe edilir ve daha sonra HCV ile enfekte edilir. Düşük sıcaklık, konakçı hücrelere viral bağlanmaya izin verir, ancak endositoz yoluyla içselleştirmeyi engeller. Test antiviral bileşiği eklenir ve hücreler fizyolojik sıcaklıkta inkübe edilir. Daha yüksek bir sıcaklığa bu geçiş, viral girişi kolaylaştırır ve...

Test Bileşiklerinin Konakçı Hücrelerde Viral Giriş ve Füzyon Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek İçin Bir Test

Burada HBV yaşam döngüsünün erken aşamalarında izlemek için yeni geliştirilmiş hepatit B virüsü (HBV) muhabiri sistemini açıklar. Vitro sistemde BASİTLEŞTİRİLMİŞ yüksek verimli bir strateji kullanılarak anti-HBV maddelerinin taranması yardımcı olacaktır.

Bir Hepatit B Virüsü Muhabir Sisteminin Geliştirilmesi Çoğaltma Döngüsü Erken Aşamaları Monitör

Lipid damlacıkları Hepatit C virüsü (HCV), dahil olmak üzere çeşitli patojenlere replikasyonu için önemli organellerdir. Bu ilişkili proteinler kantitatif kütle spektrometresi için lipid damlacıkları izole edilmesi için bir yöntem tarif; bu tür virüs enfeksiyonu, çevresel stres veya ilaç tedavisi gibi koşullar, çeşitli altında kullanılabilir.

Kantitatif Kütle Spektrometresi Analiz lipid Damlacık izolasyonu

Biz burada HBV DNA vitro nesil bir Hepatit B virüs enfeksiyonu sistemi üzerinden tarif ve tersini kullanarak (1-2 kopya) entegrasyonu son derece hassas tespiti PCR iç içe.

Algılama düşük kopya sayısı Vitro hepatit B enfeksiyonu tarafından kurulan entegre Viral DNA

3-b "karaciğer-on-a-chip" enfeksiyon hepatit B virüs ile deneyler gerçekleştirmek için adım adım bir kılavuz sağlamak için bu protokolü hedefidir.

"Karaciğer-on-a-Chip" kültürleri birincil tetkikine ve Kupffer hücreleri için Hepatit B virüs enfeksiyonu

Protokol, hataya açık PCR ve ters genetik kullanarak tam uzunlukta mutant RNA sentezini birleştirerek hepatit C virüsü genomunda kontrol edilebilir genetik çeşitliliği tanıtmak için bir yöntemi açıklar. Yöntem, fenotip seçimi için bir model sağlar ve 10 kb uzunluğunda pozitif anlamlı RNA virüs genomları için kullanılabilir.

Pozitif Anlamlı RNA Virüsü Varyantlarını Tasarlamak için Tersine Genetik

Öğrenin, Hepatit C virüsü replikasyon döngüsünü incelemek için HCV genomik RNA üretimi ve hücre transfeksiyonu yöntemlerini. Bu protokol, viroloji ve bulaşıcı hastalıklar alanında yeni tedavi stratejileri geliştirmeye katkı sağlar.

Hepatit C Virüsü Çoğaltma Analizi için Protokol

Daha fazla video keşfet