Name: Histerektomi Örneklerden İlköğretim İnsan endometrial stroma hücrelerinde Kurulması İçin İki Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Keşfedin histerektomi örneklerinden primer endometrial stromal hücre kültürü kurma yöntemlerini. Kazıma ve tripsin teknikleri ile hücre izolasyonu ve qPCR ile doğrulama süreçlerini öğrenin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz onların görüntüleme ve mikroskop ekipman kullanımı için Dr Thao&#39;nun Dang ve onun laboratuar üyelerinin ortak çabaları teşekkür ederim. Biz de rahim dokusu ile bize sağlamak için Biorepository ve Doku Araştırma Tesisi (BTRF) çekirdek, Jeff Harper ve Virginia Üniversitesi sakinlerine teşekkür ederim. Biz Şematik Bakış ile yardım için Karol szlachta teşekkür ederim.

Bu yazıda kullanılan histerektomi örnekleri IRB-HSR # 14424 sayılı Üniversite IRB-onaylı etik protokolü ile uyum içinde toplanmıştır. Klinik Kaynak 1. Örnek Edinme <ol><li> Başlamadan önce hükümeti ve kurum-temelli etik kuralları ve onay belgeleri edinmek. </li><li> Steril şartlarda tüm adımları Davranış. </li><li> Numune hemen kültüründe işlenemez 4 ° C de, 50 ml bir tüp içinde ortam (RPMI ya da DMEM / yüksek glukozlu) hasta türetilen dokuları korur. Numuneler, 24 saat bir süre için bu halde saklanabilir. </li><li> 1X steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile bir doku örneği, üç kez yıkanır ve yıkamalar arasında solüsyonu atın. </li></ol> Kazıma Yöntemi kullanılarak Primer Hücre Hatları 2. Hazırlanması <ol><li> Büyüme ortamı (RPMI veya% 10 Fetal Sığır Serumu ve% 1 Penisilin-streptomy ile takviye edilmiş DMEM / Yüksek Glikoz 4-10 ml ekleyincin) dokuya ve 30 dakika boyunca fungizon (0.25 ug / ml nihai konsantrasyon) ekleyin. </li><li> Büyüme ortamı atın. </li><li> 1X PBS ile iki kez doku yıkayın. </li><li> Miyometriyum ve endometriyum katmanları (Şekil daha fazla bilgi için bakınız Şekil 2A-2C) ayırt etmek için 6 cm hücre kültür plakası üzerine doku yerleştirin. Endometrium ayırın. </li><li> 6 cm hücre kültürü çanak üzerine çizilmemesi ise bir neşter veya jilet kullanarak, küçük parçalar halinde doku transect. Bu çizikler çıkan birincil endometrial hücrelerin bağlanmasını kolaylaştırır. Tripsin yöntem ile karşılaştırıldığında, daha fazla doku (bir yaklaşım Şekil 2D bakınız) gereklidir. </li><li> Yavaşça, çizik tabak (doku parçaları görünür ve ideal tırmalama hareketinden hareketsiz olacak) büyüme ortamı 2 ml ekleyin. </li><li> Belirli bir hücre kültürü inkübatöründe için plaka (lar) aktarın (37 ° C ve% 5 CO2). Uzak oth, primer hücre hatları için bir yer tayinHücre kültür tabakları er. Primer kültürler enfeksiyon ve kontaminasyon daha duyarlıdır. </li><li> Günlük ışık mikroskobu altında hücreleri inceleyin. Küçük hücre popülasyonları (Şekil 3B) dilimlenmiş dokuların etrafında güne iki veya üç tarafından ortaya olmalıdır. </li><li> , Kültürleri korumak 1X PBS ile hafifçe yıkayın ve her üç günde bir, taze büyüme ortamı (2 ml) ekleyin. Proliferasyon hızı artar, daha fazla büyüme ortamı (3-4 mi) 6 cm kültür plakasına (lar) ilave edilebilir olduğunda. Not: yıkama ve ortam değişiklikleri sırasında, doku parçaları büyük olasılıkla aspire edilecektir. Bu yapışık hücre büyümesini etkilemez. Yeni koloniler bir hafta sonra ortaya vermemektedirler gibi doku parçaları bir sonraki aşamada (2.10) tarafından aspire edilmelidir. </li><li> % 0.05 tripsin kullanılarak% 80 birleşmiş (Şekil 3B), pasaj - 6 cm plaka yaklaşık 75 olduğunda. Birincil hücreler süresiz pasajlandığında edilemez - iki ya da üç tabak ma kısa sürede hücrelerin bir tabak aşağı dondurmakintained. Daha fazla geçit gerekiyorsa, (Ref 3 gözden) bir ölümsüzleşme protokolünü uygulayın. </li></ol> Tripsin Yöntemi kullanılarak Primer Hücre Hatları 3. Hazırlanması <ol><li> Kanamisin (0.03 mg / ml son konsantrasyon) ile takviye edilmiş% 0.25 tripsin ve 2 ml endometrial doku küçük bir parça (bir yaklaşım Şekil 2D bakınız) yerleştirin. </li><li> 30 dakika süreyle dönen bir platform 37 ° C&#39;de doku inkübe edin. </li><li> Kısaca doku girdap. </li><li> 2 dakika boyunca 200-400 xg&#39;de örnek santrifüj ve süpernatant atın. </li><li> Taze tripsin ve Kanamisini ekleyin. </li><li> Bir saat boyunca dönerken 37 ° C&#39;de doku inkübe edin. </li><li> 5-10 saniye için doku vorteksleyin. </li><li> Tripsin devre dışı bırakmak için (% 10 Fetal Sığır Serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş) 2 ml büyüme ortamı ekleyin. </li><li> 2-3 dakika boyunca 200-400 xg&#39;de Santrifüj hücreleri. </li><li> Süpernatantı atın ve büyümeye 2 ml ekleyintopak hücrelere th ortam. </li><li> 6 cm hücre kültürü çanak üzerine Plate. Kazıma Yöntemi kullanılarak primer hücre hatları hazırlanması Aşama 2.5 ile plaka kazınması gerekli değildir, ancak primer kültürlerin eki ve büyümesini artırır. </li><li> Günlük ışık mikroskobunda hücreyi izleyin. Hücreler (Şekil 3C), 24-48 saat sonra, bir ışık mikroskobu altında genellikle görebilir. </li><li> Kültürleri korumak için, hücreleri izlemek ve Aşama 2.9 &#39;da olduğu gibi her 2-3 günde bir ortam değiştirin. </li><li> Hücreler% 75-80 konfluense (Şekil 3C) ulaştıklarında geçişi için hücreler,% 0.05 ya da% 0.25 tripsin kullanın. </li></ol> 4. Ekstra Analiz Doku (Yapış Dondurma ve Formalin Fixation) Tasarruf <ol><li> 1X PBS ile iki kez numune yıkayın. </li><li> Mümkün olduğu kadar sıvı aspire. </li><li> Yapış Donma için, (Şekil 2F ve 2G bakınız) 1.7 santrifüj tüpüne endometriyal doku örneği yerleştirin. 1,7 yerleştirinSantrifüj tüpü 10 saniye boyunca sıvı azot ya da kadar donmuş doku aşağı olduğu görülmektedir. Not: örnekleri hazırlarken doğrudan sıvı azot dokunmamaya özen gösterin. Numuneler, daha ileri işleme veya analiz edilinceye kadar -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Formalin fiksasyonu için, endometriyal doku (Şekil 2H bakınız) küçük bir parça kesip, ve% 10 tamponlu formalin çinko daldırın. 24 saat sonra, formalin atmak ve tekrar işlenene kadar doku numunelerini,% 70 etanol ekleme. </li></ol> 5. İmmünofloresan (IF) <ol><li> Hücre sabitleme <ol><li> Bir kültür slayt veya tabakta hücreleri hazırlayın. </li><li> Yavaşça, 1X PBS ile hücreleri yıkayın. </li><li> 5 dakika boyunca (bir 1:1 oranında karıştırılmış) önceden soğutulmuş (4 ° C) bir metanol ve aseton ekleyin. </li><li> Hava geçmeden önce slayt kurulayın. Gerekirse Slide 1-2 hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol></li><li> İşlem IF <ol><li> 10 dakika boyunca 1X PBS ile hücreler rehidrate. FO içinllowing dönen bir platform üzerinde tüm yıkar ve inkubasyon yapmak, 1-6 adımları. </li><li> 1X PBS kullanılarak blok,% 1 Sığır Serum Albümini (BSA) ile takviye edilmiş ve oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca% 1 türe özel serum (2. antikor kaynağı). </li><li> (Antikor dilüsyonları için üreticilerin tavsiyelerine bakın) primer antikor inkübe. Özel antikorlar için malzemeler bakınız. Aşama 5.2.2 &#39;de olduğu gibi, taze bloke edici tampon birincil antikor seyreltin. Bu inkübasyon, oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C&#39;de en az 2 saat boyunca yapılabilir </li><li> 5 dakika her biri için 1X PBS ile 3 kez yıka. </li><li> (Antikor dilüsyonları için üreticilerin tavsiyelerine bakın) ikincil antikor inkübe edin. Adım 5.2.2 gibi taze engelleme tamponda ikincil antikor sulandırmak. Foto-ağartma önlemek için, ışık yokluğunda bu ve daha sonraki adımlar yapmak için önemlidir. </li><li> 5 dakika her biri için 1X PBS ile 3 kez yıka. </li><li> Thoroughly slaytlar kurulayın. </li><li> Montaj ortamı ve DAPI karşı boyama solüsyonu ekleyin. </li><li> Lamel uygulayın ve yapıştırıcı (ler) kullanarak kenarları mühür. Slaytlar kadar 2 hafta boyunca karanlıkta 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol></li></ol> 6.. RNA Ekstraksiyon <ol><li> Santrifüj ile x 1 10 7 hücrelerinin Pelet. Bu protokol tüm malzemeler ve reaktifler ücretsiz RNAz edilmelidir. </li><li> 1 ml Trizol reaktifi ve nükleoprotein kompleksleri ayrılmasını tamamlamak için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca homojenize örnekleri inkübe olarak Hücreleri,. </li><li> Trizol 1 ml kloroform başına 200 ul ekle. 15 saniye boyunca elle kuvvetli bir şekilde çalkalanır ve oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübe edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika süreyle maksimum hızda (15,000 xg) santrifüje Üç katmanları neden olacaktır. </li><li> Yeni bir mikrosantrifüj tüpü içine üst sulu faz transfer. RNA verimi artırmak için 1 ul glikojen ekleyin; Ancak bu adım sadece gerekli olduğunda, küçük birRNA miktarı tahmin edilmektedir. </li><li> Sulu tabakaya, izopropil alkol, 0.5 ml ilave edilir, ve örnekler 3-5 kez ters çevirin. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Verimini artırmak için, numuneler, 30 dakika boyunca -20 ° C veya -80 ° C de yerleştirilebilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika maksimum hızda santrifüje </li><li> Bu noktada, RNA küçük topak görünür olmalıdır. Süpernatant atın. </li><li> % 75 etanol içinde 1 ml RNA yıkayın. </li><li> 5 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj ve süpernatant atın. Numuneler, bir kez inorganik kirletici maddeleri kurtulmak için daha yıkanabilir, fakat bu adım gerekli değildir. </li><li> RNA pelet kuru kadar kısa bir süre (genellikle 7-10 dakika sürer) RNA pelet kurulayın. Not: Bir ek adım inorganik maddeler azalır ve kurutma süresini azaltmak için kullanılabilir. Ek bir dakika ve aspirat kalıntı sıvı için maksimum hızda etanol yıkaması, spin örneklerinden süpernatant atılmasından sonra. Pelet aspire etmemeye dikkat edin. </li><li> RNA pelet boyutuna bağlı olarak, RNase-içermeyen su içinde RNA çözülür. Hacimleri 10-50 ul arasında değişir. </li><li> 10 dakika boyunca 55 ° C&#39;de inkübe edin ve RNA konsantrasyonları ölçülür. </li><li> Daha sonra işlenene kadar -20 ° C&#39;de saklayın örnekleri. </li></ol> 7. Ters Transkripsiyon <ol><li> H2O ile 9 ul bir hacme örnek RNA (1-3 ug) getirin </li><li> 10 dakika boyunca 70 ° C&#39;ye kadar ısı RNA. </li><li> DNTP 5 ul (50 uM çalışma konsantrasyonu), N6 DNA oligo 5 ul (80 uM çalışma konsantrasyonu), 5X AMV tampon çözeltiden 5 ul ve AMV 1 ul: Bir AMV ana karışımı oluşturmak için, aşağıdaki reaktifler kombine . Bu ana karışımı çözelti bir numune başına tasarlanmıştır. </li><li> Isıtmalı RNA&#39;ya ana karışımı 16 ul ekleyin. Nihai reaksiyon hacmi 25 ul reaksiyon olacaktır. </li><li> (Aşama 1), 90 dakika boyunca 42 ° C, (Sta: ters transkripsiyon için, aşağıdaki koşulları kullanarak PCR5 dakika ve daha sonra işlenene kadar (Aşama 3), 4 ° C ge 2) 95 ° C. </li></ol> 8. Real Time PCR <ol><li> Tablo 1 &#39;de bulunan primerler, tavlama sıcaklıkları, devir sayıları ve reaktif maddeler kullanılarak PCR reaksiyonları yürütmek için. Not: (Malzeme şirket ve katalog numaraları bakınız) PCR bileşenlerini kullanırken üretici talimatları takip etmek için idealdir. </li></ol> 9. (Ref. 4 ve 5&#39;te elde edilir) In vitro desidualizasyon Protokol <ol><li> Endometrial hücreler Plate. </li><li> % 75-85 bir konfluansa kadar büyür. </li><li> Hücreler konfluent hale sonra, 1X bir kez PBS ile yıkayın. </li><li> Çabuk, (Fenol RPMI% 5 kömür şerit FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş) hormonsuz ortam ekleyin. </li><li> 24 saat sonra, 1 uM 8-3 Bromoadenosine bir son konsantrasyonda medroksiprogesteron asetat (MPA) ile desteklenmiş Hormonsuz ortam &#39;, 5&#39; ekleme0.5 mM&#39;lik bir son konsantrasyonda-siklik monofosfat (cAMP). </li><li> En az 48 saat sonra, reaksiyonu durdurmak ve daha ileri işleme için plaka (lar) kaydedin. </li></ol>

<ol><li>Heller, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeller%2C+D+%22in+The+endometrium%3A+a+clinicopathologic+approach%22">in The endometrium: a clinicopathologic approach</a>. Heller, D. , 56-75 (1994).</li>
<li>Emera, D., Romero, R., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+menstruation%3A+a+new+model+for+genetic+assimilation%3A+explaining+molecular+origins+of+maternal+responses+to+fetal+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">The evolution of menstruation: a new model for genetic assimilation: explaining molecular origins of maternal responses to fetal invasiveness.</a> Bioessays. 34, 26-35 (2011).</li>
<li>Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+protocols+used+in+cell+culture+models+of+human+breast+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis.</a> Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).</li>
<li>Brosens, J. J., Hayashi, N., White, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+receptor+regulates+decidual+prolactin+expression+in+differentiating+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells.</a> Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).</li>
<li>Jones, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+SUMO+pathway+sensitizes+differentiating+human+endometrial+stromal+cells+to+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of the SUMO pathway sensitizes differentiating human endometrial stromal cells to progesterone.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 16272-16277 (2006).</li>
<li>Salamonsen, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+the+human+endometrium+and+uterine+fluid%3A+a+pathway+to+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Proteomics of the human endometrium and uterine fluid: a pathway to biomarker discovery.</a> Fertil Steril. 99, 1086-1092 (2013).</li>
<li>Haouzi, D., Dechaud, H., Assou, S., De Vos, J., Hamamah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+human+endometrial+receptivity+from+transcriptomic+and+proteomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Insights into human endometrial receptivity from transcriptomic and proteomic data.</a> Reprod Biomed Online. 24, 23-34 (2012).</li>
<li>Chen, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+midproliferative+and+midsecretory+human+endometrium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of midproliferative and midsecretory human endometrium.</a> J Proteome Res. 8, 2032-2044 (2009).</li>
<li>Talbi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phenotyping+of+human+endometrium+distinguishes+menstrual+cycle+phases+and+underlying+biological+processes+in+normo-ovulatory+women%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Molecular phenotyping of human endometrium distinguishes menstrual cycle phases and underlying biological processes in normo-ovulatory women.</a> Endocrinology. 147, 1097-1121 (2006).</li>
<li>Punyadeera, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oestrogen-modulated+gene+expression+in+the+human+endometrium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Oestrogen-modulated gene expression in the human endometrium.</a> Cell Mol Life Sci. 62, 239-250 (2005).</li>
<li>Ponnampalam, A. P., Weston, G. C., Susil, B., Rogers, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+human+endometrium+during+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Aust+N+Z+J+Obstet+Gynaecol%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of human endometrium during the menstrual cycle.</a> Aust N Z J Obstet Gynaecol. 46, 154-158 (2006).</li>
<li>Zhang, L., Rees, M. C., Bicknell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+long-term+culture+of+normal+human+endometrial+epithelium+and+stroma.+Expression+of+mRNAs+for+angiogenic+polypeptides+basally+and+on+oestrogen+and+progesterone+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The isolation and long-term culture of normal human endometrial epithelium and stroma. Expression of mRNAs for angiogenic polypeptides basally and on oestrogen and progesterone challenges.</a> J Cell Sci. 108 (1), 323-331 (1995).</li>
<li>Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+cells+from+term+human+decidua+closely+resemble+endometrial+stromal+cells%3A+induction+of+prolactin+and+insulin-like+growth+factor+binding+protein-1+expression%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression).</a> Biol Reprod. 52, 609-615 (1995).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+and+progesterone+receptor+cross-talk+in+human+endometrium%3A+a+decidualizing+affair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP and progesterone receptor cross-talk in human endometrium: a decidualizing affair.</a> J Endocrinol. 178, 357-372 (2003).</li>
<li>Marsh, M. M., Hampton, A. L., Riley, S. C., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+endothelin+released+by+human+endometrial+epithelial+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of endothelin released by human endometrial epithelial cells in culture.</a> J Clin Endocrinol Metab. 79, 1625-1631 (1994).</li>
<li>Siegfried, J. M., Nelson, K. G., Martin, J. L., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+identification+of+cultured+cells+from+human+endometrium%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Histochemical identification of cultured cells from human endometrium.</a> In Vitro. 20, 25-32 (1984).</li>
<li>Rawdanowicz, T. J., Hampton, A. L., Nagase, H., Woolley, D. E., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+production+by+cultured+human+endometrial+stromal+cells%3A+identification+of+interstitial+collagenase%2C+gelatinase-A%2C+gelatinase-B%2C+and+stromelysin-1+and+their+differential+regulation+by+interleukin-1+alpha+and+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase production by cultured human endometrial stromal cells: identification of interstitial collagenase, gelatinase-A, gelatinase-B, and stromelysin-1 and their differential regulation by interleukin-1 alpha and tumor necrosis factor-alpha.</a> J Clin Endocrinol Metab. 79, 530-536 (1994).</li>
<li>Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+11+advances+progesterone-induced+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Mol Hum Reprod. 8, 636-643 (2002).</li>
<li>Sakai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+histone+acetylation+in+ovarian+steroid-induced+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Involvement of histone acetylation in ovarian steroid-induced decidualization of human endometrial stromal cells.</a> J Biol Chem. 278, 16675-16682 (2003).</li>
<li>Logan, P. C., Ponnampalam, A. P., Steiner, M., Mitchell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cyclic+AMP+and+estrogen%2Fprogesterone+on+the+transcription+of+DNA+methyltransferases+during+the+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of cyclic AMP and estrogen/progesterone on the transcription of DNA methyltransferases during the decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Mol Hum Reprod. 19, 302-312 (2013).</li>
<li>Tamura, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+IGFBP-1+expression+by+cAMP+is+associated+with+histone+acetylation+status+of+the+promoter+region+in+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Induction of IGFBP-1 expression by cAMP is associated with histone acetylation status of the promoter region in human endometrial stromal cells.</a> Endocrinology. 153, 5612-5621 (2012).</li>
<li>American Society for Reproductive Medicine: Quick facts about infertility. , Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.asrm.org/detail.aspx?id=2322">http://www.asrm.org/detail.aspx?id=2322</a> (2013).</li>
<li>Salker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+selection+of+human+embryos%3A+impaired+decidualization+of+endometrium+disables+embryo-maternal+interactions+and+causes+recurrent+pregnancy+loss%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Natural selection of human embryos: impaired decidualization of endometrium disables embryo-maternal interactions and causes recurrent pregnancy loss.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Diğer gruplar kolajenaz 4,12,13,15-18 kullanan çoğu endometriyal stromal kültürleri, hazırlanması için bir yöntem tarif adapte edilmiştir. Bu yazıda, ekonomik nedenler ve tripsin ve / veya jilet uygun kullanılabilirliği için bizim laboratuvarda tarafından kullanılan her ikisi de iki basitleştirilmiş temel endometrial stromal kültür yöntemleri için metodoloji ve kanıt sağladı. Bizim iki yöntem kıyaslarken, hem başarıyla uygulanabilir birincil kültürleri üretmek. Daha küçük bir numu...

Insan uterus gövdesi üç tabakadan, perimetrium (ya da salgılı zarı), myometrium ve endometrium oluşur. Bu tabakaların her biri ayırt endometrial hücre serilerini kurmak için önemli bir adımdır. Perimetrium rahim en dış tabaka ve ince, seröz hücrelerden oluşur. Myometrium kalın, orta rahim tabakası ve yumuşak kas hücrelerinin oluşur. Endometrium rahim iç tabaka olarak tanımlanmıştır ve epitel ve stromal hücre popülasyonları içerir. Endometrium ayrıca olan kök hücre popülasyonunun yaklaşık olarak her 28 günde bir 1 functionalis tabaka yeniden doldurmak için hipotezi basalis tabaka halinde bölünmüştür. İnsan endometrium tabakası functionalis hormonları dolaşan yanıt önemli biyokimyasal ve morfolojik değişikliklere uğrar. Bu hormonlar hipofiz bezi ve yumurtalıklar türetilir. bir üreme döngüsü koordine üretim ve hormonlar sonuçların serbest. Üreme döngüsü potansiyel embriyo implantasyon olaylar için endometrium hazırlamak için tasarlanmıştır. İnsanlarda, üreme döngüsü &quot;adet döngüsü&quot; olarak bilinen ve üç evreye ayrılır - çoğalma, salgı ve adet. Salgı faz functionalis olgunlaşması ile işaretlenmiş ise çoğalma fazı functionalis endometrial tabakanın proliferasyonunu içerir. Spesifik olarak, hücre dışı değişiklikler, salgılar ve hücresel farklılaşma potansiyel implantasyonu işaret etmektedir. Implantasyon salgı aşamasının bitiminden önce oluşmazsa, functionalis endometrium tabakası adet aşamasında dökülüyor. Âdet ve functionalis tabakasının dökülmesini tetikleyen olayların önemi hala tartışılmaktadır. İnsanlarda, bu adet bilinen özel bir orta salgı faz farklılaşması olayın sonucu olduğunu ortaya edilmiştir&quot;spontane sidualizasyonu&quot; 2 olarak. Bu yazıda, iki endometrial stromal hücre izolasyon yöntemleri için detaylı metodoloji sağlamak ve bu yaklaşımların etkinliğini göstermek için immünofloresans ve dijital görüntülerin bir arada kullanın. Ayrıca, yaygın olarak uygulanır endometriyal stromal hücre izolasyonu teyit etmek için kendiliğinden desidualizasyon in vitro modelde kullanılan a.

<table><tbody><tr><td>0.25 Tripsin veya% 0.05 Tripsin&nbsp;</td><td>Hidroklon</td><td>SH3023602 veya SH30004202</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mikro Santrifüj Tüpü&nbsp; &nbsp;</td><td>Genesee Bilimsel</td><td>22-272A</td><td></td></tr><tr><td>1 &mikro; L, 20 ve mikro; l, 200 ml ve 1.000 &mikro; l Pipet ve nbsp; &nbsp;</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-401,24-402, 24-412, 24-430</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Konik Tüp&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Konik Tüp&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Hücre Kültürü Kabı&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>12-556-002</td><td></td></tr><tr><td>8 kuyulu Oda&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-4162</td><td></td></tr><tr><td>Asetat ve nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>C4-100</td><td></td></tr><tr><td>AMV RT Enzim / Tampon&nbsp;</td><td>Bio Labs</td><td>M077L</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1605-100</td><td></td></tr><tr><td>Tamponlu Çinko Formalin&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>59201ZF</td><td></td></tr><tr><td>Kömür şeridi FBS&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>NC9019735</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Kapak kayması&nbsp;</td><td>Fisher Marka</td><td>12-544D</td><td></td></tr><tr><td>Döngüsel AMP (cAMP)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B7880</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Yüksek Glikoz&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30243FS</td><td></td></tr><tr><td>dNTP&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Anti Keçi -TRITC&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-3855</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Serumu&nbsp;</td><td>Jackson'ın s lab</td><td>017-000-002</td><td></td></tr><tr><td>E Kaderin Antikoru&nbsp; &nbsp;</td><td>Epitomik</td><td>1702-1</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-1</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-600-511</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone Amfoterisin B&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH Probu&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>HS99999905</td><td></td></tr><tr><td>Glikojen&nbsp;</td><td>5Prime</td><td>2301440</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti Fare - FITC&nbsp;</td><td>Jackson'ın s Lab</td><td>115-096-003</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin&nbsp; &nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Medroksiprogesteron asetat (MPA)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M1629</td><td></td></tr><tr><td>MeOH (Metanol)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4-08-1</td><td></td></tr><tr><td>Montaj Ortamı (DAPI ile)&nbsp;</td><td>Vektör Labratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>N6 DNA Oligos&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Number 15 Sıyırıcı&nbsp; &nbsp;</td><td>BD</td><td>371615</td><td></td></tr><tr><td>Pan Sitokeratin&nbsp; Fare mAB&nbsp;</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>4545</td><td></td></tr><tr><td>PBS (fosfat tamponlu salin)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-399-4</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin Glutamin Çözeltisi 100X&nbsp; &nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SV30082.01</td><td></td></tr><tr><td>PML Anti Keçi Anti vücut&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9862</td><td></td></tr><tr><td>Astar(lar)&nbsp;</td><td>Eurofins</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI&nbsp;</td><td>Hiplon</td><td>SH30027FS</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (Fenol içermez)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11835</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Yeşil&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-4162</td><td></td></tr><tr><td>Takman&nbsp;</td><td>Termo</td><td>AB-4138</td><td></td></tr><tr><td>Trizol&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin Antikoru&nbsp;</td><td>Epitomik</td><td>4211-1</td><td></td></tr></tbody></table>

histerektomi Örneklerden İlköğretim İnsan endometrial stroma hücrelerinde kurulması İçin İki yöntem

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Pek çok çabalar vitro hücre kültür sistemleri kurmak için tahsis edilmiştir. Bu sistemler, in vivo işlemler geniş bir model numarası tasarlanmıştır. İnsan endometriyal örnekleri kaynaklanan hücre kültürü sistemleri bir istisna vardır. Uygulamalar normal siklik fizyolojik süreçler böyle jinekolojik kanserler, bulaşıcı hastalıklar ve üreme eksiklikleri gibi endometrial patolojilerin değişir. Burada, biz, cerrahi rezeksiyon, endometrial histerektomi örneklerden birincil endometrial stromal hücreler kurmak için iki yöntem sağlar. İlk yöntem, &quot;kazıma yöntemi&quot; olarak adlandırılır ve ikinci yöntem adlandırılır ise, cerrahi ya da tıraş bıçakları kullanılarak, mekanik kazıma içeren bir &quot;tripsin yöntemi.&quot; Bu ikinci yöntem, hücrelerin ayrılmasını teşvik etmek için birincil ve tripsin enzimatik aktivitesini kullanır hücre akıbet. Biz dijital görüntü ve mikroskobu ile adım-adım yöntemi açıklamak. Ayrıca providkantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonları (qPCR) ve immünfloresansta (IF) üzerinden endometrial stromal hücre hatları doğrulamak için e örnekleri.

Protokol bölümünde vurgulandığı gibi, insan doku kullanımı ve hazırlarken tüm kurumsal hükümet altında yöntemleri ve etik kurallara yapmak için emin olun. &quot;Kazıma yöntemi&quot; genel iş akışı bir örnek (Şekil 1A) ve primer endometrial kültürleri kurmak için kullanılan &quot;tripsin metodu&quot; (Şekil 1B) bu yazının da dahildir. Bu yöntemler Protokol bölümünde ayrıntılı olarak tarif edilmiştir (parça 1 e bakınız -. 3..)...

Histerektomi örneklerden primer endometrial stromal hücre kültürü sistemlerinin kurulması, önceki araştırma amaçlayan geniş bir dizi takip için değerli bir biyolojik teknik ve çok önemli bir adımdır. Burada, insan hasta cerrahi olarak kesilmiş dokuları endometriyal stromal kültürleri oluşturmak için kullanılan iki yöntem tarif eder.

Histerektomi Örneklerden İlköğretim İnsan endometrial stroma hücrelerinde Kurulması İçin İki Yöntem

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

Bu prosedürün genel amacı, rezeke edilmiş histerektomi örneklerinden primer endometrial stromal hücre kültürleri oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle endometrial doku bölümünü izole etmek için rahim katmanlarının ayırt edilmesi ve ayrıştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise, kazıma (scraping) yöntemi kullanıldığında, kazıma ve tripsinleme yöntemleri arasından bir hücre izolasyon tekniğinin seçilmesidir.Endometrial stromal hücreleri ayırmak ve ayrıştırmak için mekanik kuvvet ve kazıma yöntemleri kullanılır. Alternatif olarak, tripsin yöntemi kullanıldığında, endometrial stromal hücreleri ayırmak ve ayrıştırmak için tripsinin enzimatik aktivitesinden yararlanılır. Son olarak, hücre büyümesini ve morfolojisini gözlemlemek için mikroskopi kullanılırken, endometriyum stromal kültürlerini doğrulamak için makalede tartışılan diğer tekniklerden yararlanılır.Bu yöntem, üreme döngüsü ve menstrüasyon gibi üreme alanı olgularındaki temel fizyolojik soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu çalışmada kullanılan histerektomi örnekleri, I-R-B-H-S-R 1 4 4 2 4 numaralı üniversite IRB onaylı etik protokolle uyumlu olarak toplanmıştır. Hasta kaynaklı dokuyu, örnek işleme alınmadan önce 24

two-methods-for-establishing-primary-human-endometrial-stromal-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu videoda, birincil insan mezotelyal hücrelerini insan omentum örneğinden izole etmek için kullanılan protokol açıklanmaktadır. Mezotelyal hücreler, yumurtalık kanseri hücresi yapışmasını, invazyonunu ve proliferasyonunu araştırmak için in vitro yumurtalık kanseri modeli oluşturmak için kullanılabilir.

Mezotelyal Hücre İzolasyonu: İnsan Omentum Dokusu Örneğinden Birincil Mezotelyal Hücreleri İzole Etme Tekniği

Bu çalışma, bir katı klinik örneklerden birincil yumurtalık kanser hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için ayrıntılı bir yöntemi tarif etmektedir. Yumurtalık kanseri klinik örnekler alt uygulamalar için son derece uygun olan uygun bir, fibroblast içermeyen epitelyal yumurtalık kanseri (EOC) hücreleri elde etmek için enzimatik sindirme tabi tutulur.

Katı Örneklerinin From İlköğretim Yumurtalık Kanseri Hücreleri alma için yöntem

Burada, yumurtalık kanseri hücresi adezyonunu, invazyonunu ve proliferasyonunu araştırmak için bir araç olarak, birincil insan mezotelyal hücreleri ve hücre dışı matris ile katmanlanmış fibroblastlardan oluşan periton boşluğunun astarının üç boyutlu bir in vitro modelini oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

İnsan periton boşluğuna bir Organotipik Kültür Yumurtalık Kanseri Yaygınlaştırılması Erken Adımlar Modelleme

Bu çalışma, in vitro desidualizasyon çalışma için Coculture sisteminde kullanılabilen birincil fare, endometriyal stromal ve epitelyal hücrelerin izolasyonu ve kültürü, bir standart ve geçerli bir yöntem sunulur.

Fare Endometrial stromal ve epitelyal hücrelerin izolasyonu için<em&gt; İn Vitro</em&gt; sidualizasyonu

Bu çalışmada yalıtım ve kültür vitro decidualization tahlil yapmak için insan endometrium stromal hücre için doğrulanmış ve en iyi duruma getirilmiş bir yordam sunar. Ayrıca, bu çalışmada çift insan endometrium stromal hücreler kullanarak belirli bir gen için verimli bir şekilde devirme detaylı bir yöntem sağlar.

Vitro Decidualization için insan endometrium Stromal hücre izolasyon

Bu metodolojinin amacı, kanser hücre hatlarındaki kanser kök hücrelerini (CSC) ve primer insan tümör örneklerini küre oluşturma protokolü ile sağlam bir şekilde, fonksiyonel tahliller ve akış sitometrisi ve Batı ile henotypik karakterizasyon kullanarak tanımlamaktır. Leke.

Jinekolojik ve Meme Kanseri Tümörlerinden Kanser Kök Hücre Kürelerinin Alınması

Epitel ve stromal hücrelerden oluşan ve yerli endometrial dokunun özelliklerini koruyan insan primer endometriyal organoidler oluşturmak için bir protokol sunulmuştur. Bu protokol, rahim dokusu alımından endometrial organoidlerin histolojik işleme yöntemlerini açıklamaktadır.

Multicellular Human Primer Endometrial Organoidlerin Üretimi

Bu protokol, gen ekspresyonu ve histolojik analizler için fare endometriyal epitel organoidlerini oluşturma metodolojilerini açıklamaktadır.

Fare Rahiminden 3D Endometriyal Organoidlerin Kurulması

Bu protokol, primer fibroblastları premenopozal veya postmenopozal insan vajinal dokusundan izole etmek için güvenilir ve etkili bir teknik göstermektedir. Vajinal fibroblast izolasyonu için mevcut protokoller, yaşlanan dokudan hücre izolasyonunun zorluklarını dikkate almamaktadır. Pelvik organ prolapsusu ameliyatı sonrası kadınlardan vajinal doku elde edildi.

İnsan Vajinasından Primer Fibroblastların Doku İşlenmesi ve İzolasyonu

Protokol, üç boyutlu (3D) baskılı bir iskele ile iki tür yapışık hücre hattının biyolojisini özetleyebilen yeni bir in vitro deneysel modeli göstermektedir. Bu modelin inşası ve hücre hazırlığı ve hücre kültüründen analiz ve değerlendirmeye kadar işletme prosedürleri açıklanmaktadır.

İki Tip Yapışık Hücre Hattı Kullanan Ko-Kültür Modeli

Keşfedin histerektomi örneklerinden primer endometrial stromal hücre kültürü kurma yöntemlerini. Kazıma ve tripsin teknikleri ile hücre izolasyonu ve qPCR ile doğrulama süreçlerini öğrenin.

Histerektomi Örneklerden İlköğretim İnsan endometrial stroma hücrelerinde Kurulması İçin İki Yöntem

Daha fazla video keşfet