Name: Tek Molekül FRET DNA döngü oluşturma incelenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Keşfedin tek molekül FRET ile çift sarmallı DNA'nın döngü oluşum dinamiklerini protein bağlayıcı olmadan inceleyin. Bu yöntem, DNA'nın içsel eğriliğinin döngü davranışını nasıl etkilediğini ölçmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz eleştirel yazının okunması için James Waters, Gable Wadsworth&#39;u ve Bo Broadwater teşekkür ederim. Biz de yararlı yorumlar sağlamak için dört anonim yorumcular teşekkür ederim. Biz Georgia Teknoloji Enstitüsü, Bilimsel Arakesitte Burroughs Wellcome Fonu Kariyer Ödülü ve Yaşam Sistemleri NSF Fizik gelen öğrenci araştırma ağı hibe mali destek kabul.

1. DsDNA Numune Hazırlama <ol><li> 10-mer dizisini tekrarlayarak küresel kavisli DNA&#39;lar tasarlayın. Örneğin, 5&#39;-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) 7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 &#39;, bir 186-bp X kavisli rastgele bir ilave baz DNA ve tekrar 10-mer dizisini kuşatan sekans adaptör dizileri olmasıdır. Not:. Bu örnekte Kaplan ve arkadaşları tarafından, büyük ölçekli nükleozom doluluk çalışmaya dayanarak nükleozom oluşumuna karşı tercihler iki 10-mer 15 seçilmiştir. DsDNA sarmal tekrar 10 bp yakın olduğu için, 10-mer sarmal eksen herhangi bir net saptırma dairesel bir yay (Şekil 3A) gibi bir şekil üretilmesi için birikecektir. Sarmal süresi 10.5 bp yakın olduğundan, ekstra bir baz olabildiğince düzlemsel olarak kavisli yapısını korumak için her iki tekrarlar sonra eklenir. 200 bp daha kısa Bu diziler Companie sipariş edilebilirs sunan gen sentezi hizmet. Bu daha sonraki aşamalar için ortak bir adaptör dizisiyle birlikte, bu sekansları yan yüzey için uygundur. Bu prosedür Şekil 3B&#39;de şematize edilmiştir. </li><li> Primer 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) ve Primer 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG) ile PCR yapın. Not: Primer 2 5 &#39;ucunda FRET verici Cy3 ile etiketlenir. Tipik bir PCR protokol tarifi ve bisiklet Tablolar 1 ve 2&#39;de sunulmuştur. </li><li> Primer 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) ve Primer 4 (CAACAACGAGCTCGAATG) ile PCR gerçekleştirin. NOT: Primer 3 5 &#39;ucunda omurga ve biyotin bağlayıcı aracılığıyla FRET alıcı Cy5 ile etiketlenir. PCR tarifi ve bisiklet protokol yukarıdaki gibidir. </li><li> Bir PCR temizleme kiti kullanılarak PCR ürünleri saflaştırılır. </li><li> 0.4 ve nihai konsantrasyonlarda iplik değişimi için bir tampon (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7.0, 1 mM EDTA) içinde Cy3-etiketli ürün ve Cy5 etiketli ürünün karıştırın# 181; sırasıyla M ve 0.1 mcM. Not: aşırı Cy3-DNA şerit değişimi sonucu Cy3 ve Cy5 hem taşıyan çift yönlü konsantrasyonunu arttırır. </li><li> 2 dakika için 98.5 ° C &#39;de enkübe edilerek Değişim şeritler, yavaş yavaş 5 soğutulduktan ° C 0.1 ° C / sn bir artış hızı ile ve 5 de inkübe &#160; 2 saat boyunca ° C. </li></ol> 2.. Jel Elektroforez dsDNA Eğrilik Algılama <ol><li> 29.2:0.8 oranında akrilamid ve bis-akrilamid solüsyon karıştırılarak bir poliakrilamid jeli 16,17 dökün,% 5 (ağ / hac) pH 8.0 &#39;de 1X Tris / borat / EDTA (TBE) tamponu. Not: jel solüsyonu 10 mi içerir: 1.217 ml% 40 akrilamit, 0.667 ml% 2 bis-akrilamid, 1 mi TBE 10X, 100 L amonyum persülfat (APS) 10,% 10, L TEMED, ve geri kalan dH 2 O olduğu Jelin tam katılaşması yaklaşık 30 dakika sürer. </li><li> DNA örnekleri ve 1X yükleme tamponu içinde DNA merdiveni (% 5 gliserol,% 0.03 (ağırlık / hacim) bromofenol bl ile poliakrilamid jel yükue) ve 5-8 de jel de 45 dakika boyunca 4 ° C&#39;de veya boya ön kadar V / cm jel sonuna yaklaşır. </li><li> 30 dakika için 0.5 g / ml etidyum bromid içeren 1X TBE tamponu kullanılarak jel leke. UV ışık altında DNA bantları belirlenmesi. DNA moleküllerinin belirgin boyutlarını hesaplamak için boyut markeri (100 bp DNA merdiven) ile bant pozisyonları karşılaştır. NOT: Kavisli DNA&#39;lar genellikle düz DNA&#39;ların daha yavaş hareket eder. </li></ol> 3.. Hücre Hazırlama Akış <ol><li> Bir matkap basın ve elmas matkap kullanarak bir cam slayt iki zıt kenarları (3&#39;&#39; x 1&#39;&#39;) boyunca delik 6-7 çiftleri delin. Delindikten sonra, görünür cam tozunu su akan slayt ovmak. NOT: delik perfüzyon giriş ve çıkışları olarak hizmet vermektedir. Sondaj esnasında su ile slayt soğutma çatlamasını önlemek için önemlidir. </li><li> Cam bir kavanoza dik slaytlar yerleştirin ve su ile doldurun. 15 dakika boyunca sonikasyon ve başka bir cam kavanoz de içine aktarabilirsinizaseton temizlik için endikedir. 15 dakika boyunca aseton ve sonikasyon ile doldurun. Daha sonra bir sprey şişesi ve su kullanılarak, etanol ile slaytlar durulayın. Polipropilen kavanoza koyun, 5 M potasyum hidroksit ile doldurun ve sonicate 15 dakika için. Son olarak, 15 dakika boyunca su içinde slaytlar sonikasyon. Aynı protokolü kullanarak lamelleri (No. 1, 24 x 40 mm) temizleyin. NOT: Temizlenmiş slaytlar ve lamelleri uzun süreli kullanım için dH 2 O saklanabilir. </li><li> 0.1 M sodyum bikarbonat çözeltisi 340 L mPEG-silan 80 mg (MW 2000) ile biotin-PEG-silan, 1 mg (MW 3400) karıştırın. İyice karıştırın ve baloncuklar kurtulmak için kısaca karışımı santrifüj. NOT: Polietilen glikol (PEG) ile yüzeyin işlevselleştirme yüzeyine spesifik olmayan DNA bağlanma azaltmaya yardımcı olur. </li><li> Her slaytta PEG çözeltisi 80 L koyun ve hafifçe üzerine bir lamel düşük. 45 dakika boyunca bekleyin. , Cımbız ile slayt lamel ayırın dH 2 O bol miktarda durulayın ve izin taçık havada hem kuru. </li><li> Kanallar oluşturmak üzere slaytta çift-çubuk ince şerit bant yerleştirin. Bunun üzerine bir lamel hizalayın ve sıkıca sıvı geçirmez kanallar oluşturmak üzere slayt karşı lamel basın. Kanalların kenarları mühür 5 dakika epoksi kullanın. </li></ol> Trolox Çözüm 4. Hazırlanması <ol><li> Bir şişe içinde ~ 30 mg troloks ve 10 ml dH 2 O koyun ve 18 saat süre ile açık havada solüsyonu karıştırmak için bir mıknatıs karıştırma çubuğu kullanmaktadır. </li><li> Bir 0.2 mikron filtre kullanılarak filtre edilir ve çözelti 1 M Tris bazı (pH 11)-6 ul ekleyerek pH 7&#39;ye ayarlanır. Not: Trolox genel olarak 18 çalışmalar, tek bir molekül olarak kullanılan bir anti-yanıp sönen reaktiftir. Trolox ® solmaya hareket kısmen bozulmuş Trolox ® çözeltisi 19 içinde mevcut olan kendi oksitlenmiş türevi gelmektedir. Metanol ya da yüksek hızlı bir şekilde pH Tris Trolox ® çözeltisi içinde çözündürülmesi için yetersiz oksidasyon kaçınılmalıdır. </li></ol> 5. Tek molecule Görüntüleme <ol><li> Kanala NeutrAvidin çözeltisi (0.5 mg / ml) 15 ul enjekte edilir ve T50 tampon 100 ul (10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7.0) ile yıkamadan önce 2 dakika boyunca bekleyin. </li><li> Kanalın içine DNA örneği (50-100 pM), 50 ul enjekte edilir. 5 dakika bekleyin ve T50 tampon 100 L uzakta ilişkisiz DNA durulayın. Not: DNA molekülleri, özellikle NeutrAvidin-biyotin etkileşimi yoluyla yüzeye bağlanacaktır. </li><li> Bir oksijen tutucu sistem 20 (100 mM PCD, 5 mM PCA, 1 mM Trolox ve 500 mM NaCl) içeren bir görüntüleme tamponu ile kanal doldurun. </li><li> Saniyede 25 kare bilgisayara 2 x 2 binned görüntüleri (256 x 256) akışı çerçeve transfer modunda EMCCD ayarlayın. </li><li> Mikroskop objektif üzerinde daldırma yağ koymak, ve numune klipsler kullanılarak mikroskop sahnede akış hücresi düzeltmek. Duvara lazer yansıma şekline bakarak odağı kaba ayarlayın. Floresan im canlı görünümünü kullanarak odağı İnce ayarımonitörde yaş. </li><li> Üzerinde 532 nm lazer ile veri toplama başlar. Canlı görünümünü kontrol edin ve gerekirse odağı ayarlayın. En molekülleri photobleached olduğunda veri toplama durdurun. NOT: Bu tesiste, mikroskop kontrol ve sabit diske kaydedilmiş olarak monitörde canlı görüntüleri görüntülemek için bir laboratuvar-C yazılı programı kullanılmıştır. </li></ol> 6.. Görüntü İşleme ve Veri Analizi NOT: 256 x 256 görüntülerin bir zaman serisi Cy3 ve Cy5 şiddetlerinde tek-molekül zaman izlerini oluşturmak için bir MATLAB kodu tarafından işlenir. Donör kanal ve bölünmüş görünüm görüntü alıcı kanal arasındaki pikselleri eşleştirmek için, Cy3 ve Cy5 noktalar 6-7 çifti, eşit görüş alanına yayılmış aynı molekülün her çifti, elle bir afin dönüşüm aldı, ve vardır çapa noktaları olarak bu noktalar koordinatları kullanılarak hesaplanır. <ol><li> MATLAB komut dosyası kullanarak, tüm tek-molekül süre bakmak t izleridüşük ve yüksek FRET sinyalleri arasında şapka gösterisi çoklu geçişler. Döngüye ve unlooped durumlarını belirlemek. Not: FRET sinyali Cy5 yoğunluğu olarak tanımlanan (I a) Cy3 ve Cy5 yoğunluklarının toplamı (I I a + d) bölünür. Unlooped hali düşük FRET değere sahip iken döngüye devlet yüksek FRET değeri vardır. Tek bir molekülden FRET sinyallerinin histogram bimodally için geri loop ve unlooping arasında dağıtılır. </li><li> İki monte Gauss eğrileri arasındaki kesişim belirleyerek iki dağılımları ayıran eşik bulun. </li><li> FRET verimliliği gibi hesaplayın <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq7.jpg" /> ve yüksek FRET değerleri ve düşük FRET değerleri ile unlooped devletlerle döngüye durumları atayın. </li><li> MATLAB komut dosyası kullanarak, moleküllerin (N (t)) kümülatif sayısını analiz o döngüye (veyaveri toplama başından bu yana farklı zaman geçerse de yüksek FRET devlet) ulaştı. NOT: dsDNA molekül veri toplama başında unlooped devletin herhangi bir yapısındaki başlayabilirsiniz yana, ilmekli nüfus artış oranı ortalama döngü oranı ilk konformasyonlar üzerinden ortalama yansıtır. Üstel fonksiyonu ile N (t) takarak döngü oranı k döngü Özü: <img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq1.jpg" /> Biphasically artarsa, o bir çift üstel fonksiyonu ile donatılmış olabilir: <img fo:content-width="2.2in" src="/files/ftp_upload/51667/eq2.jpg" /> Bu durumda, k döngü elde edilir: <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51667/eq3.jpg" /> Not: Teorik olarak, bir polimer t zamanında döngüye olmadığını hayatta kalma olasılığı, tek veya çift üstel fonksiyon 12 değildir. Üstel fitting ortalama döngü süresini elde etmek için pratik bir araç olarak kullanılır. </li></ol> 7. J Factor Belirlenmesi Not: J faktörü dsDNA bir ucu diğer ucunda yaklaşık kadar konsantre edildi temsil eder. Bu döngü oranı olarak ölçülen diğer ucu bölümü ile aynı reaksiyon oranını üretecektir DNA&#39;nın bir ucu diliminin konsantrasyonunu interpolasyonuyla belirlenebilir. Deneysel olarak, bir uç kademeli bir yüzeyi üzerinde immobilize edilir ve diğer uç kademeli bir belirli konsantrasyon ° C&#39;de ilave edilir. Iki ucu arasındaki ölçülen bağlanma oranı k tavlama ise, J faktörü 21 ile verilir <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq4.jpg" /> . Tavlama oranı sabiti (k tavlama = k tavlama / C), prob konsantrasyonu bağımsızdır. <ol><li> 30-50 pM biotin-Cy5 oligo 20 ul (Primer 3) akış iBir NeutrAvidin kaplı kanal nto. Ilişkisiz oligolarını yıkayacak 100 ul T50 ile kanal durulayın. </li><li> 50 nM&#39;lik bir nihai konsantrasyonda Cy3 oligo (Primer 2) ilavesi ile kısmen 5&#39;te tarif edildiği gibi görüntüleme tamponu hazırlayın. Kanala bu görüntüleme tampon akış. </li><li> Üzerinde 532 nm lazer tutarken, kısaca yüzey bağlı Cy5 Oligoların konumlarını belirlemek için 640 nm lazer açın. 640 nm lazer kapatın ve FRET sinyal izleme başlar. NOT: Bir yüzeye bağlı Cy5 oligo için bir Cy3 oligo hibridizasyon üzerine, Cy5 floresans FRET dan ortaya çıkacaktır. </li><li> MATLAB komut dosyası kullanılarak, ilişkisiz devlet (düşük yoğunluklu Cy5) başlar ama daha sonra Cy5 yoğunluk izlerinden zamanın bir fonksiyonu olarak tavlı devlet (yüksek Cy5 yoğunluğu) dönüşmesi moleküllerinin sayısını analiz. </li><li> Tavlı moleküllerin karşı zaman bu sayı çiziniz. Tek bir üstel fonksiyonu ile (bu eğrinin <img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq5.jpg"/&gt;), Tavlama oranı (k anneal) elde edilmiştir. </li><li> Tavlama oranı ve reaktan konsantrasyonu arasında lineer teyit etmek için farklı oligo Cy3 konsantrasyonda (60, 100 ve 180 nM) bu deney tekrarlayın. Ikinci dereceden tavlama oranı sabiti (k tavlama Özü ) Yamaç. </li><li> J faktör hesaplayın <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq6.jpg" /> , K döngü aynı tampon durumda ölçülen döngü hızıdır. </li></ol>

<ol><li>Garcia, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+consequences+of+tightly+bent+DNA%3A+The+other+life+of+a+macromolecular+celebrity%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Biological consequences of tightly bent DNA: The other life of a macromolecular celebrity.</a> Biopolymers. 85, 115-130 (2007).</li>
<li>Wiggins, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+flexibility+of+DNA+on+short+length+scales+probed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">High flexibility of DNA on short length scales probed by atomic force microscopy.</a> Nature Nanotechnology. 1, (2006).</li>
<li>Lionberger, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+kinking+at+distant+sites+in+mechanically+stressed+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cooperative kinking at distant sites in mechanically stressed DNA.</a> Nucleic Acids Research. 41, 6785-6792 (2011).</li>
<li>Shore, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+flexibility+studied+by+covalent+closure+of+short+fragments+into+circles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">DNA flexibility studied by covalent closure of short fragments into circles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 4833-4837 (1981).</li>
<li>Geggier, S., Vologodskii, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+dependence+of+DNA+bending+rigidity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Sequence dependence of DNA bending rigidity.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 107, 15421-15426 (1992).</li>
<li>Smith, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+mechanical+measurements+of+the+elasticity+of+single+DNA+molecules+by+using+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads.</a> Science. 258, 1122-1126 (1992).</li>
<li>Peters, J. P., Maher, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+curvature+and+flexibility+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">DNA curvature and flexibility in vitro and in vivo.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 43, 23-63 (2010).</li>
<li>Cloutier, T. E., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+sharp+bending+of+double-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous sharp bending of double-stranded DNA.</a> Molecular Cell. 14, 355-362 (2004).</li>
<li>Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclization+of+short+DNA+fragments+and+bending+fluctuations+of+the+double+helix%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cyclization of short DNA fragments and bending fluctuations of the double helix.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 5397-5402 (2005).</li>
<li>Yuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T4+DNA+ligase+is+more+than+an+effective+trap+of+cyclized+dsDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">T4 DNA ligase is more than an effective trap of cyclized dsDNA.</a> Nucl. Acids Res. 35, 5294-5302 (2007).</li>
<li>Manzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+nonspecific+binding+of+lambda+repressor+on+DNA+looping+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The effect of nonspecific binding of lambda repressor on DNA looping dynamics.</a> Biophysical Journal. 103, 1753-1761 (2012).</li>
<li>Le, T. T., Kim, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+shape-dependent+looping+probability+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measuring shape-dependent looping probability of DNA.</a> Biophys. J. 104, 2068-2076 (2013).</li>
<li>Vafabakhsh, R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+bendability+of+DNA+less+than+100+base+pairs+long+revealed+by+single-molecule+cyclization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extreme bendability of DNA less than 100 base pairs long revealed by single-molecule cyclization.</a> Science. 337, 1097-1101 (2012).</li>
<li>Friedman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viewing+dynamic+assembly+of+molecular+complexes+by+multi-wavelength+single-molecule+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence.</a> Biophysical Journal. 91, 1023-1031 (2006).</li>
<li>Kaplan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-encoded+nucleosome+organization+of+a+eukaryotic+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome.</a> Nature. 458, 362-366 (2009).</li>
<li>Koo, H. S., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+DNA+curvature+and+a+unified+description+of+sequence-directed+bending%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Calibration of DNA curvature and a unified description of sequence-directed bending.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 85, 1763-1767 (1988).</li>
<li>Prosseda, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+temperature-induced+narrow+DNA+curvature+range+sustains+the+maximum+activity+of+a+bacterial+promoter+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A temperature-induced narrow DNA curvature range sustains the maximum activity of a bacterial promoter in vitro.</a> Biochemistry. 49, 2778-2785 (2010).</li>
<li>Rasnik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3, 891-893 (2006).</li>
<li>Cordes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+Trolox+as+antiblinking+and+antibleaching+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 5018-5019 (2009).</li>
<li>Aitken, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).</li>
<li>Taylor, W. H., Hagerman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+method+of+phage+T4+DNA+ligase-catalyzed+ring-closure+to+the+study+of+DNA+structure%3A+II.+NaCl-dependence+of+DNA+flexibility+and+helical+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Application of the method of phage T4 DNA ligase-catalyzed ring-closure to the study of DNA structure: II. NaCl-dependence of DNA flexibility and helical repeat.</a> Journal of Molecular Biology. 212, 363-376 (1990).</li>
<li>Bolshoy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curved+DNA+without+A-A%3A+experimental+estimation+of+all+16+DNA+wedge+angles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Curved DNA without A-A: experimental estimation of all 16 DNA wedge angles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 2312-2316 (1991).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+DNA+fragments+in+yeast+by+one-step+assembly+of+overlapping+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides.</a> Nucl. Acids Res. 37, 6984-6990 (2009).</li>
<li>Vologodskii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+of+short+DNA+helices%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+DNA+PNA+XNA%22%5BJournal%5D)">Bending of short DNA helices.</a> Artif DNA PNA XNA. 4, (2013).</li>
<li>Hoover, D. M., Lubkowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNAWorks%3A+an+automated+method+for+designing+oligonucleotides+for+PCR-based+gene+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis.</a> Nucl. Acids Res. 30, (2002).</li>
<li>Waters, J. T., Kim, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+Statistics+of+a+Surface-Pinned+Semiflexible+Polymer%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Equilibrium Statistics of a Surface-Pinned Semiflexible Polymer.</a> Macromolecules. 46, 6659-6666 (2013).</li>
<li>Mills, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+evidence+that+single-stranded+regions+of+1+or+more+nucleotides+dramatically+increase+the+flexibility+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic evidence that single-stranded regions of 1 or more nucleotides dramatically increase the flexibility of DNA.</a> Biochemistry. 33, 1797-1803 (1994).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması beyan ederim.

FRET göre basit bir tek-molekül deney farklı şekillerde iç DNA&#39;ların ilmek kinetiğini incelemek için kullanılmıştır. Eğimli DNA&#39;lar 10.5 bp&#39;lik sarmal süresi ile aynı fazda bir 10-mer dizisini tekrar ile hazırlanabilir, ve eğrilikleri PAGE kullanılarak tahmin edilebilir. Bu dsDNAs geçici döngü stabilizasyonu sağlamak için yapışkan uçları ile tasarlanmıştır. Zamanla döngüye moleküllerin sayısındaki artıştan üstel döngü hızı ekstre edilmiştir. Kesilmiş yapışkan uç kesimleri arasındaki bağlanma oranı sabiti, J ...

DsDNA&#39;nın mekanik özelliklerini anlama, temel bilimler ve mühendislik uygulamalarında temel bir öneme sahiptir. Ardışık baz çiftleri arasına rulo, eğim ve büküm açıları dizisi ile değişebilir çünkü dsDNA&#39;nın yapısı düz bir sarmal merdiven daha karmaşıktır. Termal dalgalanmalar dsDNA gibi, bükme büküm ve germe gibi yapısal dalgalanmalara farklı modları geçmesi neden olabilir. Bu eritme ve dolanmaya olarak geçişleri de aşırı koşullarda oluşabilir. Bu hareketler arasında, dsDNA bükme en çok dikkat çeken biyolojik etkiye sahiptir 1. dsDNA eğilme birbirine yakın iki uzak siteleri getirerek gen baskıyla veya aktivasyonu ile ilişkilidir. Ayrıca, DNA hücre çekirdeğinin içine ambalaj veya bir viral kapsid önemli bir rol oynar. DsDNA bükülmesi deformasyonu yüksek çözünürlüklü mikroskopisi (AFM 2 ve 3 TEM) ve Thermodyn ile deneysel olarak görselleştirilebiliramics ve kinetik kimyasal dsDNA&#39;nın yan yana sitelere link loop tahliller ile ele alınabilir. Böyle bir deney, ligaz bağımlı siklizasyon 4&#39;tür. Bu testte, &#39;yapışkan&#39; (yapışkan) uçları ile dsDNA moleküller sirküle veya DNA ligazı ile dimerize. Daire ve dimer oluşumunun oranlarını karşılaştırarak, bir J faktör olarak bilinen diğer ucu, yakın DNA&#39;nın bir ucunun etkin bir molar konsantrasyon elde edebilir. Bu, J faktör diğer ucunda, kısa bir mesafede, DNA&#39;nın bir ucu bulma olasılığı yoğunluğuna boyutlu eşdeğerdir ve bu şekilde DNA&#39;nın bir esneklik göstermektedir. DNA uzunluğunun bir fonksiyonu olarak J faktörünün ölçülmesi kalıcı uzunluğu 4,5 &#39;da dahil olmak üzere bir DNA ile ilgili birçok mekanik özelliklerini ortaya koymaktadır. Solucan benzeri zincir (WLC) modeli yaygın bir açıklamaya onun başarısına dayanan dsDNA mekaniği için kanonik polimer modeli olarak kabul edilmiştirDNA deneyleri 6 çekerek, doğru ve uzun 200 bp 7 daha dsDNAs arasında J faktörleri tahmin elde kuvvet-uzatma eğrileri adencilik. Bununla birlikte, 100 bp kadar kısa dsDNA moleküller üzerinde siklizasyon deneyi kullanılarak, Cloutier ve Widom WLC modeli tahmin 8 daha yüksek, birkaç kat olmak J faktörleri ölçülür. Bir yıl sonra, Du ve ark. ligazı düşük konsantrasyonları ile siklizasyon deneyi kullanılarak WLC modeli ile uyum içinde J faktörleri üretilen ve Widom gruptan 9 ligaz kullanılan yüksek konsantrasyonlara anormal sonucu bağlanabilir. Geleneksel tahlil 9 kullanırken bu tartışma siklizasyonudur kinetik DNA ligaz kaçınılmaz etkisini örneğidir. Ayrıca, DNA ligaz, aynı zamanda non-spesifik bağlanma 10,11 aracılığıyla gerçekleştirilen DNA yapısı ve sertlik etkileyebilir. Protein-bağımlı ilmek testlerin teknik endişelerini ortadan kaldırmak için, son zamanlarda bir prot gösterdiFlüoresans Rezonans Enerji Transferi (FRET) 12 göre ein içermeyen döngü deneyi. Bu yöntemde, döngüye konformasyonları bir DNA molekülünün yapışkan uçlarının yakınında bağlı verici ve alıcı arasında FRET ile tespit edilir. Objektif tipi toplam iç yansıma flüoresans mikroskobu (TIRFM) geri loop ve uzun bir süre için hareketsiz kılınmış yüzeye tek bir DNA moleküllerinden unlooping etkinlikleri yörüngeleri kaydetmek için kullanılır. Bu yöntem, Vafabakhsh Ha ve 13 ile benzer bir yöntem üzerinde çok önemli bir gelişmedir uyumsuzluk içermeyen DNA molekülleri oluşturmak için DNA moleküllerinin PCR tabanlı bir montaj sağlar. Bu protokol, tek moleküllü bir yönü, FRET yönü bir hatta ligaz aktivitesi bozabilir koşullarda, aynı molekülde tekrar tekrar DNA ilmek dinamikleri ölçmek için sağlar Buna ek olarak dağılımlarının ölçüm ortalamalar topluluğa sağlar. TIRFM düzeneği Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Özel bir-Tasarlanmış numune aşama bir Olympus IX61 mikroskop vücuda yerleştirilir. 532 nm ve 640 nm lazerler tarafından tanıtıldı ve lamel-su arayüzünde geliş kritik açıyı elde etmek için yüksek NA objektif içine küçük eliptik ayna 14 tarafından yansıtılır. Daha yaygın bir dikroik ayna veya prizma bazlı TIR kurulumları kullanılarak objektif TIR da FRET, bu uygulama için kullanılabilir unutmayın. Mikroskop ile oluşan floresan görüntü bir dikroik ayna, verici ve alıcı görüntüleri ayrılmıştır. Daha sonra, bir EMCCD iki yarısı üzerine yeniden görüntülü. Ek uzun geçiş filtresi emisyon arka plan sinyali azaltmak için kullanılır. Sıcaklık kontrolü tekrarlanabilir kinetik verileri elde etmek için gereklidir. Sıcaklık kontrolü için, objektif, sıcaklık kontrollü bir soğutucu / ısıtıcı ısı transferi, ve su en aza indirmek için mikroskop vücudun burun parçası ayrılır sıkıca oturan bir pirinç bileziği yoluyla sirküle ediliramaç kılıfın altında iç metal etrafında. Bu kurulum 15 ve 50 ° C arasında lamel yüzey (Şekil 2) sağlam sıcaklık kontrolünü sağlamak mümkün. Bu çalışmada, örnek sıcaklığı 24 ° C&#39;de muhafaza edilmiştir Aşağıdaki protokol DNA yapımında, DNA şekil tahmini, tek molekül deney ve J faktör belirlenmesi için adım adım işlemi sunar.

<table><tbody><tr><td>Küçük DNA FRAG Özü Kiti-100PR</td><td>VWR</td><td>97060-558</td><td></td></tr><tr><td>Akrilamid% 40 çözelti 500 ml</td><td>VWR</td><td>97064-522</td><td></td></tr><tr><td>Bis-akrilamid %2 (a/h) çözelti 500 ml</td><td>VWR</td><td>97063-948</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp DNA Merdiveni, 100-1.000 bp</td><td>Fermentas</td><td>SM0241</td><td></td></tr><tr><td>Mini Dikey SAYFA Sistemi</td><td>VWR</td><td>89032-300</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga filtresi 0.2 & mu; m CS50</td><td>VWR</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813-1G</td><td>üçlü durum söndürücü</td></tr><tr><td>Protocatechuic asit (PCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08992-50MG</td><td>oksijen süpürme sistemi</td></tr><tr><td>Protocatechuate 3,4-Dioksijenaz (PCD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8279-25UN</td><td>oksijen süpürme sistemi</td></tr><tr><td>mPEG-silan, MW 2.000 1 g</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SIL-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-Silan, MW 3,400</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SIL-3400-1g</td><td></td></tr><tr><td>Avidin, NeutrAvidin Biotin Bağlayıcı Protein</td><td>İnvitrojen</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Sıcak Başlangıç Yüksek Sadakatli DNA Polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>F-540L</td><td></td></tr><tr><td>Jel/PCR DNA Parçaları Ekstraksiyon Kiti</td><td>IBI Bilimsel</td><td>IB47020</td><td></td></tr><tr><td>Birinci sınıf düz cam mikroskop slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>VWR mikro kapaklı cam, dikdörtgen, no. 1</td><td>VWR</td><td>48404-456</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Isotemp 1006S Devridaim Soğutucu/Isıtıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>sıcaklık kontrolü</td></tr><tr><td>Objektif Soğutma Yakası</td><td>Bioptechs</td><td>150303</td><td>sıcaklık kontrolü</td></tr><tr><td>KMI53 Biyolojik Mikrometre Ölçüm Aşaması</td><td>Semprex</td><td>KMI53</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Performanslı DPSS Lazer 532 nm 50 mW</td><td>Edmund optik</td><td>NT66-968</td><td>Cy3 uyarma</td></tr><tr><td>KÜP Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fiber, FC/APC Konnektör</td><td>Tutarlı</td><td>1139604</td><td>Cy5 uyarma</td></tr><tr><td>650 nm BrightLine Dikroik Işın Ayırıcı</td><td>Semrock</td><td>FF650-Di01-25x36</td><td>bölme dikroik</td></tr><tr><td>LaserMUX Işın Birleştirici, 514.5, 532 ve 543,5 nm lazerler, 25 mm</td><td>Semrock</td><td>LM01-552-25</td>, <td>dikroik</td></tr><tr><td>Brightline Floresan Filtresini birleştiren 593/40</td><td>Semrock</td><td>FF01-593/40-25</td><td>Cy3 emisyon filtresi</td></tr><tr><td>635 nm EdgeBasic LWP uzun geçiren Filtre, 25 mm</td><td>Semrock</td><td>BLP01-635R-25</td><td>Cy5 emisyon filtresi</td></tr><tr><td>EMCCD iXon+</td><td>Andor Teknolojisi</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>IX51 ters mikroskop çerçevesi</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective UApo N 100X/1.49 Yağ TIRF</td><td>Floresan</td> mikroskobu için Olympus <td></td><td></td></tr><tr><td>Daldırma yağı tip-F</td><td>Olympus</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>2 mm Çap 45&deg; Çubuk Lens Alüminyum Kaplı&nbsp;</td><td>Edmund optics</td><td>54-092</td><td>minyatür ayna</td></tr><tr><td>1/4" Seyahat Tek Eksenli Çeviri Aşaması</td><td>Thorlabs</td><td>MS-1</td><td>minyatür ayna</td></tr> <tr><td>ve Oslash çevirisi; 1" Akromatik İkili, ARC: 400-700 nm, f=200 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-200-A</td><td>odaklama lensi</td></tr><tr><td>Ayarlanabilir Mekanik Yarık</td><td>Thorlabs</td><td>VA100</td><td></td></tr><tr><td>Dielektrik Ayna</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E02</td><td></td></tr><tr><td>&Oslash; 1" Akromatik Çift, f = 100 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A</td><td>röle lensi</td></tr><tr><td>& oslash için lens yuvası; 1" Optik</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1</td><td></td></tr><tr><td>Dikroik Filtre Montajı</td><td>Thorlabs</td><td>FFM1</td><td></td></tr><tr><td>Sabit Kafes Küp Platform</td><td>Thorlabs</td><td>B3C</td><td></td></tr><tr><td>&oslash için kinematik montaj; 1" optik</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td></td></tr><tr><td>N-BK7 Plano-Dışbükey Lens, & Oslash; 1", f = 40 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1422-A</td><td>kolimasyon lensi</td></tr><tr><td>N-BK7 Plano-Dışbükey Lens, & Oslash; 6.0 mm, f = 15 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1222-A</td><td>teleskop lensi</td></tr><tr><td>N-BK7 Plano-Dışbükey Lens, & Oslash; 6.0 mm, f = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1433-A</td><td>teleskop merceği</td></tr></tbody></table>

tek molekül fret dna döngü oluşturma incelenmesi

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Iki-şeritli DNA (dsDNA) eğilmesi gibi DNA-protein tanıma ve nükleozom içine DNA paket gibi birçok önemli biyolojik süreçler ile ilişkilidir. DsDNA bükme Termodinamik kovalent bir dsDNA&#39;nın kısa yapışkan uçlarını birleştiren DNA ligaz dayanan bir yöntem denilen siklizasyonu tarafından incelenmiştir. Bununla birlikte, bu gibi bağlama verimliliği DNA katılan yapışkan uçlarını çevreleyen yapı ve ligaz gibi döngü dsDNA ile ilişkili olmayan bir çok faktör tarafından etkilenebilir, aynı zamanda, non-spesifik bağlanma gibi mekanizmalar yoluyla belirgin ilmek hızını etkileyebilir. Burada, biz FRET (Floresan Rezonans Enerji Transferi) tarafından geçici DNA döngü oluşumunu tespit ederek ligazın olmadan dsDNA ilmek kinetik ölçmek için nasıl göstereceğim. dsDNA molekülleri, FRET çifti ve bir biyotin bağlayıcı ile basit PCR tabanlı bir protokol kullanılarak inşa edilmektedir. J faktörü olarak bilinen döngü olasılık yoğunluk kapa iki döngü arasındaki oran ile tavlama oranı elde edilirted yapışkan biter. Farklı içsel eğriliğe sahip iki dsDNAs test ederek, J faktör dsDNA iç şekline duyarlı olduğunu göstermektedir.

Ilmekleme çalışma için kullanılan DNA molekülleri değişken sırasının uzunluğu ve her bir diğerine tamamlayıcı olan tek şeritli çıkıntılarının bir çift yönlü bölge oluşur. 7-baz uzunluğunda olan çıkıntılar, ilmekli durumunu yakalamak için birbirine bağlandığı olabilir. Her bir çıkıntı sitidin kimya yoluyla DNA omurgada bağlantılıdır Cy3 veya Cy5 ya da içerir. Cy5-çıkıntı da hareketsizleştirme yüzeyi (Şekil 4A) için biotin-TEG (15-atom Tetra-Etilen Glikol aralayıcı) ile bağlantılıdır. Tüm bu modifikasyonl...

Bu çalışma, tek bir molekül flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) kullanılarak çift sarmallı DNA ilmek dinamiklerini ölçmek için bir ayrıntılı deneysel prosedür sunmaktadır. Protokol ayrıca J faktörü denilen döngü olasılık yoğunluğunu ayıklamak için nasıl açıklar.

Tek Molekül FRET DNA döngü oluşturma incelenmesi

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, çift sarmallı DNA'nın döngü dinamiklerinin, DNA bağlayıcı proteinler kullanılmadan DNA'nın içsel şeklinden nasıl etkilendiğini araştırmaktır. Bu, boya moleküllerinin farklı eğriliklere sahip çift sarmallı DNA parçalarına dahil edilmesiyle elde edilir, böylece DNA döngüsü floresan rezonansı, enerji transferi veya fret ile izlenebilir. Tek DNA moleküllerinden gelen tersinir döngü ve döngüden çıkma olayları daha sonra toplam iç yansıma mikroskobu ile gözlemlenebilir.DNA'nın döngü hızı daha sonra her bir tek molekül floresansının zaman yörüngelerinden tahmin edilebilir. Nihayetinde, DNA'nın parçanın içsel şekli ile ilişkili olarak döngü olasılığı ölçülebilir. Bu DNA döngü testinin ana avantajı, A DNA'sının döngü kinetiğini etkileyebilecek A DNA bağlayıcı proteine dayanmamasıdır.Basit protokol, floresan rezonans, enerji transferi ve PCR tabanlı DNA sentezi adı verilen bir teknik kullanmakla ilgilidir. DNA'nın görünme olasılığını ölçmek için: 10 MER dizisini tekrarlayarak küresel olarak kavisli DNA'lar tasarlayarak başlayın. Örneğin, bu temsili dizi, 186 baz çifti eğri bir DNA'dır, burada X rastgele bir ekstra bazdır ve tekrar eden 10 mers dizisini çevreley

studying-dna-looping-by-single-molecule-fret

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, gerçek zamanlı olarak bireysel replisomes DNA replikasyonu görselleştirmek için basit bir tek-molekül floresan mikroskopi tekniği gösterir.

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

Biz bireysel DNA molekülleri bakteriyofaj çoğaltma sistemi proteinleri aracılığı ile gerçek zamanlı çoğaltma gözlemlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

Burada iki optik kapalı kalmış mikro-arasında asılı tek bir DNA molekülü ile etkileşim tek floresan etiketli protein molekülü tespit etmek için cihazları ve yöntemleri tarif etmektedir.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

Bu iletişim kuralı tek boyutlu (1 D) Difüzyon boyunca DNA moleküllerinin çalışmak için bir basit, sağlam ve yüksek üretilen iş tek molekül akışı uzanan tahlil göstermektedir.

Basit, sağlam ve yüksek üretilen iş tek bir molekül akışı germe tahlil uygulama boyunca DNA moleküllerinin taşıma eğitimi için

Burada, nucleosome parçacıklar, statik ve hızlandırılmış atomik kuvvet mikroskobu (AFM) görüntüleme teknikleri kullanılarak tek molekül düzeyinde karakterize etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yakalama yapısı ve dinamik oluşturarlar içinde olan yüzey functionalization yöntemi sağlar nano, yüksek çözünürlüklü.

Atomik kuvvet mikroskobu Imaging'i kullanma oluşturarlar dinamikleri ve yapısını sondalama

Burada, DNA üzerinde birleşen EWS-FLI1 kondensatlarının biyofiziksel mekanizmasını incelemek için tek moleküllü görüntüleme yöntemi olan DNA Perdeleri'nin kullanımını açıklıyoruz.

DNA Üzerine Birleştirilen EWS-FLI1 Kondensatlarının Tek Moleküllü Görüntülenmesi

Bu makale, tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için nükleozom içeren DNA bağlarının yeniden yapılandırılması için ayrıntılı bir deneysel prosedür sunmaktadır. Ayrıca, kromatin ile etkileşime giren proteinlerin bağlanma davranışını görselleştirmek ve nükleozomların fiziksel özelliklerindeki değişiklikleri analiz etmek için yapılabilecek birkaç aşağı akış deneyini açıklar.

Tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için yerinde nükleozom düzeneği

Bu protokol, CMG sarmal ile çözülen DNA'nın canlı görselleştirilmesi için tek moleküllü bir testin gerçekleştirilmesini gösterir. (1) bir DNA substratının hazırlanmasını, (2) floresan etiketli Drosophila melanogaster CMG helikazının saflaştırılmasını, (3) toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu için bir mikroakışkan akış hücresinin hazırlanmasını ve (4) tek moleküllü DNA çözme tahlilini açıklar.

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

Bu protokol, DNA polimerazlar ve G-dörtlü yapılar gibi engeller arasındaki etkileşimlerin gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlayan floresan mikroskobu tabanlı tek moleküllü DNA replikasyon testini ana hatlarıyla belirtir.

G-Dörtlülerinde DNA Polimeraz Dinamiğinin Tek Moleküllü Floresan Görselleştirmesi

Membran protein fonksiyonu, hücre zarı lipid bileşimi tarafından düzenlenir. Bu video-makale nasıl değişmiş membran özellikleri gazetecilere olarak çift katlı yama elektrotlar, hem de nasıl kullanılacağı gibi gramicidin kanallarını kullanarak bir yama oluşturmak için ayrıntıları.

Çift katlı Elastik Özellikleri İzleme Değişiklikler için Tek Molekül Yöntemleri

Keşfedin tek molekül FRET ile çift sarmallı DNA'nın döngü oluşum dinamiklerini protein bağlayıcı olmadan inceleyin. Bu yöntem, DNA'nın içsel eğriliğinin döngü davranışını nasıl etkilediğini ölçmenizi sağlar.

Tek Molekül FRET DNA döngü oluşturma incelenmesi

Daha fazla video keşfet