Name: In Vitro toplama Deneyler hiperfosforile tau proteini kullanılarak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Öğrenin hiperfosforile tau proteininin in vitro agregasyon kinetiğini tiyoflavin floresansı ile izlemeyi. Bu yöntem, Alzheimer hastalığındaki tau fibrilasyon mekanizmalarını anlamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (AG039768) tarafından MHK'ya desteklenmiştir. Enstrümanları cömertçe sağladıkları için Dr. Thomas Sharkey ve Honggao Yan'a ve teknik yardım için Sean Weise ve Yan Wu'ya teşekkür ederiz.

Reaktifler 1. Hazırlık <ol><li> Agregasyon tamponu hazırlayın (20 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCI, 1 mM EDTA). Ay için oda sıcaklığında kararlı saklayın. Kullanımdan önce 1 mM ditiotreitol (DTT), Supplement. Not: HEPES bazlı tampon maddesi (10 mM HEPES, pH 7.5, 0.1 mM EDTA, 5 mM DTT) içinde, aynı zamanda tau toplanmasının içindeki sonuçlar verir. </li><li> T Thioflavin ya da 0.22 um&#39;lik steril bir filtre birimi S stok (agregasyon tamponu içinde çözülmüş 3 mM) solüsyonu ve filtre Thioflavin hazırlayın. Ay, alüminyum folyo ile kararlı kapalı bir tüp içinde -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> (300 uM, toplama tamponu içinde çözülmüş), heparin stok çözelti hazırlayın. -20 ° C&#39;de saklayın, ay boyunca stabildir. </li><li> (Su içinde çözülmüş 1 M,), ditiotreitol (DTT) stok hazırlayın. 1.5 ml tüpler içine kısım. -20 ° C&#39;de saklayın. Agregasyon deneyleri önce oda sıcaklığında 1 M çözelti eritin. Bu 1,000x stoktan deiyonize su ile stok çalışan 100 mM&#39;lik bir kısım hazırlar. Buz üzerinde bırakınhazır olana kadar. </li><li> ° C derin dondurucuda -80 tau çıkarın. Buz üzerinde eritin. Agregasyon tamponu ile önceden belirlenmiş bir konsantrasyona tau ayarlayın. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 20,800 x g&#39;de bir mikrosantrfuj spin önceden oluşturulmuş büyük topaklar kaldırın. Bu ön-iplik adım protein hazırlık her parti sonraki floresan ölçümü tutarlılık artırır. Başka bir tüp süpernatant aktarın; toplama reaksiyonu monte hazır olana kadar buz üzerinde bırakın. </li></ol> 2. Hayır-boya, Terminal Deneyi NOT: Bu deneyde agregasyon reaksiyonu floresan boya yokluğunda yapılır. Tüm bileşenler karıştırıldıktan sonra reaksiyon, önceden belirlenmiş zaman noktalarında için devam etmesine izin verilir. Saatlik numuneleri daha sonra çekiş reaksiyonu üzerinden alındı ​​ve ThT veya flüoresan okumadan önce bağlayıcı amiloid ths ile karıştırılır. toplama reaksiyonun ilk hacmi gerekli zaman noktalarının sayısına bağlıdır. Bu yaklaşım requ olabilirtau proteininin çok miktarda ire, ancak basit, hızlı ve florometre veya bir çoklu-çukurlu tabla okuyucusu (Tartışma) yapılabilir. Aşağıda adım adım operasyon, bir floresan ölçümü için ISA SPEX FluoroMax-2 kompakt spektrofotometreyi kullanarak. <ol><li> Tablo 1 &#39;deki gibi 1.5 ml Eppendorf tüpler içinde, agregasyon karışımı ayarlayın. Her bir sütun, bir zaman noktası ölçümü için yeterli olan bir 100 ml&#39;lik bir reaksiyon için ihtiyaç duyulan bileşenleri temsil eder. Özellikle deney için gereken zaman noktalarında dayalı tüm toplama karışımı için miktarını ayarlayın. Hata pipetlenmesinden yer vermek için her bir bileşenin ek% 10 ekleyin. Burada gösterilen tipik reaksiyon heparin ihtiva eden arakidonik asit ya da agregasyon tamponu ile ikame edilmiş olabilir. Reaksiyon karışımına 1 mM DTT ekleyin. Tüm reaksiyon birden fazla gün sürerse, bir indirgeyici ortam sağlamak için taze DTT gün (1 mM) tamamlar. </li><li> Karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin. Pla37 ° C inkübatör ya da su banyosu içinde, her reaksiyon ce. Ajitasyon tau toplama için gerekli değildir. </li><li> Floresan ölçüm önce, (bilgisayar sonra, ilk lamba) spektroflorometre açın. NOT: hemen kullanılabilecek ksenon ark lambası. Ancak, en iyi sonuçlar makine floresan okumadan önce yaklaşık 10 dakika ısıtın. </li><li> Bilgisayarda yazılımı başlatın. <ol><li> 510 nm (5 nm yarık) için Enstrüman Kontrol Merkezi&#39;nde Gerçek Zamanlı Görüntü modu, (2 nm yarık) 450 nm ayarlanmış dalgaboyu ve emisyon dalga boyu seçin. Kapat Gerçek Zamanlı Görüntü modu penceresi Enstrüman Kontrol Merkezi&#39;ne dönmek için. </li><li> Dalga boyu setleri eklemek için üst çerçevede Sabit Dalgaboyu Analizi, Ekle tuşuna basın &gt;&gt; tuşuna seçin. 1 Standart Hata Set satın alma parametreleri ve 3 Maksimum Denemeler, ardından Ekle&#39;yi tıklatın. ! Git tıklatın Veri Ekran açmak içinpenceresi. </li><li> Veri Görüntüleme penceresinde, Yeni Numune iletişim kutusunu açmak için Başlat ACQ tıklayın. Numune türü için &quot;bilinmeyen&quot; seçiniz. </li></ol></li><li> Her 100 ul çekiş karışımına, 98 ul tampon maddesi birikme ve T. Pipet karıştırmak için birkaç kez, 3 mM Thioflavin 2 ul ekle. </li><li> Bir küvete (FCA3, dış boyut, WxLxH = 12,5 mm x 12.5 mm x 45 mm) tüm karışımı aktarın. Numune-bölmeye örnek tutucuya küvet yerleştirin ve kapağını kapatın. Floresan veri toplamak için Çalıştır&#39;ı tıklatın. Verileri kaydetmek. </li><li> Küvet çıkarın ve çözüm süzün. Distile su 3 kat küvet durulayın. Ve küvet dışarıdaki havayı üfleyerek kuru. </li></ol> Ile-boya 3. SpectraMax M2 Plaka Reader Sürekli Modu Deneyi NOT: Bu deney, bir floresan boya ThT veya ths agrega dahil olması ile, bir öncekinden farklıdıryon reaksiyonu. Bu reaksiyonlar aynı seti sürekli ölçülmesini sağlar. (SpectraMax M2 çalışması aşağıda gösterildiği gibi) için reaksiyon tekrar kullanılması, bu yöntem, daha iyi bir otomatik, çok oyuklu bir plaka okuyucu ile yapılır. Düzenli florimetre de çalışır ama hızlı toplama reaksiyonların ölçüm sıklığı nedeniyle operasyon manuel doğası, biraz sınırlı. <ol><li> (96-çukurlu, düz siyah levha, iyi ses düzeyini 360 ul, düz taban kısmı), Tablo 2 de olduğu gibi, bir 96-çukurlu plaka içindeki agregasyon karışımı ayarlayın. Her sütun biri için yeterli olan bir 200 ml&#39;lik bir reaksiyon için ihtiyaç duyulan bileşenleri temsil eder zaman noktası ölçümü. Birkaç kez pipetleme iyice karıştırın. Deneyler boyunca her gün taze 1mM DTT Supplement. </li><li> 37 ° C&#39;de 96-çukurlu plaka inkübe edin. </li><li> Floresan ölçümü öncesinde her bir zaman noktasında, çok modlu mikroplaka okuyucusu ve bilgisayarı açın. Ma için yeterli zaman tanıyınmakina, yaklaşık 10 dakika stabilize etmektir. </li><li> Bilgisayarda yazılımı başlatın. 37 ° C sıcaklık ayarlama ve floresan yoğunluğu (FI-en oku) modunda, 510 nm, 450 nm ve emisyon dalga boyuna ayarlanmış olan uyarım dalga boyunu seçin. </li><li> Çekmece içine 96-plaka takın ve ölçümü başlatmak için OKU tuşuna basın. </li><li> Okuduktan sonra, plaka kaldırmak ve 37 ° C inkübatör geri dönün. Veri analizi ve komplo için bir Excel elektronik veri kopyalayın ve yapıştırın. </li></ol> 4. ile-boya, Sürekli Modu Deneyi bir Kompakt spektroflorometre üzerinde <ol><li> Tablo 3 deki gibi 1.5 ml Eppendorf tüpler içinde, agregasyon karışımı ayarlayın. Her bir sütun, bir zaman noktası ölçümü için yeterli olan bir 200 ml&#39;lik bir reaksiyon için ihtiyaç duyulan bileşenleri temsil eder. </li><li> Karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin. </li><li> Spektroflorometre açın ve adımları 2.3 ve 2.4 gibi yazılım ayarlayın. </li><li> Bütün karışım, t aktarınoa küvet. Numune-bölmeye örnek tutucuya küvet yerleştirin ve kapağını kapatın. Floresan veri toplamak için Çalıştır&#39;ı tıklatın. Verileri kaydetmek. </li><li> Veri Çalıştır&#39;ı tıklatarak ve kayıt uygun aralıklarla okumaya devam edin. Toplama bir yüksek frekansta (örneğin, her 30 veya 60 sn) olarak izlenecek ise, ya ölüm bitene kadar makinenin küvete ve tepkiyi bırakın, ya da tepkiler veya küvetler takas için yeterli zamanı olduğunda. </li><li> Küvet çıkarın ve çözüm süzün. Distile su 3 kat küvet durulayın. Ve küvet dışarıdaki havayı üfleyerek kuru. </li></ol>

Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.

Bu protokol, farklı tahlil koşulları ve fosforilasyon-bağımlı hızlı tau toplama kinetik tespit aletleri gösterir. Terminal deneyde, floresans boya ThT her zaman noktasında ana karışımı çıkarılır reaksiyonun bir kısmına ilave edilir. Amiloid floresan sonra 26 ölçülür kaynaklı bağlanma. İkinci olarak, birlikte-boya modunda, tau agregasyonu tau topluluklarının büyüme gerçek-zamanda değerlendirilmesi için uygun bir reaksiyon, bu tür işleme, ThT veya ths mevcudiyetinde gerçekleştirilir. Bu yöntemlerin her biri ken...

(AD), Alzheimer hastalığı tauopatıler olarak bilinen nörodejeneratif hastalıkların geniş bir koleksiyon biridir. Özetin özeti patoloji yatan tauopathy nöronlar, astrositler ve mikroglia 1-4 nörofibrillerin, NFTler vardır. NFT yoğunluk kognitif bozukluk 3,5 ve nöron kaybı 6 ile ilişkilidir. NFT düz veya eşleştirilmiş sarmal filamanların (PHF) 7,8 oluşturur (bundan böyle &quot;s-tau&quot; olarak anılacaktır) temel olarak hiperfosforile tau proteinini içerir. Tau nöronal sinyalizasyon ve insan ticareti 9,10 için gerekli olan aksonal taşımacılığının kolaylaştırılması düşünülen bir mikrotübül ilişkili bir proteindir. Her tau molekülü 2 ila 3 normal beyin fosfat, ancak tauopathy hastalarda 11 birkaç kat fosforıl içerik artar içerir. Çoklu kinazlar GSK3 (glikojen sintaz kinaz 3β) ve CDK5 (siklin-de dahil olmak üzere, Tau hiperfosforizasyon&#39;un katkı muhtemeldirasılı kinaz 5) 12,13, ancak patolojik fosforizasyonundan doğrudan tetik zor 14 kalır. Veya mikrotübül bağlanma motifleri yakınındaki anormal fosforilasyon mikrotübül 15 gelen tau ayırır ve p-tau sonunda, NFT inklüzyonlar içine polimerize olabilir, düz veya eşleştirilmiş sarmal filamanlar halinde oligomerizes somatodendritik bölmesi yerine tau yanlış lokalizasyon neden olur. tau hiperfosforilasyon, NFT oluşumu ve nörodejenerasyonda arasındaki yakın bağ p-tau yumaklar apoptotik ve diğer sitotoksik tepkiler, ve böylece tauopathy nörodejenerasyonda 16,17 altında yatan nedeni olduğunu bir yaygın hipotezine yol açtı. Bu öncül dayalı ilaç ekranları ve erken klinik testler 18 başlatılmıştır. Ancak, bu hipotez zorluklarla 19,20 karşıyadır. Örneğin, SantaCruz ve diğ., Transgenik farelerin bilişsel işlevler bir mutant ekspresyonunu bastırmak suretiyle geliştirilebilir gösterdiNFTler mevcut tau molekülleri 21 oluşturmak için devam olsa insan tau. Bir Drosophila modelinde, NFT temel nöron hücreleri 22,23 korumak için toksik sitosolik tau tecrit gösterilmiştir. Açıktır ki, NFT patogenezi rolü, eğer varsa, çok tauopathy terapötik geliştirme yönünde etkileyecektir. Birkaç β-tabaka tercih edilen floresan boyalar, elektron mikroskobu, ışık saçılması spektroskopisi 24-27 bağlanması ile gösterildiği gibi, yüksek konsantrasyonlarda, yeniden birleştirici ya da normal beyin tau proteini içinde kendiliğinden yavaş yavaş, in vitro olarak, bir PHF-benzeri bir yapı haline polimerize eder. Ekleme heparin ya da arakidonik asit, insan beyninin bir miktarda yağ asidi, büyük ölçüde tau isoform- ve indükleyici, konsantrasyona bağımlı bir davranış 28-32 içinde PHF oluşumunu hızlandırır. Ilginç hiperfosforilize tau AD beyinlerinden saflaştırılmış veya in vitro fosforilasyon reaksiyonlarında ayrıntılı tarafından hazırlananDaha hızlı ve daha verimli bir ggregates 26,33-35. Bu sonuçlar p-tau patolojik rolleri ile mükemmel bir uyum içindedir. F-tau agregasyonu dayanan bir in vitro sistem, böylece, AD ilaç taraması için güçlü bir araç olarak hizmet edebilmektedir. Tau toplanması ve AD ilerici nörodejenerasyona arasındaki yakın ilişki, yanı sıra Aβ plak hedefleme ilaç geliştirme son yetmezliği, MS 36-38 başka önemli histolojik işaretleyici, tau toplama artıyor kontrol ilaçları keşfetmek ilgi göz önüne alındığında. Nitekim, çeşitli gruplar zaten birincil tahlil gibi in vitro tau toplama reaksiyonlarda kullanarak, farklı verim ilaç ekranları başladı. Bir kimyasal madde sayısı in vitro 39-42 tau agregasyonu üzerinde inhibe edici ya da tersine aktivite sergilediği bulundu. Ancak, mevcut tüm tau toplama regülatörü ekranlar fosfor anahtar patolojik işareti özlüyor değiştirilmemiş tau kullanınylation, AD tedavisinde bu bileşiklerin kullanıldığı özgüllük ve etkinliği için bir endişe yükselterek. Biyokimyasal karakterizasyonu AD ilaç taraması için çekiş tahlilleri geliştirilmesi önemli engellerden biri patofizyolojik ilgili hiperfosforile tau proteininin yeterli miktarlarda üretilmesidir. Tau 1N4R izoformu ve GSK-3β kinaz E. koeksprime edildiği Fermuarlar Destekli Kataliz sistemi kullanarak E. coli lösin zipper füzyon proteinleri olarak, bu sorunun üstesinden gelebilmek olan (. Sui ve arkadaşları, R.L. tau ve p-tau son ürünler için bakınız Şekil 1, aynı zamanda, p-tau ön kütle spektrometresi karakterizasyonu için 43 bakınız). Tau&#39;nun farklı fosforilasyon bölgeleri için özel dokuz bir antikorlar panelinin kaynaktan, pozitif sinyaller sekiz pozisyonda görülmüştür (veriler gösterilmemiştir). Aşağıda, biz toplama kinetik d ayırt edebilir protokolleri ve instrumentations tarifdeğiştirilmemiş tau ve p-tau türleri arasındaki ifferences. Bu testler amiloid (tau agrega) üzerine Tioflavin T (ThT) veya tioflavin S (THS) olarak floresan artışı 26 bağlayıcı ölçülen yayınlanan protokolleri modifiye edildi. İlk &quot;terminali&quot;, hiçbir boya yaklaşımı, toplama reaksiyonları monte edilir ve amiloid boya yokluğunda kuluçkaya. Farklı zaman noktalarında, her bir reaksiyonun bir tümböleni çıkarıldı ve tau toplulukları bağlamak için THT toplanmasını durdurmak ve izin vermek için ThT-içeren tampon eşit hacmi ile karıştırılmıştır. Floresans, bir IAP FluoroMax-2 florometre ile ölçülür. &quot;Ile-boya&quot; İkinci sürekli izleme deneyi, ThT veya THS toplama reaksiyonlarda yer almaktadır. Floresan elle tüm deney boyunca sürekli olarak ölçülür veya çok plaka okuyucu kullanarak olabilir. Buna ek olarak, sürekli ölçüm mo toplama için tau ve p-tau yakın bir fizyolojik konsantrasyon kullanan bir analiz tanımlamaktadırlarde. fosforilasyon etki hali hazırda farkedilebilir şekilde kalır. Aşağıda, biz adım adım operasyon prosedürlerini tanımlamak ve bu tahlillerin temsilcisi sonuçları gösterecektir. Her yaklaşımın artılarını ve eksilerini bazı Tartışma, yanı sıra potansiyel ilaç tarama uygulamaları takip edecek. Yüksek konsantrasyonda tau kendiliğinden amiloid benzeri yapılar halinde toplanır. Bununla birlikte, laboratuvarda tau fibrillization tipik haliyle bu tür teşvik ediciler olarak heparin (ortalama molekül ağırlığı 6000 g / mol) ve arakidonik asit ile hızlandırılır. Burada gösterilen örnek 30 uM heparin içerir. Tau amiloid birikintilerinin oluşmasının Tioflavin T (ThT) ile ya da S (ths) Thioflavin bağlayıcı amiloid elde edilen fluoresans ile izlenir. (:;: 485 nm tepe emisyon 450 nm eksitasyon) tau topluluklarının bağlanma üzerine, ThT floresans kırmızı kayma gösterir. Ths, diğer taraftan, amiloid bağlayıcı önce 510 nm&#39;de (450 nm&#39;de uyanm) zayıf emisyon vardır, ancak bu fluorescencBu tür birleştirilmiş tau 44 gibi önemli bir amiloid proteininin mevcudiyetinde E artar. Her iki boya da tau ve p-tau bağlantısını tespit iyi çalışır. Çünkü ThT (bakınız Şekil 2), güçlü ve nispeten geniş emisyon tepe, 510 nm&#39;de flüoresan biriminde sadece% 30 bir azalma vardır. Ya boya kullanırken kolaylık sağlamak için, biz tau izlemek için uyarma / emisyon dalga boylarında (yani, 450 nm / 510 nm) aynı kombinasyonunu kullanabilirsiniz. Tau agregasyonu deneyinin amacına ve tau proteininin mevcudiyetine bağlı olarak, boya varlığında veya yokluğunda yapılabilir. Reaksiyonların her ikisi de modları aşağıda gösterilmiştir. Tek-örneklem flüorometre (ISA-Spex FluoroMax-2) ve bir çok plaka okuyucu (SpectraMax M2) - Ayrıca, iki farklı araçların çalışmasını göstermektedir. Okuyucular kendi özel ihtiyaçlarını ve enstrüman kullanılabilirliğini uygun bu protokolleri adapte gerekir.

<table><tbody><tr><td>Trizma&nbsp; baz</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Macron İnce Kimyasallar</td><td>MAL-7581-06</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik Asit (EDTA)</td><td>İnvitrojen</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>Tiyoflavin T</td><td>Sigma</td><td>T3516</td><td>Karanlıkta saklanır</td></tr><tr><td>Thioflavin S</td><td>Sigma</td><td>T1892</td> Koyu heparin Sigma H3393'te <td>saklanır</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td>4 &°C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka</td><td>Corning</td><td>3917</td><td></td></tr><tr><td>ISA SPEX FluoroMax-2</td><td>Horiba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2 Çok Modlu Mikrolat Okuyucu Moleküler</td><td>Cihazlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fare Anti-Tau Monoklonal Antikor</td><td>R& D Sistemleri</td><td>MAB3494</td><td>&ndash adresinde saklanır; 80 derece > Ç</td></tr></tbody></table>

in vitro toplama deneyler hiperfosforile tau proteini kullanılarak

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Alzheimer hastalığı, hiperfosforile tau proteininin nörofibriler yumaklar (NFT'ler) şeklinde nöronal birikintileri ile kendini gösteren tauopatiler olarak bilinen büyük bir nörodejeneratif bozukluk grubundan biridir. NFT'nin yoğunluğu, bilişsel bozukluk ve diğer nörodejeneratif semptomlarla iyi bir şekilde ilişkilidir ve böylece tau agregasyonuna dayalı terapötikler geliştirme çabalarını teşvik eder. Bununla birlikte, şimdiye kadar, tau agregasyon testleri, patoloji ile ilişkili fosforilasyon işaretlerinden yoksun rekombinant veya sentetik tau kullanır. Burada, konu olarak rekombinant, hiperfosforile tau kullanan iki testi açıklıyoruz. Bu tahliller, hiperfosforile tau agregatlarının kinetiğini veya stabilitesini modüle edebilen bileşikler için yüksek verimli ekranlar için ölçeklendirilebilir. Alzheimer hastalığı ve diğer tauopatiler için yeni terapötikler, hiperfosforile tau izoformları kullanılarak potansiyel olarak keşfedilebilir.

Rekombinant tau ve p-tau (Şekil 1) kullanılarak, protein agregatları amiloid bağlama sahasına bağlanması üzerine ThT ve TH&#39;nin güçlü bir floresan emisyonu, aşağıdakileri içeren tau yararlanarak, tau ve p-tau agregasyonu kinetiklerini karşılaştırmak için iki farklı protokol kurulmuş ve p-tau (Şekil 2). Ile ya da toplama reaksiyonda floresan boya olmadan, biz hiperfosforilasyon (Şekil 3-5) tarafından tau toplanmasının tutarlı geliştirme gözlendi. Bu uyarım heparin bağ...

Değiştirilmemiş ve hiperfosforile tau proteinleri hiperfosforizasyonu bağımlı hızlı agregasyon kinetiğini ortaya çıkarmak için, iki in vitro toplanma deneylerde kullanıldı. Bu deneyler Alzheimer hastalığının ilerlemesini altında yatan fibriller oluşturmak için hiperfosforilize tau eğilimini modüle edebilir bileşikler için gelecek ekranlar için önünü.

In Vitro toplama Deneyler hiperfosforile tau proteini kullanılarak

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

Bu prosedürün genel amacı, modifiye edilmemiş ve hiperfosforile tau protein türlerinin agregasyon kinetiğini izlemek ve karşılaştırmaktır. Bu işlem, öncelikle fermuar destekli katalizör sistemi kullanılarak modifiye edilmemiş ve hiperfosforile tau proteinlerinin üretilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise, agregasyon analizlerinin iki farklı cihazdan herhangi birine uygun hale getirilmesidir.Tau agregasyon süreci, iki farklı tiyoflavin boyası olan tiyoflavin S ve tiyoflavin T'nin floresansı ile izlenir. Son adım, agregasyon eğrilerinin çizilmesi ve karşılaştırılmasıdır. Nihayetinde, tiyoflavin floresansının agregasyona uğramış TA türlerine bağlanmasıyla meydana gelen kinetik değişiklikler, tau fibrilizasyonunun in vitro ortamda hiperfosforilasyona bağlı artışını göstermek için kullanılır.Merhaba. JoVE makalemize hoş geldiniz. Hiperfosforile tau proteinini kullanan in vitro agregasyon analizleri. Benim adım Minko ve deneyler bir çalışma arkadaşım tarafından yürütülecek ve gösterilecektir.Bu protokol için, son bir ay içinde hazırlanmış, makul derecede taze bir agregasyon tamponu gereklidir. Kullanımdan hemen önce, bu tampona 1 mM DIO three etol eklenmelidir. Ayrıca filtrelenmiş Thioflavin T stok çözeltisi gereklidir. Hem stok çözelti -20 °C'de hem de total protein -80 °C'de saklanabilir.Havluyu buz üzerinde çekin, ardından tutarlılık için gerektiği şekilde agregasyon tamponu kullanarak konsantrasyonunu ayarlayın. Havluyu agregasyon tamponu ile 4 °C'de 10 dakika boyunca 20,800 G'de santrifüjleyin. Şimdi süpernatantı başka bir tüpe aktarın ve agregasyon reaksiyonunu kurma zamanı gelene kadar buz üzerinde tutun.Agregasyon karışımını 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerinde hazırlayın. Tabloya göre, reaktiflerin bir alikotu için 100 mikrolitre yeterlidir. Toplam hacmi reaksiyon sayısına göre hesaplayın ve pipetleme hatalarını göz önünde bulundurarak bu hacmi %10 artırın.Gerektiğinde, pepper yerine raonik asit veya agregasyon tamponu kullanılabilir. Reaksiyonlar ters çevirerek karıştırılmalı ve havalandırma olmadan 37 °C'ye aktarılmalıdır. Floresan ölçümü için indirgeyici bir ortam sağlamak amacıyla, her 24 saatte bir reaksiyonlara ek olarak 1 mM DTT eklenmelidir.Spektra florimetresini yaklaşık 10 dakika boyunca ısıtın. Bu işlem, bilgisayar yazılımındaki ölçümlerin tutarlılığını artıracaktır. Cihaz kontrol merkezinde bulunan gerçek zamanlı görüntüleme modunu seçin.Uyarılma dalga boyunu, yarık genişliği 2 nm olacak şekilde 450 nanometreye ve emisyon dalga boyunu, yarık genişliği 5 nm olacak şekilde 510 nanometreye ayarlayın. Ardından cihaz kontrol merkezine dönün ve sabit dalga boyu analizini seçin. Bir dizi dalga boyu eklemek için üst çerçevedeki ekle tuşuna basın.Standart hata için kazanım parametrelerini bir, maksimum denemeyi ise üç olarak ayarlayın. Ardından ekle düğmesine tıklayın. Son olarak, veri görüntüleme penceresini açmak için git düğmesine tıklayın.Şimdi veri görüntüleme penceresinde, yeni örnek diyalog kutusunu açmak için "start act" düğmesine tıklayın ve örnek tipi olarak "unknown" seçeneğini belirleyin. Ardından, 98 µL agregasyon tamponu ve 2 µL 3 mM thioflavin S veya T kullanarak her bir ölçüm için 100 µL'lik reaksiyonlar hazırlayın; karışımın iyi karıştığından emin olmak için pipetle birkaç kez alt üst edin.Bir karışımın tüm 200 µL'sini bir FA üç qve'ye aktarın ve konuma yerleştirin. Ardından, floresans verilerini toplamak için çalıştır düğmesine basın. Çözeltiyi vete'den çıkardıktan sonra, onu üç kez distile suyla durulayın ve bir hava akımında kurutun. Bu analiz, iyon reaksiyonunda floresan boyayı içerir; bu da sürekli ölçümlere olanak tanır ve otomatik bir mikroplaka okuyucu ile yapılması daha uygundur.Düzenli bir parametre için çalışma, manuel işlem hızıyla sınırlıdır. Agregasyon karışımını 96 kuyucuklu opak siyah bir plaka içinde hazırlayın. 360 µL kuyucuk hacimlerinde, her bir zaman noktası ölçümü için 200 µL yeterlidir.Her bir reaksiyonu pipetleme yoluyla iyice karıştırın. 96 kuyucuklu plakayı 37 °C'de inkübe edin ve her zaman noktasında indirgeyen bir ortam sağlamak için her 24 saatte bir ek olarak 1 mM DTT ekleyin. Ölçüm için, çok modlu mikroplaka okuyucusunu ve bilgisayarı, bilgisayar yazılımı üzerinden en az 10 dakika önceden açın.Sıcaklığı 37 °C olarak ayarlayın ve floresan yoğunluk modunu seçin. Ardından eksitasyon dalga boyunu 450 nm ve emisyon dalga boyunu 510 nm olarak ayarlayın. 96 kuyucuklu plakayı çekmeceye yerleştirin ve okuma tuşuna basın.Ölçümler yapıldıktan sonra, verileri analiz etmeden önce plakayı hemen inkübatöre geri yerleştirin; bu analiz için sürekli modlu analiz, kompakt bir spektrofotometre kullanılarak gerçekleştirilebilir. Agregasyon karışımını 1,5 mL mikro santrifüj tüplerinde hazırlayın. Bir zaman noktasını ölçmek için 200 µL'lik reaksiyonlar yeterlidir.Karıştırmak için tüpleri ters çevirin. Reaksiyonları 37 °C'de veya oda sıcaklığında hazırlayın ve ölçümleri gerçekleştirmek için her 24 saatte bir ek 1 mM DTT ekleyin. Urometre ve yazılımı, boyasız terminal analizi için yapıldığı şekilde kurun.Karışımın tamamını bir kuvete aktarın, bunu numune bölmesindeki numune tutucuya yerleştirin ve kapağı kapatın. Uygun zaman aralıklarında floresan verilerini toplamak için çalıştırma (run) düğmesine tıklayın. Eğer bu aralık 30 veya 60 saniye gibi kısa ise, son zaman noktasına ulaşana kadar Q kuvetini ölçümler arasında cihazda bırakmanızda bir sakınca yoktur.Reaksiyonu kuvette'den örnek tüpüne geri aktarın ve işlem tamamlandığında tüpü inkübatöre geri yerleştirin. Kuvette'yi, daha önce talimat verildiği üzere rekombinant tau ve p tal kullanarak temizleyin. Tau ve p tal'nin agregasyon kinetiklerini karşılaştırmak için, floresan boya ile veya boya olmadan, flavin t ve s'nin tau ve p tal dahil amiloid protein agregatlarına bağlandığında ortaya çıkan güçlü florasan emisyonundan yararlanan iki farklı protokol oluşturulmuştur.Agregasyon reaksiyonunda, hiperfosforilasyonun tau agregasyonunu tutarlı bir şekilde artırdığı görülmüştür. Tipik olarak, flavin dahil olmak üzere, T ve p tal liga ilk 30 dakika içinde hızla yükselmiş, ardından belirgin bir yavaşlama gerçekleşmiştir. Agregasyon reaksiyonlarındaki T, agregasyon hızında önemli bir gecikmeye neden olur.Hem Theof Flavian s hem de t, 160 dakikalık reaksiyonun ardından bir platoya ulaştı. Öte yandan, Bio flavin s, agregasyonun belirgin bir şekilde yavaşlamasına neden olmadı. Bu prosedürün ardından, protein agregasyonunun patogenezdeki katkısını anlamak amacıyla, geliştirilen bu analiz kullanılarak nörodejenerasyondaki diğer agregasyona eğilimli proteinler veya ek merkezi sinir sistemi izoformları üzerinde çalışmalar yapılabilir.Bu yöntem, alandaki araştırmalar, çok sayıda hastalığın incelenmesi, terapötiklerin keşfi ve ilaç geliştirme çalışmaları için hiper fosfat üst protein PA yolu hazırlama tekniğidir.

in-vitro-aggregation-assays-using-hyperphosphorylated-tau-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Video, biyolojik örneklerden izole edilen protein agregatlarının tohumlama aktivitesini tespit etmek için bir floresan rezonans enerji transferi (FRET) akış sitometrisi testini göstermektedir. Tau raportör proteinlerini eksprese eden memeli hücreleri, tau tohumları içeren lipozom transdüksiyon kompleksleri ile inkübe edilir. Bu tohumlar, raportör proteinlerin toplanmasına aracılık ederek akış sitometresinde bir FRET pozitif sinyalinin üretilmesine yol açar.

Tau-Tohum İndüklenen Raportör Protein Agregasyonunu Tespit Etmek için Bir FRET Akış Sitometrisi Tekniği

Bu videoda, kantitatif bir değerlendirme için floresanla aktive edilen hücre sıralaması yoluyla analiz edilen, pH'a duyarlı floresan etiketli Tau agregatları kullanılarak murin mikroglia tarafından Tau alımını ölçen hücre bazlı bir test gösterilmektedir.

Mikroglia tarafından Tau proteini alımını değerlendirmek için hücre bazlı bir test

Bu video, amiloid-β (Aβ) agregatları tarafından nöronal büyüme konisi çöküşünün in vitro değerlendirmesini göstermektedir. Nöronların Aβ agregatları ile tedavi edilmesi, hücre iskeletinin destabilizasyonuna neden olarak aksonların ucundaki büyüme konilerinin çökmesine neden olur. Tedavi edilen hücreler, büyüme konisi çöküşünün derecesini değerlendirmek için kontrol hücreleri ile karşılaştırılır.

Agrege Amiloid-β'in Nöronal Büyüme Konisi Çöküşü Üzerine İn Vitro Değerlendirmesi

Bu video, protein agregasyonunu incelemek için sarı floresan proteini (YFP) ile etiketlenmiş mutant bir insan tau proteinini kodlayan bir lentivirüs ile insan nöronal hücrelerinin dönüştürülmesi sürecini göstermektedir. Nöronlarda görünür sitoplazmik tau agregatlarının oluşumuyla sonuçlanan viral girişten mutant tau ekspresyonuna kadar olan adımları ana hatlarıyla belirtir.

Tau Protein Agregasyon Analizi için İnsan Nöronlarının Lentiviral Aracılı Transdüksiyonu

Burada, Tau proteinini bir vaka çalışması olarak kullanarak, Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi (NMR) ile içsel olarak düzensiz bir proteinin çoklu fosforilasyonlarını tanımlamak için bir yöntem açıklıyoruz. Rekombinant Tau, veri toplama ve analizinden önce bir kinaz ile in vitro olarak izotopik olarak zenginleştirilir ve modifiye edilir.

Özünde Düzensiz Proteinlerin Çoklu fosforilasyon Saptanma Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

Deterjan çözünmez protein toplamları--dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme için bir kısaltılmış Ayırma Protokolü tanımlanır.

Deterjan çözünmez Protein toplamları--dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme

Bu el yazması tau hyperphosphorylation, tau bağlama mikrotübüller ve hücre içi tau ilaç tedavileri takip yerelleştirilmesini ölçme ölçmek için standart iletişim kurallarını açıklar. Bu protokoller sürekli uyuşturucu ya da tau hyperphosphorylation veya Mikrotubul bağlama hedef diğer bileşikler eleme için kullanılabilir.

Tahlil fosforilasyon ve yerelleştirme kolorektal kanser hücrelerinin Tau proteinin birlikte Mikrotubul bağlama için

Bu el yazması açıklanan tau toplama tahlil vivo içinde tau misfolding ve toplama beklenen özelliklerini taklit eder.

Vitro Tahlil türleri çalışmak için toplama Tau Protein ve uyuşturucu tarama

Burada nicelik eylem Anti-tau antikorların mekanizmaları daha iyi tanımlamak için bir araştırma aracı oluşturma amacıyla microglia tarafından tau alımını değerlendirmek için bir hücre tabanlı tahlil açıklayın.

Antikor aracılıklı Tau izni Microglia tarafından eğitim için tahlil hücre tabanlı

Bu protokol, insan nöronal kültürlerin mutant insan Tau için lentiviral yapıları ile dönüştürücü olduğu bir prosedür ayrıntıları. Traned kültürler Tau toplamları ve ilişkili patolojileri görüntüler.

Tau Aggregation Lentiviral kullanarak eğitim için bir In vitro modeli-ınsan nöronların aracılı dönüştürücü

Tau, hem mikrotübülleri bağladığı sitoplazmada hem de Alzheimer hastalığına bağlı genlerin modülasyonu da dahil olmak üzere alışılmadık işlevler uyguladığı çekirdekte bulunan nöronal bir proteindir. Burada, sitoplazmik Tau gelen herhangi bir girişim hariç nükleer Tau işlevini araştırmak için bir yöntem açıklar.

Tau Subsellojen Lokalizasyonunun Hastalıkla İlgili Genlerin İfadesini Araştırmaaracı Olarak Modülasyonu

Öğrenin hiperfosforile tau proteininin in vitro agregasyon kinetiğini tiyoflavin floresansı ile izlemeyi. Bu yöntem, Alzheimer hastalığındaki tau fibrilasyon mekanizmalarını anlamak için kullanılır.

In Vitro toplama Deneyler hiperfosforile tau proteini kullanılarak

Daha fazla video keşfet