Tek Molekül FRET DNA döngü oluşturma incelenmesi

Bu çalışma, tek bir molekül flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) kullanılarak çift sarmallı DNA ilmek dinamiklerini ölçmek için bir ayrıntılı deneysel prosedür sunmaktadır. Protokol ayrıca J faktörü denilen döngü olasılık yoğunluğunu ayıklamak için nasıl açıklar.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, çift sarmallı DNA'nın döngü dinamiklerinin, DNA bağlayıcı proteinler kullanılmadan DNA'nın içsel şeklinden nasıl etkilendiğini araştırmaktır. Bu, boya moleküllerinin farklı eğriliklere sahip çift sarmallı DNA parçalarına dahil edilmesiyle elde edilir, böylece DNA döngüsü floresan rezonansı, enerji transferi veya fret ile izlenebilir. Tek DNA moleküllerinden gelen tersinir döngü ve döngüden çıkma olayları daha sonra toplam iç yansıma mikroskobu ile gözlemlenebilir.

DNA'nın döngü hızı daha sonra her bir tek molekül floresansının zaman yörüngelerinden tahmin edilebilir. Nihayetinde, DNA'nın parçanın içsel şekli ile ilişkili olarak döngü olasılığı ölçülebilir. Bu DNA döngü testinin ana avantajı, A DNA'sının döngü kinetiğini etkileyebilecek A DNA bağlayıcı proteine dayanmamasıdır.

Basit protokol, floresan rezonans, enerji transferi ve PCR tabanlı DNA sentezi adı verilen bir teknik kullanmakla ilgilidir. DNA'nın görünme olasılığını ölçmek için: 10 MER dizisini tekrarlayarak küresel olarak kavisli DNA'lar tasarlayarak başlayın. Örneğin, bu temsili dizi, 186 baz çifti eğri bir DNA'dır, burada X rastgele bir ekstra bazdır ve tekrar eden 10 mers dizisini çevreleyen diziler adaptör dizileridir.

Daha sonra, beş asal uçta perde donörü SI üç etiketleme ile birinci ve ikinci primerlerle PCR gerçekleştirin. Ardından, omurga boyunca perde alıcısı SCI beş etiketlemesi ve birinci maddenin beş ana ucunda biyotin bağlayıcısı olan üçüncü ve dördüncü primerlerle PCR gerçekleştirin. PCR ürünlerini bir PCR temizleme kiti kullanarak saflaştırdıktan sonra, SCI üç etiketli ve SCI beş etiketli ürünleri sırasıyla 0.4 mikromolar ve 0.1 mikromolar nihai konsantrasyonlarda iplik değişimi için bir tamponda karıştırın.

Daha sonra iplikleri iki dakika boyunca 98.5 santigrat derecede inkübe edin, saniyede 0.1 santigrat derece rampa hızıyla yavaş yavaş beş santigrat dereceye soğutun ve ardından iki saat boyunca beş santigrat derecede inkübe edin. Akış hücresini hazırlamak üzere telleri değiştirmek için, üç inç'e bir inçlik bir cam sürgünün iki zıt kenarı boyunca altı ila yedi çift delik oluşturmak için bir matkap presi ve elmas matkap uçları kullanın. Deliklerin tümü delindiğinde, görünür cam tozunu çıkarmak için sürgüyü akan suyun altına ovalayın.

Slaytları dik olarak bir cam kavanoza yerleştirin ve damıtılmış suyla doldurun. Kavanozu 15 dakika boyunca sonikleştirin ve ardından slaytları aseton temizliği için ayrılmış bir cam kavanoza aktarın. Kavanozu asetonla doldurun ve slaytları asetonda 15 dakika daha sonikleştirin.

Ardından, slaytlara etanol ve ardından durulamak için su püskürtün ve ardından slaytları bir polipropilen kavanoza aktarın. Polipropilen kavanozu beş molar potasyum hidroksit ile doldurun ve ardından son yıkamadan sonra slaytları 15 dakika daha sonikleştirin, slaytları damıtılmış suyla durulayın ve ardından 15 dakika daha bekleyin. Sonikasyon daha sonra temizlik kapak kayar.

Aynı şekilde, her bir slayta 80 mikrolitre taze hazırlanmış PEG solüsyonu dağıtın ve ardından mandalın üzerine bir kapak fişini yavaşça indirin. 45 dakika sonra, lamele fişlerini slaytlardan çıkarmak için cımbız kullanın, slaytları durulayın ve kapak fişlerini bol miktarda damıtılmış su ile durulayın. Ardından, kapak kaymaları ve slaytlar kuruduğunda kurumuş bir şekilde kurutun, kanallar oluşturmak için sürgünün üzerine ince şeritler halinde çift çubuklu bant yerleştirin, şeritlerin üzerine bir kapak kayması yapın ve sıvı geçirmez kanallar oluşturmak için kapak kızağına sıkıca bastırın.

Ardından, molekülleri mikroskopi için hareketsiz hale getirmek için kanalların kenarlarını kapatmak için beş dakikalık epoksi kullanın. İlk olarak, bir kanala 15 mikrolitre nötradin çözeltisi enjekte edin. İki dakika sonra, kanalı 100 mikrolitre T 50 tamponu ile durulayın ve ardından kanala 50 mikrolitre DNA örneği enjekte edin.

Beş dakika sonra, bağlanmamış DNA'yı 100 mikrolitre T 50 tamponu ile durulayın ve ardından kanalı oksijen temizleme sistemini içeren bir görüntüleme tamponu ile doldurun. Şimdi daldırma yağını mikroskop objektifine yerleştirin ve ardından akış hücresini mikroskop aşamasına sabitlemek için numune klipsleri kullanın. 532 nanometre lazeri açın.

İnce yapmak için monitördeki floresan görüntülerin canlı görüntüsünü kullanın. Odağı ayarlayın. 532 nanometre lazer açıkken veri toplamaya başlayın.

Moleküllerin çoğu görüntüleri işlemek ve analiz etmek için fotoğrafla ağartıldığında veri toplamayı durdurun, yüksek ve düşük perde sinyalleri arasında çoklu geçişler gösteren tüm tek molekül zaman izlerine bakmak için bir MATLAB komut dosyası kullanın. Döngülü ve döngüyü çözmüş durumları tanımlayın ve ardından iki takılı Gauss eğrisi arasındaki kesişimi belirleyerek iki dağılımı ayıran eşiği bulun. Ardından, bilim kurgu yoğunluğunu SCI üç ve bilim kurgu yoğunluklarının toplamına bölerek F cephe verimliliğini hesaplayın.

Yüksek fret değerlerine sahip döngü durumlarını ve düşük fret değerlerine sahip döngü açma durumlarını atama. Ardından, bir MATLAB komut dosyası kullanarak, döngüye giren, yani farklı zaman aralıklarında yüksek perde durumuna ulaşan kümülatif molekül veya NFT sayısını analiz edin. Veri toplamanın başlangıcından bu yana, döngü hızı K alt döngüsü daha sonra NFT'ye üstel bir fonksiyon uydurularak çıkarılabilir.

NFT bi'yi artırırsa, temel olarak denklemde gösterildiği gibi bir çift üstel fonksiyon ile donatılabilir. Bu durumda, J faktörü akışını belirlemek için bu denklemden K alt döngüsü elde edilir. 20 mikrolitre 30 ila 50 pikaMolar biotin sci beş oligo veya primer üç fındık içine travain kaplı kanallardan biri az önce gösterildiği gibi.

Daha sonra, bağlanmamış oligoları yıkamak için kanalı 100 mikrolitre T 50 ile durulayın ve ardından PS üç oligo ile desteklenmiş yeni hazırlanmış görüntüleme tamponunu hazneye akıtın. 532 nanometre lazeri açık tutun ve ardından yüzeye bağlı bilim kurgu oligolarının yerlerini belirlemek için 640 nanometre lazeri kısa bir süre açın. Ardından 640 nanometre lazeri kapatın ve perde sinyalini izlemeye başlayın.

Bağlanmamış durumda başlayan moleküllerin sayısını analiz etmek için bir MATLAB komut dosyası kullanın. Bu, düşük bir bilim beş yoğunluğuna sahip, ancak daha sonra IL durumuna dönüşüyor. Yani, bilimkurgu yoğunluğundan zamanın bir fonksiyonu olarak yüksek bir bilimkurgu yoğunluğu ile, bilimkurgu yoğunluğu izleri, ealing oranını elde etmek için eğriyi tek bir üstel fonksiyonla uyduran zamana karşı bu sayıda ane molekülünü çizer.

K alt anil, diz çökme hızı ile reaktan konsantrasyonu arasındaki doğrusallığı doğrulamak için deneyi farklı SI üç oligo konsantrasyonlarında tekrarlayın. İkinci dereceden bir diz çökme hızı sabiti olan K prime sub ail'i eğimden çıkarın. Son olarak, çift sarmallı DNA'nın içsel eğriliğinin döngü üzerindeki etkisini test etmek için K alt döngüsünün aynı tampon koşulları altında ölçülen döngü hızı olduğu J faktörünü hesaplayın.

Bu deneyde, bir düz ve bir kavisli 186 baz çifti. Çift sarmallı DNA'ların her biri düz DNA'ya kıyasla inşa edildi. Kavisli DNA'nın aynı zaman diliminde daha yüksek fret olayları ürettiği belirlendi.

Kavisli DNA ayrıca aynı edinim süresi boyunca düz DNA'dan dört kat daha sık döngüye girdi ve bu da DNA'nın içsel eğriliğinin döngü dinamiklerini önemli ölçüde etkileyebileceğini gösterdi. Bu son analiz adımında, J faktörü, döngü hızının bir diz çökme hızı sabiti olan birinci dereceye bölünmesiyle hesaplandı ve önceki bulgularla uyumlu olarak düz DNA için 61 artı veya eksi üç anomolar ve eğri DNA için 265 artı veya eksi 48 nanomolar olarak belirlendi. Bu prosedürü takiben, kaza faktörünün sıcaklık, gerilmeme ve viskozite gibi döngü hareketliliği üzerindeki etkileri incelenebilir.

Bu protokol sadece DNA'nın polimer fiziğini incelemek için değil, aynı zamanda tek molekül floresansının gücünü yeni başlayan araştırma öğrencilerine veya sıradan izleyicilere göstermek için de faydalı olacaktır.