Name: Epizomlar ve HDAC inhibitörleri kullanarak Blood Verimli iPS Hücre Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Öğrenin epizomal plazmidler ve HDAC inhibitörleri kullanarak periferik kandan entegrasyonsuz iPSC üretimini. Bu yöntem, viral vektörlerin neden olduğu insertiyonel mutagenez riskini ortadan kaldırarak güvenli kök hücre elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, bu araştırmayı desteklemek için NIH aşağıdaki hibe kabul etmek istiyorum: K08DK082783 (AR), P30DK56465 (BTS), U01HL099993 (BTS), T32HL00715036 (SKS) ve K12HL0806406 (SKS); ve JP McCarthy Vakfı (AR).

Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi Kurumsal Değerlendirme Kurulları ve Çocuklar &quot;ın Philadelphia Hastanesi tarafından onaylanan, yazılı izin, periferik kan örneği alınmadan önce hastalardan elde edilmiştir. Tüm kurumsal düzenlemeler gözlendi. MEF nesil dahil olmak üzere tüm hayvan deneyleri ve teratom oluşumu Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. PBMC&#39;lerin ve eritroblast Genişleme 1. Ficoll Ayırma - Gündüz 0 <ol><li> Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) ile 1: Çevresel kan 1 seyreltin. Bir 15 ml&#39;lik yuvarlak dipli bir polistiren bir tüpte, dikkatli bir şekilde oda sıcaklığında, Ficoll-Hypaque 3 ml&#39;lik seyreltilmiş kan 7 ml katman. </li><li> 30 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> PBMC&#39;ler plazma ve bulanık beyaz bir tabaka halinde görülmektedir Ficoll-Hypaque arasındaki arayüz yerleşmiş olacaktır. Steril bir transfer pipet kullanarak, PB toplamakBir 15 ml konik tüp içine MH&#39;si. DPBS kullanarak 10 ml ses getirmek. </li><li> Hemasitometre, PBMC&#39;Ierde saymak. </li><li> 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de ayrı 15 ml konik tüp ve santrifüj içine Pipet 2 × 10 6 PBMC&#39;leri. % 90 fetal sığır serumu (FBS) /% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 2 x 10 6 PBMC / ml lik bir konsantrasyonda kalan hücrelerin ve dondurularak aşağı doğru dönerler. </li><li> Genişletme maddesi hazırlayın: QBSF-60 serum barındırmayan ortam hücre faktörü (ışıktan koruma) + Penisilin / streptomisin (% 1) + askorbik asit (50 ng / ml) + kök (SCF, 50 ng / ml) + interlökin 3 (IL- 3, 10 ng / ml) + eritropoietin (EPO, 2 U / ml) +, insülin benzeri büyüme faktörü 1 (IGF-1, 40 ng / ml) + deksametazon (1 uM, ışıktan korumak, taze bir kısım çözülme her medya ) değiştirebilirsiniz. </li><li> Taze genleşme maddesi, 2 ml içinde süspanse 2 x 10 6 PBMC 12 çukurlu bir doku kültür plakasının bir oyuğuna yerleştirmek ve 5 olan bir atmosfere sahip 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör% O2,% 5 CO2 ve% 90 N2. </li><li> Gün 3 ve 6. günde, ortamı değiştirin. <ol><li> Hücreleri toplamak ve kalan hücrelerin toplanması için QBSF-60, 2 ml ile iyice yıkayın. </li><li> 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücre süspansiyonu santrifüj ve süpernatant aspire. </li><li> Yeni Genişleme Orta 2 ml hücreleri tekrar ve aynı 12 plaka onları geri. </li></ol></li></ol> Nucleofection tarafından 2. yeniden programlanması Hücreler - Gün 9 <ol><li> Steril bir 1.5 mi Eppendorf tüpüne (Tablo 1) yeniden programlama plazmidleri Pipet. </li><li> Steril 1.5 ml&#39;lik Eppendorf tüpü içine Supplement (imalatçısı tarafından sağlanan) ve pipet ile nucleofection çözelti karıştırın. </li><li> Pipet 2, bir nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör içinde 12 oyuklu plaka ve yer arasında bir oyuğuna genişletme maddesi (% 5 O2,% 5 CO2 ve% 90 N2) önce hücreler ilave edilmeden dengeleme için mi. </li><li> Toplamakkültürlenmiş hücreler kalan hücrelerin toplanması için QBSF-60, 2 ml ile iyice yıkayın ve. </li><li> 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücreleri Santrifüj ve süpernatant aspire. </li><li> DPBS 5 ml yeniden süspansiyon haline getirilmesini ve 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler yıkayın. </li><li> Süpernatant aspire. </li><li> Üreten kabarcıkları önlemek için özen, nucleofection solüsyonu + Supplement 100 ul hücre pelletini. </li><li> Aşağı bir kez yeniden programlama plazmidler, pipet ve içeren tüp içine hücre süspansiyonu pipetle ve nucleofection küvetinin dibine örnek pipetle. </li><li> Nucleofection makinenin içine küvet ve çalıştırmak Programı T-019 yerleştirin. </li><li> Nucleofection küvetin içine (Adım 2.3 dengelenmesi plaka) prewarmed Expansion Orta 100 ul aktarın. </li><li> Hemen önceden ısıtılmış Genişleme Orta kuyuya tüm örnek ve mevduat toplamak. Beyaz, yüzen ölü hücre artıkları toplama kaçının. </li&gt; <li> Büyüme için, nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör (% 5 O2,% 5 CO2 ve% 90 N2) altında levhayı yerleştirin. </li></ol> 3. Kaplama Besleyici Hücreler - Gün 10 ya da 11 <ol><li> 10. günde, levha besleyici hücreler. <ol><li> Jelatin ile kaplayın, bir 6 oyuklu doku kültürü plakası. <ol><li> Pipet, plakanın her oyuğuna Hank Tamponlu Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde 1 M,% 0.1 jelatin. </li><li> En az 5 dakika süreyle, nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör plaka koyun. </li><li> Kullanmadan hemen önce, plakadan jelatin solüsyonu aspire. </li></ol></li><li> Ön ısıtması yapılan MEF Media (Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + FBS (% 10) + Penisilin / streptomisin (% 1)), 10 ml 3,000 cGy ile ışımaya 2 x 10 6 fare embriyonik fibroblastlar bir şişe çözülme. </li><li> 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücreleri Santrifüj ve süpernatant aspire. 12 MEF Medya ml ve pipet 2 ml hücreleri tekrar süspansiyon ijelatin kaplı 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna nGoogle&#39;a. Ortalama 12 olana kadar, bir nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör (% 5 O2,% 5 CO2 ve% 90 N2) altında levhayı yerleştirin. </li></ol></li></ol> 4. Besleyici Hücreleri Hücreler Kaplama ve Orta değiştirme - Gün 12 <ol><li> Bir adet 15 ml konik tüp nucleofected hücreleri toplamak ve QBSF-60 kuyu ile 2 ml yıkayarak kalan hücreleri toplamak. 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Hazırlama yeniden programlanması Orta: Iscove Modifiye Dulbecco ortamı (IMDM) içinde + FBS (% 10) + hayvansal olmayan L-glutamin (1 mM) + esansiyel olmayan amino asitler (NEAA,% 1) + Penisilin / streptomisin (% 1) + β P-mersaptoetanol (0.1 mM) + temel fibroblast büyüme faktörü + Askorbik asit (bFGF besleme, 10 ng / ml taze ilave edilmiş) (50 ug / ml, besleme taze ilave edildi). </li><li> Süpernatant aspire ve yeniden programlanması Orta 12 ml hücreleri tekrar süspansiyon. Hücre süspansiyonunun oyuk başına Pipet 2 ml &#39;si içerisinebesleyici hücreler 6 oyuklu plaka (ve Bölüm 3&#39;te hazırlandı). Oda sıcaklığında 30 dakika için 50 x g&#39;de plaka santrifüjleyin. </li><li> Büyüme için, nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör (% 5 O2,% 5 CO2 ve% 90 N2) altında levhayı yerleştirin. IPSC koloniler (1-2 hafta) görünmeye başlaması kadar yeniden programlanması Medium her gün değiştirin. </li><li> HESC Orta hazırlayın: DMEM / F12 1: 1 + nakavt Serum Replacement (% 20) + penisilin / streptomisin (% 1) + MEM&#39;dir (% 1) + hayvansal olmayan L-glutamin (1 mM) + sodyum piruvat (1%) + sodyum bikarbonat (% 0.12) + β-mersaptoetanol (0.1 mM) +, bFGF (besleme taze ilave edilmiş 10 ng / ml) </li><li> HDAC inhibitörleri hazırlayın: (besleme taze eklendi, 100 iM) sodyum bütirat, suberanilohydroxamic asit (SAHA, 200 nM, beslenme taze eklendi). IPSC koloniler görünür kez, her gün değişen orta, HESC Orta + HDAC inhibitörleri ile hücrelerini besleyerek başlar. Not: Sodyum butirat plastik borular üzerine adsorbe küçük bir molekül olduğu, t&#39;ninherefore 4 ° C&#39;de bir borosilikat cam tüp içinde saklayın. </li></ol> 5. Yalıtımlı iPSC Klonlar <ol><li> IPSC koloni (20-25 hücre) izole edilmesi için yeterince büyük olan bir kez, bir P20 pipet ile çekme. </li><li> HDAC inhibitörleri hazırlayın: sodyum butirat (beslenme taze eklendi, 100 M), SAHA (200 nM, beslenme taze eklendi) </li><li> HESC Orta + HDAC inhibitörleri + Klonlama ve Kurtarma eki içeren bireysel 35 mm yemekleri iMEFs üzerine izole koloniler yerleştirin. </li><li> Gün koloniler toplandıktan sonra, HESC Orta + HDAC inhibitörleri orta değiştirmek. </li><li> IPSC koloniler geçiş için hazır olana kadar her gün orta değiştirin. </li><li> Koloniler pasajda 2-3 stabilize bir kez ortamdan HDAC inhibitörleri çıkarın. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Koche, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+expression+initiates+widespread+targeted+chromatin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodeling.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 96-105 (2011).</li>
<li>Baum, C., Kustikova, O., Modlich, U., Li, Z., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+and+oncogenesis+by+chromosomal+insertion+of+gene+transfer+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors.</a> Human Gene Therapy. 17 (3), 253-263 (2006).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324 (5928), 797-801 (2009).</li>
<li>Hong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+induced+pluripotent+stem+cell+generation+by+the+p53-p21+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway.</a> Nature. 460 (7259), 1132-1135 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Yates, J. L., Warren, N., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+replication+of+plasmids+derived+from+Epstein-Barr+virus+in+various+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells.</a> Nature. 313 (6005), 812-815 (1985).</li>
<li>Ware, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibition+elicits+an+evolutionarily+conserved+self-renewal+program+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibition elicits an evolutionarily conserved self-renewal program in embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (4), 359-369 (2009).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butyrate+greatly+enhances+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+promoting+epigenetic+remodeling+and+the+expression+of+pluripotency-associated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes.</a> Stem Cells. 28 (4), 713-720 (2010).</li>
<li>Azuara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+signatures+of+pluripotent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin signatures of pluripotent cell lines.</a> Nature Cell Biology. 8 (5), 532-538 (2006).</li>
<li>Sommer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+peripheral+blood+using+the+STEMCCA+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector.</a> J. Vis. Exp. (68), e4327(2012).</li>
<li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5, 237-241 (2009).</li>
<li>Abbondanzo, S. J., Gadi, I., Stewart, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Embryonic+Stem+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Derivation of Embryonic Stem Cell Lines.</a> Methods in Enzymology. 225, 803-823 (1993).</li>
<li>Kim, H. J., Bae, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors%3A+molecular+mechanisms+of+action+and+clinical+trials+as+anti-cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs.</a> American Journal of Translational Research. 3 (2), 166-179 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Bu protokolü kullanarak başarılı iPSC nesil için, dikkat edilmesi gereken birkaç önemli uyarılar vardır. Sapmalar hedef progenitör hücre popülasyonunun verimsiz stimülasyonu ve iPSC nesil daha düşük bir verimliliğe neden olabileceğinden erythroblast genişletme aşamasında, ortam değiştirme programı sıkı, takip edilmelidir. Her ortam değişimi ile taze deksametazon ile yeni genişleme orta yapmak önemlidir; ve QBSF-60 taban ortamı deksametazon ve depolama sırasında ışıktan korunmalıdır. Nucleofection boyunca DPBS yıkama yay...

iPSCs pluripotense genlerin en az sayıda ektopik ekspresyonu ile somatik dokularından elde edilmektedir. Bu teknik, ilk olarak yüksek bir pluripotent durumda 1 olarak ifade edilmiştir Oct4, Sox2, Klf4 ve c-myc insan fibroblastları, retroviral kalıt ile gösterilmiştir. Bu geçici ifade &quot;yeniden programlama faktörleri&quot; insan embriyonik kök hücreleri 2 hedef hücrenin epigenetik peyzaj ve gen ifadesi profili benzer değiştirebilir. Oluşturulan kez, iPSCs potansiyel ileri soruşturma için herhangi bir doku tipinin içine ayırt edilebilir. Böylece, rejeneratif tıpta, hastalık modelleme ve gen terapisi uygulamalarında kullanılmak için umut vermektedir. Ancak, entegre virüs ile genomu bozan endojen gen ifadesinin, etkisi hücresel fenotip değiştirme potansiyeline sahiptir, ve sonuçta bilimsel sonuçlarını taraflı. Ayrıca, rastgele viral entegrasyonlar zararlı hücresel e yol açabilirmalign transformasyon 3 veya onkojenik transgenlerin 4 yeniden ifade olasılığı dahil olmak üzere fektleri. Gelecekteki klinik uygulamalar, entegre iPSC nesil gerektirir. Ekstra kromozomal dairesel DNA molekülleri epizomları, maliyet etkin, entegrasyon-ücretsiz iPSCs 5 üretmek için bir strateji sunar. Tablo 1 &#39;de gösterilen epizomal vektörlerin kombinasyonu yeniden programlama Oct4, Sox2, Klf4 MYCL ve LIN28A faktörleri ifade eder. PCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F Plazmid aynı zamanda hücre yeniden programlama 6 geliştirmek için TP53 geçici bastırılması için bir p53 shRNA içerir. Çoğaltma eksik pCXWB-EBNA1 vektör EBNA1 ifade 7 geçici bir artışa sağlayarak yeniden programlama faktörleri büyütülmesine ve artan yeniden programlama verimliliğini teşvik. PCXLE_EGFP plazmid deterjanları amacıyla nucleofection karışımına ilave edilebilirhücre tasnif uygulamalar için transfeksiyon verimliliğinin veya rmining. P CXWB-EBNA1 dışında, bu protokolde kullanılan epizomal plasmidleri konakçı hücrenin, 8 bölünme sırasında replikasyonu ve epizom bölümü vasıta olan viral replikasyon ve EBNA1 gen, Epstein-Barr virüsü kopyalama kaynağını kullanır. Epizomları kendiliğinden ardışık iPSC genişleme 7 ile kaybolur. Alt-klonlama ve EGFP ifade kaybı anlaşılacağı epizomal vektör kaybı ile iPSCs karakterizasyonu, gelecekte yapılacak klinik uygulamalarda tamamen entegrasyon bilgilerini iPSCs yol açabilir. IPSC nesil işleminden dolayı soyundan bir genin bastırılması ve pluripotense ilişkili genlerin reaktivasyonu. Gen ekspresyonunun düzenlenmesi hedef transkripsiyon faktörleri için DNA&#39;nın ve kromatin modifikasyon, düzenleyici DNA elemanları, RNA polimeraz erişimi, çekirdek içinde birden fazla seviyede gerçekleşirgenleri yer alır. Küresel kromatin modifikasyonları ile epigenetik manzara Tadilat yeniden ifade için önemli bir bileşeni Pluripotency genetik program olduğunu. Gen ekspresyonunun düzenlenmesinde önemli olan bir özel kromatin modifikasyon histon-DNA bobinin azalma gerilim üzerinden hedef genlere erişim sağlar, özellikle lizin kalıntıları ile histonların asetilasyon, bir. HDAC inhibitörleri, bağlı asetillenmiş durumunu 11 desteklenmesi için muhtemelen iPSC yeniden programlama ve HESC kendini yenileme 9,10 artırmak için gösterilmiştir küçük moleküllerdir. Entegre lentivirüsler 12 kullanan önceki bir yayında uyarlanan Aşağıda tarif edilen protokol, periferal kan kullanılarak epizomlar ve HDAC inhibitörleri optimize iPSC üretimi için bir adım-adım bir yöntem sağlar. Burada kullanılan adı geçen HDAC inhibitörü konsantrasyonları Ware tarafından tarif edilenler yarısı olan, ve ark., 9 ve rutin standart üzerinde tam Yeniden programlanan iPSC kolonideki 2 kat artışa yol açmıştırHDAC inhibitörleri olmadan episomal yeniden programlama protokolleri. Yeniden programlama Bu düzeyde Lentiviral yöntemleri ile dikkat verimliliği ile eşit olduğunu. Bu protokolü kullanarak, verimli yaş 87 yıl gibi eski kişilerden iPSC yarattı.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-750</td><td>4 ° C'de saklayın. Kullanmadan önce oda sıcaklığına ısıtın.</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14190-250</td><td>4 &�C'de saklayın.</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11875-093</td><td>4 &� C'de saklayın.</td></tr><tr><td>fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10437028</td><td>-20 ° C'de saklayın; İhtiyaç duyulana kadar C. Çözülme, aliquot, 4 &°C'de saklayın.</td></tr><tr><td>dimetil sülfoksit (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>154938</td><td>Oda sıcaklığında saklayın.</td></tr><tr><td>QBSF-60 serumsuz orta</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-983-234</td><td>4 &� C'de saklayın.</td></tr><tr><td>penisilin / streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140122</td><td>4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Hücre Hattı Nükleofektör Kiti V</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>% 2 jelatin çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td>4 &°C'de saklayın; C, 37 derecede sıvılaştırın; Kullanmadan önce C su banyosu.</td></tr><tr><td>Hank'in Dengeli Tuzlu Su Çözeltisi (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td>4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>Mağazası 4 &� C'de.</td></tr><tr><td>Iscove'un Modifiye Dulbecco's Medium (IMDM)</td> <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12440-061</td><td>Mağazası 4 ° C'de.</td></tr><tr><td>L-glutamin, 200 mM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25030-081</td><td>Aliquot, -20 ° C'de dondurun.</td></tr><tr><td>esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>4 &� C'de saklayın; C, ışıktan uzak.</td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12, 1: 1</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30023.02</td><td>4 &°C'de saklayın.</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replasman Ömrü Teknolojileri</td><td></td><td>10828-028</td><td>Aliquot, -20 ° C'de dondurun.</td></tr><tr><td>sodyum piruvat, 100 mM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11360-070</td><td>4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>sodyum bikarbonat, %7,5Life</td> <td>Technologies</td><td>25080094</td><td>4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF)</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0263</td><td>DPBS'de 10 mg / ml stok yapın, alikot, -20 ° C'de dondurun. Çözüldükten sonra 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>sodyum bütirat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887-1G</td><td>DPBS'de 2000x stok (400 mM) yapın, aliquot, -20 ° C'de dondurun. Çözüldükten sonra 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>hES Hücre Klonlama & Kurtarma Takviyesi</td><td>Stemgent</td><td>01-0014-500</td><td>-20 &°C'de saklayın; İhtiyaç duyulana kadar C. Çözüldükten sonra 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>ESC nitelikli BD matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>35-4277</td><td>Gece boyunca buz üzerinde 4 ° C'de çözdürün; C, önceden soğutulmuş pipet uçlarını kullanarak önceden soğutulmuş tüplere alikot. -20 ° C'de saklayın; İhtiyaç duyulana kadar C. 4 ° C'de çözülün; C, hemen kullanın.</td></tr><tr><td>StemSpan SFEM&nbsp;</td><td>KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ</td><td>9650</td><td>Aliquot, -20 ° C'de dondurun.</td></tr><tr><td>askorbik asit, toz haline getirilmiş</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403-100MG</td><td>DPBS'de 5 mg / ml stok yapın, steril filtre, 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>rekombinant insan kök hücre faktörü (SCF)</td><td>R & D Sistemleri</td><td>255-SC-010</td><td>100 &mu yapın; SFEM'de g/m stoğu, alikot, -20 &� C'de donma. Çözüldükten sonra 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>rekombinant insan interlökin 3 (IL-3)</td><td>R & D Sistemleri</td><td>203-IL-010</td><td>100 &mu yapın; SFEM'de g/ml stoğu, alikot, -20 ° C'de dondurun. Çözüldükten sonra 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>eritropoietin (EPO)</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>287-TC-500</td><td>SFEM'de 1000 U/ml stok yapın, alikot, -20 ° C'de dondurun. Çözüldükten sonra 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>rekombinant insan insülin benzeri büyüme faktörü 1 (IGF-1)</td><td>R & D Sistemleri</td><td>291-G1-200</td><td>100 & mu yap; SFEM'de g/ml stoğu, alikot, -20 ° C'de dondurun. Çözüldükten sonra 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td>DPBS'de 1000x stok (100 mM) yapın.</td></tr><tr><td>deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902-25MG</td><td>50x stok yapın (50 &mu; M) DPBS'de, steril filtrede, 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>SAHA (vorinostat)</td><td>Cayman Chemical</td><td>149647-78-9</td><td>DPBS'de 2.000x stok (400 mM) yapın, alikot, -20 ° C'de dondurun. Çözüldükten sonra 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>12 kuyulu doku kültürü plakası</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konik tüp</td><td>Sarstedt</td><td>62553002</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf tüpü</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu doku kültürü plakası</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>35 mm doku kültürü plakası</td><td>BD Biosciences</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>10 ml tek kullanımlık serolojik pipetler</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>5 ml tek kullanımlık serolojik pipetler</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-22</td><td></td></tr><tr><td>2 ml tek kullanımlık serolojik pipetler</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-17</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l pipet uçları, bariyer uçları</td><td>Genessee</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>cam Pasteur pipetleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>pipet yardımı</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-15</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3/4-shp53-F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-EGFP</td><td>Addgene</td><td>27082</td><td></td></tr><tr><td>pCXWB-EBNA1</td><td>Addgene</td><td>37624</td><td></td></tr></tbody></table>

epizomlar ve hdac inhibitörleri kullanarak blood verimli ips hücre Üretimi

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

Bu yazıda verimli episomal plazmitlerini ve histon deasetilaz (HDAC) inhibitörleri kullanılarak periferik kandan entegrasyonu-özgür insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerini (iPSCs) oluşturmak için bir protokol göstermektedir. Bu yaklaşımın avantajı şunlardır: (1) bir kaynak malzeme olarak periferal kan minimal bir miktarda kullanımı; (2) yeniden programlama vektörleri nonintegrating; (3) vektörü bilgilerini iPSCs üretilmesi için ekonomik bir yöntem; (4) tek bir transfeksiyon; ve (5) küçük moleküllerin kullanımı epigenetik yeniden programlama kolaylaştırmak için. Tekrar programlanması için oldukça müsait bir yüksek proliferatif eritrosit projenitör hücre popülasyonu elde etmek için kısa bir süre, periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC), rutin flebotomi örnekleri izole edilir ve tanımlanmamış başka büyüme faktörleri içinde kültürlenmiştir. Nonintegrating, Oct4, Sox2, Klf4 MYCL, LIN28A ve p53 kısa saç tokası (sh) RNA&#39;yı ifade bulaşıcı olmayan epizomal plasmidleri introdu vardırTek nucleofection ile türetilmiş eritroblast içine ced. Yeşil floresan proteini gelişmiş sentezleyen bir epizom (eGFP) olarak kotransfeksiyon transfekte hücrelerin kolay tanımlama sağlar. Epstein-Barr çekirdek antijeni 1 (EBNA1) ifade eden ayrı bir replikasyon-eksikli Plazmid aynı zamanda epizomal proteinlerin artan ekspresyonu için, reaksiyon karışımına ilave edilir. Transfekte edilmiş hücreler daha sonra, sürekli tekrar programlanması için ışınlanan fare embriyonik fibroblastlar (iMEFs) bir tabaka üzerine kaplanır. En kısa iPSC gibi koloniler nucleofection sonra yaklaşık on iki gün sonra ortaya çıktıkça, HDAC inhibitörleri epigenetik yenileme kolaylaştırmak için ortama ilave edilir. Biz, HDAC inhibitörlerinin dahil rutin olarak 2 kat kadar tam olarak yeniden programlanması iPSC kolonilerin oluşturulmasına arttırdığını bulduk. IPSC koloniler tipik insan embriyonik kök hücre (HESC) morfoloji kez, yavaşça sürekli büyüme ve genişleme için bireysel Imef kaplı doku kültürü plakalarına aktarılır.

Üç gün nucleofection sonra iMEFs üzerine nucleofected hücreleri kaplama önce başarılı nucleofection etkinliği eGFP için floresan mikroskobu ile tahmin edilmelidir. 1 EGFP ifade toplam hücre nüfusunun yaklaşık% 5-10, tipik Nucleofection deneyi göstermektedir. Yeniden programlanan iPSC koloniler nucleofection yaklaşık iki hafta sonra görünmeye başlayacaktır. Koloniler, iyi tanımlanmış sınırlara sahip, genel olarak dairesel olan ve yüksek çekirdek sitoplazma or...

Burada bir episomuna göre yeniden programlama strateji ve histon deasetilaz inhibitörleri kullanılarak periferal kandan alınan insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi için bir protokol açıklar.

Epizomlar ve HDAC inhibitörleri kullanarak Blood Verimli iPS Hücre Üretimi

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, az miktarda periferik kandan entegrasyon içermeyen indüklenmiş pluripotent kök hücreler üretmektir. Bu, yeniden programlamaya çok duyarlı bir eritrosit progenitör popülasyonu elde etmek için tanımlanmış büyüme faktörlerinde izole edilmiş periferik kan mononükleer hücrelerinin kültürlenmesiyle elde edilir. İkinci bir adım olarak, yeniden programlama genlerini taşıyan entegre olmayan epizomal plazmitler, yeniden programlama sürecini başlatmak için çekirdek sevgisi ile eritroblastlara sokulur.Daha sonra, çekirdekten etkilenen hücreler, sonuçta başarılı bir şekilde yeniden programlamaya devam etmek için ışınlanmış fare embriyonik fibroblastlarından oluşan bir tabaka üzerine kaplanır. Yeniden programlanmış indüklenmiş pluripotent kök hücre kolonileri, morfolojik özelliklerine, alkalin fosfataz aktivitesine, pluripotens belirteçleri için pozitif immünokimyaya ve endojen pluripotens genlerinin ekspresyonuna dayalı olarak tanımlanabilir. Bu tekniğin viral tabanlı yeniden programlama gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bu protokolün tutarlı bir şekilde entegrasyon gerektirmeyen IPSC oluşturulmasını sağlamasıdır Bugün prosedürü gösteren Jesse, ben ve

efficient-ips-cell-generation-from-blood-using-episomes-hdac

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Onlar pluripotency için standart testleri geçmek bile oluşturuluyor indüklenen pluripotent kök hücre (IPSC) hatları gelişim potansiyeli birbirinden farklı çizgiler üretir. Burada sahip tam olarak pluripotency IPSC hattı tanımlayan iPSCs, tamamen edilen fareler üretmek için bir protokol...

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

Burada tek bir lentiviral yeniden programlanması vektörü kullanılarak periferal kan 3-4 ml insan iPSCs üretimi için basit ve etkili bir protokol göstermektedir. Hazır kan hücrelerinin yeniden programlanması daha geniş bir araştırma toplum için erişilebilir kılarak IPSC teknoloji kullanımı hızlandırmak için vaat ediyor.

STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

Burada, biz tutarlı sonuç ve geliştirilmiş verimlilik gösterir Sendai virüs ile transgen-özgür insan iPSCs içine insan somatik hücreleri yeniden programlamak için kurulan yöntem sunuyoruz.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs), klinik uygulamalar ve temel araştırma için hastaya özgü dokuların bir kaynağı temsil eder. Burada, non-entegre epizomal plasmidleri kullanılarak viral içermeyen iPSCs içine donmuş buffy kat elde edilen insan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMNCs) yeniden programlamak için detaylı bir protokol mevcut.

Bütünleşmeyen episomal plasmidler kullanılarak dondurulmuş Buffy tüylerdeki uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) yeniden programlanması için bir protokol öneriyoruz. Transdüksiyon kan hücrelerini santrifüjleme ile matris kaplı plakalara kaplayarak, iPSC'ler yüzen hücrelerden başarılı bir şekilde indüklenir. Bu teknik, PBMC'ler ve CBMC'ler gibi hücreler için basit ve etkili bir yeniden programlama protokolü önerir.

Sendai Virüs ve santrifüj kullanılarak Kan Hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücre Üretimi

Bu protokol, insan yetişkin periferik kan hücrelerinden entegrasyon gerektirmeyen iPSC'lerin verimli bir şekilde üretilmesi için ayrıntılı bir yöntemi açıklar. Yeniden programlama faktörlerini ifade etmek için dört oriP/EBNA bazlı epizomal vektörün kullanılmasıyla, KLF4, MYC, BCL-XL veya OCT4 ve SOX2, 1 mL periferik kandan binlerce iPSC kolonisi elde edilebilir.

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu iletişim kuralı koşullarda besleyici içermeyen insan pankreas hücreleri ayak izi-Alerjik İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) nesil ayrıntılı olarak anlatılmaktadır kullanarak CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins ve değiştirilmiş karakterizasyonu düzenleyerek takip tek hücre klonlar.

Verimli üretimi ve besleyici-Alerjik IPSCs CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak insan pankreas hücreleri düzenleme

Bu protokol, insan dermal fibroblastlarında hemojenik bir programın hematopoetik kök ve döl hücreleri üretmek için gata2, GFI1B ve FOS transkripsiyon faktörlerinin zorunlu ekspresyonu ile indüksiyonuna neden olduğunu göstermektedir.

Transkripsiyon Faktörlerinin Zorunlu İfadesi Ile İnsan Fibroblastlarının Hemojenik Yeniden Programlanması

Hücre yeniden programlama, pluripotent hücre durumunu düzenleyen ve koruyan anahtar genlerin tanıtılmasını gerektirir. Açıklanan protokol, insan dermal fibroblastlarından viral/entegre yöntemler olmadan ancak modifiye edilmeyen RNA'lar (NM-RNA) kullanarak hücresel savunma mekanizmalarını azaltan immün kaçırma faktörleri ile birlikte indüklenen pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) kolonilerinin oluşmasını sağlar.

Erişkin İnsan Dermal Fibroblastlarının Abdominal Deriden İzolasyon ve İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerin Indüklenen Alacalı Kök Hücrelerin Indükleyici Olmayan Yöntemle Üretilmesi

Amerikan at nalı yengeci, Limulus Polyphemus'un, tartışmalı, büyük miktarda herhangi bir omurgasız kan için en uygun bir kaynağıdır. Kan genel dolaşımı, granül amebocyte ve plazma, hemosiyanin, C-reaktif protein ve α2-makroglobulin sadece üç bol protein sadece tek bir hücre tipi, kompozisyon basit. Kan kalpten toplanır ve kan hücreleri ve plazma santrifüj ile ayrılır.

Amerikan Horseshoe Yengeç, Limulus Polyphemus&#39;un Kan Toplama

Öğrenin epizomal plazmidler ve HDAC inhibitörleri kullanarak periferik kandan entegrasyonsuz iPSC üretimini. Bu yöntem, viral vektörlerin neden olduğu insertiyonel mutagenez riskini ortadan kaldırarak güvenli kök hücre elde edilmesini sağlar.

Epizomlar ve HDAC inhibitörleri kullanarak Blood Verimli iPS Hücre Üretimi

Daha fazla video keşfet