In Vitro toplama Deneyler hiperfosforile tau proteini kullanılarak

Bu prosedürün genel amacı, modifiye edilmemiş ve hiper fosforile tau protein türlerinin agregasyon kinetiğini izlemek ve karşılaştırmaktır. Bu, ilk olarak fermuar destekli katalizör sistemi tarafından modifiye edilmemiş ve hiper fosforile tau proteini üretilerek gerçekleştirilir. İkinci adım, agregasyon tahlillerini iki farklı cihazdan herhangi biri için uygun olacak şekilde ayarlamaktır.

Tau toplama işlemi, iki farklı tiyo'nun floresansı ile izlenir. Flavin ölür, flavin S ve flavin T'nin son adımı, toplama eğrilerini çizmek ve karşılaştırmaktır. Sonuç olarak, tiyo flavin floresansının bağlanmadan agrega TA türlerine kinetik değişiklikleri, in vitro tau fibrilasyonunun hiper fosforilasyona bağlı artışını göstermek için kullanılır.

Merhaba. JOV makalemize hoş geldiniz. Hiper fosfo tau proteini kullanılarak in vitro agregasyon deneyleri. Benim adım Minko, deneyler bu şekilde yürütülecek ve gösterilecek.

Ve bu protokol için, geçen ay içinde yapılan oldukça yeni bir toplama arabelleği. Kullanımından hemen önce, bir milimolar için DIO üç etol ekleyin, ayrıca filtrelenmiş bir Theo Flavin çayı veya S stok çözeltisi de gereklidir. Hem eksi 20 santigrat derecede saklanabilir hem de eksi 80 santigrat derecede saklanan havlu proteini içeren hein stok çözeltisi.

Havluyu buzun üzerine çekin, ardından tutarlılık için gerektiği gibi toplama tamponunu kullanarak konsantrasyonunu ayarlayın. Havluyu toplama tamponu ve 10 dakika dört santigrat derece boyunca 20.800 G ile döndürün. Şimdi supinatı başka bir tüpe aktarın ve agregasyon reaksiyonunu birleştirme zamanı gelene kadar buz üzerinde tutun.

Agregasyon karışımını 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplere yerleştirin. Tabloya göre, bir reaktan alikutu için 100 mikrolitre yeterlidir. Reaksiyon sayısına göre toplam hacmi hesaplayın ve pipetleme hatalarını hesaba katmak için %10 artırın.

Biber, gerekirse raonik asit veya toplama tamponu ile değiştirilebilir. Reaksiyonları ters çevirerek karıştırın ve bitki örtüsü olmadan 37 santigrat dereceye aktarın. Her 24 saatte bir, floresanı ölçmek için indirgeyici bir ortam sağlamak için reaksiyonları ek bir milimolar DTT ile doldurun.

Spektrum florimetreyi yaklaşık 10 dakika ısıtın. Bu, bilgisayar yazılımındaki ölçümlerin tutarlılığını artıracaktır. Cihaz kontrol merkezinde bulunan gerçek zamanlı görüntüleme modunu seçin.

Uyarma dalga boyunu iki nanometrede yarık ile 450 nanometreye ayarlayın ve emisyon dalga boyunu beş nanometrelik yarık ile 510 nanometreye ayarlayın. Ardından cihaz kontrol merkezine dönün ve sabit dalga boyu analizini seçin. Bir dalga boyu kümesi eklemek için üst çerçevedeki ekle tuşuna basın.

Standart hatanın alım parametrelerini bir ve maksimum denemeleri üç olarak ayarlayın. Ardından ekle'yi tıklayın. Ardından, veri görüntüleme penceresini açmak için git'e tıklayın.

Şimdi veri görüntüleme penceresinde, yeni örnek iletişim kutusunu açmak için eylemi başlat'a tıklayın ve örnek türü için bilinmeyen'i seçin. Ardından, 98'de her 100 mikrolitreye kadar ölçüm yapmak için reaksiyonları hazırlayın. Mikrolitre agregasyon tamponu ve iki mikrolitre üç milimolar flavin S veya T, iyi bir karışım sağlamak için karışımı birkaç kez pipetleyin.

Bir karışımın 200 mikrolitresinin tamamını bir FA üç qve'ye aktarın ve yerine yükleyin. Ardından floresan verilerini toplamak için koşuyu yalayın Çözeltiyi vete'den çıkardıktan sonra, damıtılmış suyla üç kez durulayın ve bir hava akımında kurutun. Bu tahlil, sürekli ölçümlere izin veren ve otomatik bir mat kuyu plakası okuyucusu ile daha iyi yapılan aion reaksiyonundaki floresan boyayı içerir.

Parametre için düzenli bir çalışma da manuel işlem hızı ile sınırlıdır. Toplama karışımını 96 kuyucuklu opak siyah bir plakaya yerleştirin. 360 mikrolitre ile bir kuyu hacmi her zaman noktası ölçümü için 200 mikrolitre yeterlidir.

Her reaksiyonu pipetleme ile iyice karıştırın. 96 oyuklu plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin ve her 24 saatte bir, her zaman noktasında indirgeyici bir ortam sağlamak için ek bir mili molar DTT ekleyin. Ölçüm için, çok modlu mikroplaka okuyucuyu ve bilgisayarı bilgisayar yazılımında en az 10 dakika önceden açın.

Sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın ve floresan yoğunluğu modunu seçin. Ardından uyarma dalga boyunu 450 nanometreye ve emisyon dalga boyunu beş ve 10 nanometreye ayarlayın. 96 kuyulu plakayı çizime yerleştirin ve okuma tuşuna basın.

Ölçümleri aldıktan sonra, verileri analiz etmeden önce plakayı hemen inkübatöre geri koyun, sürekli mod testi, bu test için kompakt bir spektrofotometre kullanılarak gerçekleştirilebilir. Agregasyon karışımını 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine yerleştirin. Bir zaman noktasını ölçmek için 200 mikrolitre reaksiyon yeterlidir.

Karıştırmak için tüpleri ters çevirin. Reaksiyonları 37 santigrat derece veya oda sıcaklığında ayarlayın ve ölçüm yapmak için her 24 saatte bir ek bir milimolar DTT ekleyin. Ürometreyi ve yazılımı, kalıpsız terminal tahlili için yapıldığı gibi ayarlayın.

Tüm karışımı bir veteriner hekime aktarın ve numune bölmesindeki numune tutucuya yerleştirin ve kapağı kapatın. Floresan verilerini uygun zaman aralıklarında toplamak için çalıştır'a tıklayın. Bu aralık 30 veya 60 saniye gibi kısaysa, ölçümler arasında son zaman noktasına ulaşılana kadar Q veterinerini makinede bırakmanızda bir sakınca yoktur.

Reaksiyonu vete'den numune tüpüne geri koyun ve tamamlandığında tüpü inkübatöre geri koyun. Rekombinant tau ve P tal kullanarak daha önce talimat verildiği gibi vete'yi eğin. Floresan boya olsun ya da olmasın, tau ve p tal dahil olmak üzere amiloid protein agregatlarına bağlandıktan sonra flavin t ve s'nin güçlü floresan emisyonundan yararlanarak, tau ve p tal'in agregasyon kinetiğini karşılaştırmak için iki farklı protokol oluşturulmuştur.

Agregasyon reaksiyonunda, hiper fosforilasyon ile tau agregasyonunda tutarlı bir artış oldu. Tipik olarak, T ve p tal liga, flavin de dahil olmak üzere anlamlı bir yavaşlamadan önceki ilk 30 dakika içinde hızla yükselir. Agregasyon reaksiyonlarındaki T, agregasyon hızında önemli bir gecikmeye neden olur.

Hem Theof Flavian s hem de t 160 dakika boyunca tepki verdikten sonra bir platoya yaklaştı. Öte yandan, bio flavin s, agregasyonda kayda değer bir yavaşlamaya neden olmadı. Bu işlemi takiben, nörodejenerasyonda izoformlara veya diğer agregasyona eğilimli proteinlere ek olarak, protein izasyonunun patogenezdeki katkısını anlamak için test kullanılarak test yapılabilir.

Bu teknik, alanında araştırma yapmak için bir hiper fosfat üst protein PA yöntemi, terapötiklerimizi ve ilaç geliştirmemizi keşfetmek için çok sayıda hastalık.