Prostat Hücrelerinin Yönlü Göç Eğitim için özel tasarlanmış galvanotaksis Chambers kullanılması

Bu prosedürün genel amacı, uygulanan bir elektrik alanındaki hücrelerin yönlü göçünü değerlendirmek için bir tahlil olan Galvan Axxis'i gerçekleştirmektir. Bu, önce bir Galvan axxis odasının birleştirilmesi ve ardından ilgilenilen hücrelerle tohumlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, hazne kapatılır ve hızlandırılmış görüntüleme için bir elektrik alanı uygulanır.

Son adımda, tek tek hücrelerin göç hızı ve elektrik alanına göre açı izlenir. Sonuçta istifa etmek. Hücrelerin elektrik alanına nasıl tepki verdiğini ve katoda yönlü olarak göç edip etmediklerini göstermek için kullanılabilir.

Bu tekniğin ana avantajı, ikincil analiz için Texas verildikten sonra kolay hücre alımı ve göçün yüksek büyütmede ve floresan etiketli hücrelerle filme alınabilme kolaylığıdır. Bu yöntemin görselleştirilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü bir oda montaj adımlarının gösteri olmadan öğrenilmesi zordur: Alt odaları monte etmek için. Plastik bir galvan axxis haznesini iki propanol ile silerek başlayın.

Ardından, haznenin alt tarafındaki dairesel açıklıkların etrafına deniz sınıfı silikon sızdırmazlık maddesi uygulamak için bir şırınga kullanın. Sızdırmazlık maddesinin üzerine büyük bir kapak camı yerleştirin ve bir pamuk aplikatörünün ucuyla yerine bastırın, fazla yapıştırıcıyı pamuklu çubukla silin. Ardından, altı x 25 milimetre boşluk bırakmak için küçük bir kapak camını kesmek için bir elmas nokta işaretleyici kullanın ve hazneyi ters çevirin.

Daha sonra, iki şerit silikon uygulamak için bir şırınga kullanın ve alt camdaki iki dairesel açıklık arasında hücre bağlantısı için 10 x 25 milimetrelik bir kanal yüzeyi oluşturun. Daha sonra dairesel açıklıklar arasına iki cam boşluk yapıştırın, boşlukları yeni bir pamuklu aplikatör ile aşağı doğru itin ve az önce gösterildiği gibi fazla yapıştırıcıyı silin. Silikon yapıştırıcı sertleşene kadar hazneyi 24 saat deneyin.

Ertesi gün, hücreleri hazneye ekmeden önce asetik asit kalıntısını yapıştırıcıdan çıkarmak için hazneyi gece boyunca damıtılmış suya batırın. Odaları az önce gösterildiği gibi iki propanol ile kurulayın ve silin. Bunları steril PB S3 ile defalarca yıkayın ve ardından haznelerdeki iki dairesel açıklık arasındaki sıvı akışını kontrol edin.

Odaların iyi çalışır durumda olduğunu onayladıktan sonra, steril kültür kaplarına koyun ve odaları 15 dakika boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin. Odalar dengelenirken, prostat hücrelerini 37 santigrat derecede beş mililitre tripsin EDTA ile kültür kabından ayırın. Beş dakika sonra, reaksiyonu beş mililitre% 10 FBS ile nötralize edin.

PBS'de, ayrılan hücreleri 15 mililitrelik tüplere aktarın ve ardından beş dakika boyunca santrifüjleyin. 200 kez, G, ortamı aspire edin ve ardından peleti bir mililitre ortamda yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri saydıktan sonra, hücre konsantrasyonunu kültür ortamı ve tohum ile mililitrede sekiz ila 10 ila dört hücreye ayarlayın.

Her odaya 350 mikrolitre hücre süspansiyonu. Odadaki hücreleri, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte ıslak bir Kim mendili ile bir kültür kabında gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, önce her bir galvaniz AXS odası için orta ila 37 santigrat derece olan 10 mililitre kültürü ısıtarak üst odaların montajına başlayın.

Ortam ısınırken, bir Galvan axxis odasını inkübatörden 37 santigrat derecelik bir ısıtma plakasına aktarın ve odayı kültür ortamı ile durulayın. Bağlanmamış hücreleri çıkarmak için, haznede 400 mikrolitre ortam bırakın ve ardından her iki cam boşluğun üzerine yüksek vakumlu gres uygulamak için bir şırınga kullanın. Hazneyi bir kapak camı ve pamuklu bir aplikatör ile kapatın ve ardından cam yüzeyi kurutun.

Ardından, kapak camı ile hazne arasındaki boşluğu kapatmak için yüksek vakumlu gresi bir şırınga ile uygulayın. Ve sonra kültür ortamını iç rezervuarlara ekleyin. Kabarcıkları çıkarın ve rezervuarlar arasındaki sıvı akışını kontrol edin.

Agar köprülerinin bir çift iki inçlik PVC tüpleri kesmesini sağlamak için, çevirin ve ardından parçaları 100 mililitrelik bir behere yerleştirin. Daha sonra,% 2 agar jeli yapmak için 10 mililitre kültür ortamı ile 50 mililitrelik bir şişeye 200 miligram bact toe agar ekleyin. 30 saniye mikrodalgada pişirdikten sonra, agar jelini plastik boruya yüklemek için bir transfer pipeti kullanın ve agar köprülerini katılaşmak için 10 dakika oda sıcaklığında bırakın.

Daha sonra, gal odasının dış rezervuarlarına iki mililitre kültür ortamı ekleyin ve göçün hızlandırılmış görüntülemesini gerçekleştirmek için akımı iletmek için agar köprülerini iç ve dış ortam rezervuarlarına yerleştirin. Galvan odasını mikroskop sahnesinde 37 santigrat derecelik bir çevre odasına aktararak, odayı bantla sabitleyerek ve 10 x objektif altındaki hücrelere odaklanarak başlayın. Ardından, Galvan Axxis elektrotlarını katot sağ tarafta olacak şekilde dış rezervuarlara yerleştirin, teli ve elektrotları bantla sabitleyin.

Ardından, odaya bir elektrik alanı uygulamak için güç kutusunu açın ve 25 milimetre uzunluğundaki oda için 2,5 volta ulaşmak için odadaki çıkış voltajını ölçmek için bir voltaj ölçer kullanın. Şimdi 10 zaman atlamalı film oluşturmak için hazne boyunca 10 nokta seçin ve çekim koşullarını iki saat boyunca 10 dakikalık aralıklarla ayarlayın. Ardından çekime başlayın ve deney sırasında alan gücünü korumak için çıkış akımını gerektiği gibi ayarlayın.

Deneyin sonunda, odayı sahneden çıkarın ve hücreleri% 95 alkolle sabitleyin. Sonra odayı kırarak açın. Kapak fişi daha sonra kullanılmak üzere kaydedilebilir.

Boyama ve görüntüleme. Gelecek yıllar için hazneyi temizleyin. Galvan Axxis'i ölçmek için, katodu görüntülerin en üstüne yönlendirmek için zaman atlamalı filmleri döndürün.

Filmleri hücre izleme yazılımına aktarın ve her filmden her zaman noktasında 10 ila 20 hücrenin XY konumunu, göç mesafelerini ve kuzey güney yönüne göre açıları manuel olarak izleyin, elektrik alanının aynı yönü hücre izleme yazılımında hesaplanacaktır. Son olarak, ölçümleri kaydedin ve birleştirilmiş sonuçları hesaplamak için verileri bir veritabanı uygulamasına aktarın. Bu temsili Galvan Axxis deneyinde, prostat hücrelerinin dizilerinin iki saat boyunca benzer hızlarda göç ettiği belirlendi.

Bununla birlikte, elektrik alanına yönlülük, PRNS bir hat için 0.7 artı eksi 0.3 ve PNT iki hat için 0.2 artı eksi 0.8 idi, bu da bu iki hücre hattının Galvan ekseninde önemli bir fark olduğunu gösteriyor, hücresel sinyalizasyon mekanizmalarının Govan Texas yönteminin geliştirilmesinden sonra elektrik alanına doğrudan diferansiyel göç tepkilerini gösteriyor. Bu teknik, araştırmacıların elektro alandaki yönlü hücre göçünün mekanizmalarını keşfetmelerine yardımcı olur.