Histerektomi Örneklerden İlköğretim İnsan endometrial stroma hücrelerinde Kurulması İçin İki Yöntem

Bu prosedürün genel amacı, rezeke edilmiş histerektomilerden primer endometriyal stromal hücre kültürleri oluşturmaktır. Bu, önce endometriyal dokunun bir bölümünü izole etmek için uterus katmanlarının ayırt edilmesi ve ayrılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, kazıma yöntemini kullanırken kazıma ve tryin yöntemleri arasında bir hücre izolasyon tekniği seçmektir.

Mekanik kuvvet ve kazıma, endometriyal stromal hücreleri ayırmak ve ayırmak için kullanılır. Alternatif olarak, tripsin yöntemini kullanırken, tripsinin enzimatik aktivitesi endometriyal stromal hücreleri ayırmak ve ayırmak için kullanılır. Sonuç olarak, mikroskopi hücre büyümesini ve morfolojisini gözlemlemek için kullanılırken, makalede tartışılan diğer teknikler endometriyal stromal kültürleri doğrulamak için kullanılır.

Bu yöntem, üreme alanındaki temel fizyoloji sorularının yanıtlanmasına yardımcı olabilir: üreme döngüsü ve menstrüasyon gibi fenomenler, bu yazıda kullanılan histerektomi örnekleri, 1, 4, 4, 2, 4 numaralı I-R-B-H-S-R numaralı bir üniversite IRB onaylı etik protokole uygun olarak toplanmıştır. Hastadan türetilen dokuyu, numune işlenmeden önce en fazla 24 saat boyunca dört santigrat derecede yüksek glikozlu RPMI veya DMEM içeren 50 mililitrelik bir tüpte tutun. Başlamaya hazır olduğunuzda, doku örneğini bir XPBS ile üç kez yıkayın ve her yıkama arasında çözeltiyi atın.

Daha sonra doku örneğine %10 FBS ve %1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş dört ila 10 mililitre büyüme ortamı ekleyin. Ayrıca, mililitre başına 0.25 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona bir mantar bölgesi ekleyin ve 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, büyüme ortamını atın ve dokuyu bir XPBS ile iki kez yıkayın.

Dokuyu altı santimetrelik bir hücre kültürü plakasına yerleştirin ve bu görüntüleri kılavuz olarak kullanarak endometriyum tabakasını tanımlayın. Daha sonra endometriyumu ayırın ve diğer doku katmanlarını ileride kullanmak üzere saklayın. Hücre kültürü kabına çizerken dokuyu küçük parçalara ayırmak için bir neşter veya tıraş bıçağı kullanın.

Çizikler, ortaya çıkan primer endometriyal stromal hücrelerin bağlanmasını kolaylaştırır. Daha sonra, çizilmiş tabağa yavaşça iki mililitre büyüme ortamı ekleyin. Bu aşamada, doku parçaları kaşıma hareketinden görünür ve hareketsiz hale gelecektir.

Kontaminasyonu önlemek için çanağı diğer hücre hatlarından ayrı olarak belirlenmiş bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Işık mikroskobu kullanarak hücreleri günlük olarak izleyin. Her üç günde bir iki veya üç günde bir dilimlenmiş dokudan çıkan küçük hücre popülasyonlarını arayın.

Eski ortam yıkama kültürlerini bir XPBS ile nazikçe çıkarın ve ardından iki mililitre taze büyüme ortamı ekleyin. Dört mililitre büyüme ortamı eklemeye başlayın. Yıkama adımları sırasında proliferasyon hızı arttığında, kalan doku parçalarını aspire edin.

Dokudan yeni kolonilerin ortaya çıkması pek olası değildir. Bir haftalık büyüme geçişinden sonra, hücreler% 0.05 tripsin kullanır. Hücreler %75 ila %80 arasında bir co-akıcılığa ulaştığında, bir hücre plakasını dondurur.

İki veya üç plaka korunduktan sonra, birincil hücreler süresiz olarak geçilemez. Tripsin aracılı izolasyona başlamak için, mililitre başına 0.03 miligram ile desteklenmiş iki mililitre% 0.25 Tripsin içeren konik bir tüpe küçük bir endometriyal doku parçası yerleştirin. Misin daha sonra dokuyu 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede dönen bir platformda inkübe edebilir mi?

Daha sonra, dokuyu kısaca girdaplayın ve daha sonra iki dakika boyunca 200 ila 400 kez G'de santrifüjleyin, süpernatanı atın ve taze tripsin ekleyin. Ve misin daha sonra dokuyu dönerken bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edebilir. İnkübasyondan sonra, dokuyu beş ila 10 saniye boyunca girdaplayın.

Ardından% 10 FBS ve% 1 penisilin streptomisin içeren iki mililitre büyüme ortamı ekleyin. Tripsini devre dışı bırakmak için, hücreleri iki ila üç dakika boyunca 200 ila 400 kez G'de santrifüjleyin. Ardından süpernatanı atın ve hücre peletini yeniden süspanse edin.

İki mililitre büyüme ortamında, hücre süspansiyonunu altı santimetrelik bir hücre kültürü kabına yerleştirin ve birincil hücrelerin bağlanmasını arttırmak için plakayı kazıyın. Hücre büyümesini günlük olarak bir ışık mikroskobu ile izleyin ve büyüme ortamını her iki ila üç günde bir değiştirin. Hücreler %75 ila %80'lik bir koaktenliğe ulaştığında, endometriyal stromal hücreleri izole etmek için %0.05 veya %0.25 tripsin kullanın.

Kazıma yöntemini kullanmak, erken ortaya çıkan hücrelerin kümelerini oluşturur. Neşterin neden olduğu çizikler boyunca, endometriyal stromal hücreler fibroblast morfolojileri ile tanımlanabilir. Tripsin yöntemi, kazıma yönteminden daha uzun bir hazırlık süresine sahiptir, ancak canlı hücreler daha erken gözlenir.

Tryin yöntemi ayrıca hem kümelenmiş hem de dağılmış büyüme modellerine sahip hücreler üretir. Endometriyal stromal hücreler için dokuya özgü bir belirteç henüz keşfedilmemiştir. Endometriyal stromal hücrelerin tanımlanmasının bir yolu, bir markörün kaybının ölçülmesidir.

Sitokeratin gibi epitel hücreleri için. Sitokeratin eksikliği, endometriyal epitel hücrelerinin yokluğunu gösterir. İkinci pasaja kıyasla beşinci pasajda gözlenen sitokeratin lekelenmesinin kaybı, epitel hücrelerinin yokluğunu doğrular.

Endometriyal stromal hücrelerin varlığına dair fonksiyonel kanıt, bir hücre giderme testi kullanılarak sağlanabilir. CAMP ve hidroksi progesteron asetat ile tedaviye yanıt olarak prolaktin ve insülin benzeri büyüme faktörü bağlayıcı protein birdeki artış, endometriyal stromal kültürün başarılı bir şekilde kurulduğunu gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, rezeke edilmiş histerektomilerden primer endometriyal stromal hücre kültürlerinin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.