Prostat Hücrelerinin Yönlü Göç Eğitim için özel tasarlanmış galvanotaksis Chambers kullanılması
7 Aralık 2014
Özel yapım bir galvanotoksis odasında göç eden, ölümsüzleştirilmiş prostat hücrelerine fizyolojik bir elektrik alanı uygulamak için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntemi kullanarak, 2 sıra tümörjenik olmayan prostat hücresinin sahada farklı derecelerde göç yönlülüğü gösterdiğini gösteriyoruz.
Bu prosedürün genel amacı, uygulanan bir elektrik alanındaki hücrelerin yönlü göçünü değerlendirmek için bir tahlil olan Galvan Axxis'i gerçekleştirmektir. Bu, önce bir Galvan axxis odasının birleştirilmesi ve ardından ilgilenilen hücrelerle tohumlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, hazne kapatılır ve hızlandırılmış görüntüleme için bir elektrik alanı uygulanır.
Son adımda, tek tek hücrelerin göç hızı ve elektrik alanına göre açı izlenir. Sonuçta istifa etmek. Hücrelerin elektrik alanına nasıl tepki verdiğini ve katoda yönlü olarak göç edip etmediklerini göstermek için kullanılabilir.
Bu tekniğin ana avantajı, ikincil analiz için Texas verildikten sonra kolay hücre alımı ve göçün yüksek büyütmede ve floresan etiketli hücrelerle filme alınabilme kolaylığıdır. Bu yöntemin görselleştirilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü bir oda montaj adımlarının gösteri olmadan öğrenilmesi zordur: Alt odaları monte etmek için. Plastik bir galvan axxis haznesini iki propanol ile silerek başlayın.
Ardından, haznenin alt tarafındaki dairesel açıklıkların etrafına deniz sınıfı silikon sızdırmazlık maddesi uygulamak için bir şırınga kullanın. Sızdırmazlık maddesinin üzerine büyük bir kapak camı yerleştirin ve bir pamuk aplikatörünün ucuyla yerine bastırın, fazla yapıştırıcıyı pamuklu çubukla silin. Ardından, altı x 25 milimetre boşluk bırakmak için küçük bir kapak camını kesmek için bir elmas nokta işaretleyici kullanın ve hazneyi ters çevirin.
Daha sonra, iki şerit silikon uygulamak için bir şırınga kullanın ve alt camdaki iki dairesel açıklık arasında hücre bağlantısı için 10 x 25 milimetrelik bir kanal yüzeyi oluşturun. Daha sonra dairesel açıklıklar arasına iki cam boşluk yapıştırın, boşlukları yeni bir pamuklu aplikatör ile aşağı doğru itin ve az önce gösterildiği gibi fazla yapıştırıcıyı silin. Silikon yapıştırıcı sertleşene kadar hazneyi 24 saat deneyin.
Ertesi gün, hücreleri hazneye ekmeden önce asetik asit kalıntısını yapıştırıcıdan çıkarmak için hazneyi gece boyunca damıtılmış suya batırın. Odaları az önce gösterildiği gibi iki propanol ile kurulayın ve silin. Bunları steril PB S3 ile defalarca yıkayın ve ardından haznelerdeki iki dairesel açıklık arasındaki sıvı akışını kontrol edin.
Odaların iyi çalışır durumda olduğunu onayladıktan sonra, steril kültür kaplarına koyun ve odaları 15 dakika boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin. Odalar dengelenirken, prostat hücrelerini 37 santigrat derecede beş mililitre tripsin EDTA ile kültür kabından ayırın. Beş dakika sonra, reaksiyonu beş mililitre% 10 FBS ile nötralize edin.
PBS'de, ayrılan hücreleri 15 mililitrelik tüplere aktarın ve ardından beş dakika boyunca santrifüjleyin. 200 kez, G, ortamı aspire edin ve ardından peleti bir mililitre ortamda yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri saydıktan sonra, hücre konsantrasyonunu kültür ortamı ve tohum ile mililitrede sekiz ila 10 ila dört hücreye ayarlayın.
Her odaya 350 mikrolitre hücre süspansiyonu. Odadaki hücreleri, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte ıslak bir Kim mendili ile bir kültür kabında gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, önce her bir galvaniz AXS odası için orta ila 37 santigrat derece olan 10 mililitre kültürü ısıtarak üst odaların montajına başlayın.
Ortam ısınırken, bir Galvan axxis odasını inkübatörden 37 santigrat derecelik bir ısıtma plakasına aktarın ve odayı kültür ortamı ile durulayın. Bağlanmamış hücreleri çıkarmak için, haznede 400 mikrolitre ortam bırakın ve ardından her iki cam boşluğun üzerine yüksek vakumlu gres uygulamak için bir şırınga kullanın. Hazneyi bir kapak camı ve pamuklu bir aplikatör ile kapatın ve ardından cam yüzeyi kurutun.
Ardından, kapak camı ile hazne arasındaki boşluğu kapatmak için yüksek vakumlu gresi bir şırınga ile uygulayın. Ve sonra kültür ortamını iç rezervuarlara ekleyin. Kabarcıkları çıkarın ve rezervuarlar arasındaki sıvı akışını kontrol edin.
Agar köprülerinin bir çift iki inçlik PVC tüpleri kesmesini sağlamak için, çevirin ve ardından parçaları 100 mililitrelik bir behere yerleştirin. Daha sonra,% 2 agar jeli yapmak için 10 mililitre kültür ortamı ile 50 mililitrelik bir şişeye 200 miligram bact toe agar ekleyin. 30 saniye mikrodalgada pişirdikten sonra, agar jelini plastik boruya yüklemek için bir transfer pipeti kullanın ve agar köprülerini katılaşmak için 10 dakika oda sıcaklığında bırakın.
Daha sonra, gal odasının dış rezervuarlarına iki mililitre kültür ortamı ekleyin ve göçün hızlandırılmış görüntülemesini gerçekleştirmek için akımı iletmek için agar köprülerini iç ve dış ortam rezervuarlarına yerleştirin. Galvan odasını mikroskop sahnesinde 37 santigrat derecelik bir çevre odasına aktararak, odayı bantla sabitleyerek ve 10 x objektif altındaki hücrelere odaklanarak başlayın. Ardından, Galvan Axxis elektrotlarını katot sağ tarafta olacak şekilde dış rezervuarlara yerleştirin, teli ve elektrotları bantla sabitleyin.
Ardından, odaya bir elektrik alanı uygulamak için güç kutusunu açın ve 25 milimetre uzunluğundaki oda için 2,5 volta ulaşmak için odadaki çıkış voltajını ölçmek için bir voltaj ölçer kullanın. Şimdi 10 zaman atlamalı film oluşturmak için hazne boyunca 10 nokta seçin ve çekim koşullarını iki saat boyunca 10 dakikalık aralıklarla ayarlayın. Ardından çekime başlayın ve deney sırasında alan gücünü korumak için çıkış akımını gerektiği gibi ayarlayın.
Deneyin sonunda, odayı sahneden çıkarın ve hücreleri% 95 alkolle sabitleyin. Sonra odayı kırarak açın. Kapak fişi daha sonra kullanılmak üzere kaydedilebilir.
Boyama ve görüntüleme. Gelecek yıllar için hazneyi temizleyin. Galvan Axxis'i ölçmek için, katodu görüntülerin en üstüne yönlendirmek için zaman atlamalı filmleri döndürün.
Filmleri hücre izleme yazılımına aktarın ve her filmden her zaman noktasında 10 ila 20 hücrenin XY konumunu, göç mesafelerini ve kuzey güney yönüne göre açıları manuel olarak izleyin, elektrik alanının aynı yönü hücre izleme yazılımında hesaplanacaktır. Son olarak, ölçümleri kaydedin ve birleştirilmiş sonuçları hesaplamak için verileri bir veritabanı uygulamasına aktarın. Bu temsili Galvan Axxis deneyinde, prostat hücrelerinin dizilerinin iki saat boyunca benzer hızlarda göç ettiği belirlendi.
Bununla birlikte, elektrik alanına yönlülük, PRNS bir hat için 0.7 artı eksi 0.3 ve PNT iki hat için 0.2 artı eksi 0.8 idi, bu da bu iki hücre hattının Galvan ekseninde önemli bir fark olduğunu gösteriyor, hücresel sinyalizasyon mekanizmalarının Govan Texas yönteminin geliştirilmesinden sonra elektrik alanına doğrudan diferansiyel göç tepkilerini gösteriyor. Bu teknik, araştırmacıların elektro alandaki yönlü hücre göçünün mekanizmalarını keşfetmelerine yardımcı olur.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, özel yapım bir galvanotaksi odası kullanarak göç eden, ölümsüzleştirilmiş prostat hücrelerine fizyolojik bir elektrik alanı uygulama yöntemi sunmaktadır. Sonuçlar, iki tümör oluşturmayan prostat hücre hattının elektrik alanına tepki olarak farklı göç yönlendirme dereceleri sergilediğini göstermektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre göçü
- Elektrofizyoloji
- Prostat kanseri araştırması
Arka Plan
- Galvanotaksi, hücrelerin elektrik alanına tepki olarak yönlendirilmiş hareketidir.
- Bu yöntem, kanser araştırmalarında hücresel davranışı anlamaya yardımcı olabilir.
- Ölümsüzleştirilmiş prostat hücreleri, tümör oluşturmayan hücre davranışı çalışmalarında bir model olarak hizmet vermektedir.
- Farklı hücre hatları elektrik alanlarına değişik şekillerde tepki verebilir.
Çalışmanın Amacı
- Elektrik alanında prostat hücrelerinin yönlü göçünü değerlendirmek.
- Farklı tümör oluşturmayan prostat hücre hatlarının göç davranışlarını karşılaştırmak.
- Galvanotaksi'yi in vitro olarak incelemek için güvenilir bir yöntem kurmak.
Kullanılan Yöntemler
- Özel galvanotaksi odasının montajı.
- Odanın ölümsüzleştirilmiş prostat hücreleri ile tohumlanması.
- Zaman aşımlı görüntüleme sırasında elektrik alanının uygulanması.
- Bireysel hücre göç hızı ve elektrik alanın yönüne göre yönünün izlenmesi.
Ana Sonuçlar
- İki tümör oluşturmayan prostat hücre hattı farklı derecede yönlü göç sergiledi.
- Hücreler katota doğru göç etti, bu da elektrik alanın tepkisine işaret etmektedir.
- Göç hızı ve açıların nicel analizi yapıldı.
- Yöntem, elektrik alanları altında prostat hücrelerinin davranışları hakkında bilgiler sağlamaktadır.
Sonuçlar
- Galvanotaksi odası, hücre göçünü incelemek için etkili bir araçtır.
- Farklı prostat hücre hatları, elektrik alanlarına tepki olarak farklı göç kalıpları sergiler.
- Bu araştırma, hücresel davranışlarda elektrik alanlarının rolünü anlamaya katkıda bulunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables mechanistic de-risking of prostate cell migration phenotypes by quantifying directional responses to physiological electric fields, supporting target validation in early discovery. The custom galvanotaxis chamber provides a reproducible, disease-relevant system for assessing intrinsic migratory behavior, which can inform lead identification strategies by highlighting functional differences between cell models. Such electrophysiological profiling adds predictive confidence to preclinical models by linking cellular signaling mechanisms to functional outputs under controlled stimuli.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by revealing differential intrinsic features governing directional migratory responses between prostate cell lines.
- Operational Value: Enables biological de-risking through quantitative measurement of migration speed and angle relative to cathode-directed galvanotaxis.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying cell line-specific signaling mechanisms that modulate electrotaxis, informing target confidence assessments.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems using low-cytotoxicity, reusable PVC chambers and platinum electrodes for standardized electrotaxis screening.
- Quantitative Outputs: Generates migration speed and directional persistence metrics via time-lapse imaging and cell tracking software, enabling reliable compound evaluation.
- Scalability: Facilitates platform reuse through agar bridge-mediated current conduction and motorized stage imaging, supporting assay standardization across runs.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses SV40-immortalized prostate cell lines (pRNS-1-1 and PNT2) as a disease-relevant system to model non-tumorigenic cell behavior under electrophysiological cues.
- Translational Continuity: Links discovery-stage galvanotaxis measurements to preclinical risk-adjusted advancement by revealing differential electrotaxis that may reflect underlying pathway activity.
- Mechanistic De-risking: Highlights how cellular signaling mechanisms direct differential migration responses to electric fields, reducing ambiguity in target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The galvanotaxis assay integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, providing electrophysiological readouts that complement biochemical and imaging-based screening cascades.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how prostate cell lines directionally migrate in applied electric fields, clarifying pathway-dependent migratory phenotypes.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized chamber assembly, sterile equilibration, and time-lapse imaging under controlled field strength (2.5 V across 25 mm chamber).
- Analytics: Enables comparative analysis via exported time-lapse movies, manual XY tracking, and calculation of migration angles relative to the electric field north-south orientation.
- Translational Research: Connects galvanotaxis outcomes to preclinical continuity by identifying intrinsic migratory differences that may predict differential responses in complex microenvironments.
- Enterprise Reuse: Positions the chamber as a reusable capability due to affordable, autoclavable components and modular design allowing glass surface modifications and cell treatments.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through quantitative galvanotaxis metrics that reduce mechanistic ambiguity in cell migration studies.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via sealed chambers, agar bridges, and motorized stage imaging, minimizing variability in electrotaxis measurements.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by revealing cell line-specific electrotaxis profiles that inform capital allocation in early-stage target programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through differential directionality measurements (e.g., 0.7±0.3 vs 0.2±0.8) that reflect intrinsic migratory phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, microfluidic chamber assembly, and time-lapse microscopy for reliable galvanotaxis execution.
- Dependent on instrumentation including motorized microscope stages, voltage meters, and cell tracking software for quantitative directional analysis.
- Necessitates cross-team standardization of chamber sealing protocols (silicone application, agar bridge preparation) to ensure consistent current conduction.
- Involves adaptation considerations when modifying glass surfaces or testing extracellular matrix coatings on chamber substrates for cell attachment studies.
- Includes practical limitations such as the 24-hour silicone curing time and overnight chamber soaking to remove acetic acid residue before cell seeding.
