Epizomlar ve HDAC inhibitörleri kullanarak Blood Verimli iPS Hücre Üretimi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, az miktarda periferik kandan entegrasyon içermeyen indüklenmiş pluripotent kök hücreler üretmektir. Bu, yeniden programlamaya çok duyarlı bir eritrosit progenitör popülasyonu elde etmek için tanımlanmış büyüme faktörlerinde izole edilmiş periferik kan mononükleer hücrelerinin kültürlenmesiyle elde edilir. İkinci bir adım olarak, yeniden programlama genlerini taşıyan entegre olmayan epizomal plazmitler, yeniden programlama sürecini başlatmak için çekirdek sevgisi ile eritroblastlara sokulur

Daha sonra, çekirdekten etkilenen hücreler, sonuçta başarılı bir şekilde yeniden programlamaya devam etmek için ışınlanmış fare embriyonik fibroblastlarından oluşan bir tabaka üzerine kaplanır. Yeniden programlanmış indüklenmiş pluripotent kök hücre kolonileri, morfolojik özelliklerine, alkalin fosfataz aktivitesine, pluripotens belirteçleri için pozitif immünokimyaya ve endojen pluripotens genlerinin ekspresyonuna dayalı olarak tanımlanabilir. Bu tekniğin viral tabanlı yeniden programlama gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bu protokolün tutarlı bir şekilde entegrasyon gerektirmeyen IPSC oluşturulmasını sağlamasıdır Bugün prosedürü gösteren Jesse, ben ve Gretchen Johnson olacak.

Laboratuvardaki bir teknisyen DPBS'de periferik kanı bire bir oranında seyrelterek başlayın. Daha sonra 15 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir polistiren tüpte, seyreltilmiş kandan yedi mililitreyi dikkatlice üç mililitre oda sıcaklığında fi call hi paketinin üzerine yerleştirin. Numuneyi 400 GS ve oda sıcaklığında 30 dakika ayırdıktan sonra, pbmc plazma ile fial yüksek paket arasındaki bulutlu beyaz arayüz katmanına yerleşmiş olacaktır.

Steril bir transfer pipeti kullanarak, P BMC'leri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve taze DPBS ile hacmi 10 mililitreye getirin. Daha sonra hücreleri saydıktan sonra, iki kez 10 ila altı P BMC'yi yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın ve kalan hücreleri döndürün, peletlenmiş hücreleri %90 fetal sığır serumunda mililitre başına iki kez 10 ila altı pbmc'de dondurun %10 dimetil sülfoksit ile. Daha sonra, bir kenara bırakılan P BMC'leri döndürdükten sonra, peleti iki mililitre taze hazırlanmış genleşme ortamında askıya alıyoruz ve bunları 12 oyuklu bir doku kültürü plakasının bir oyuğuna yerleştiriyoruz, hücreleri 37 derece nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe ediyoruz %5 oksijen, %5 karbondioksit ve %90 azot atmosferi ile.

Daha sonra üçüncü ve altıncı günlerde, hücreleri kuyudan toplayarak ortamı değiştirin. Kalan hücreleri toplamak için kuyuyu iki mililitre QBSF 60 ile yıkamak, hücreleri santrifüjleme ile peletlemek ve ardından peleti iki mililitre taze genleşme ortamında tekrar askıya almak. Daha sonra hücreleri aynı 12 oyuklu plakaya geri koyun ve inkübasyona devam edin Dokuzuncu günde, yeniden programlama plazmitlerini tabloda belirtildiği gibi steril bir 1.5 mililitrelik einor tüpüne pipetleyin.

Daha sonra, nükleo sevgi solüsyonunu üretici tarafından sağlanan takviyelerle karıştırın ve karışımı steril 1,5 mililitrelik bir üst DPH tüpüne aktarın. Daha sonra iki mililitre genleşme ortamını yeni bir 12 oyuklu plakanın bir kuyucuğuna dağıtın ve hücreler hazır olana kadar ortamı nemlendirilmiş 37 santigrat derece inkübatörde dengeleyin. Hücreleri toplayın, hücre kültürünü az önce gösterildiği gibi yıkayın ve hücreleri beş mililitre DPBS'de yıkayın.

Daha sonra resus, hücre peletini 100 mikrolitre Nucle affection solüsyonunda askıya alın ve kabarcık oluşturmamaya dikkat ederek takviye edin ve hücre süspansiyonunu yeniden programlama plazmidini içeren tüpe aktarın. Hücreleri bir kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve tüm çözeltiyi bir çekirdek sevgi damarının dibine aktarın. Ardından vete'yi Çekirdek sevgi makinesine yerleştirin ve T 0 1 9 programını çalıştırın.

Şimdi 100 mikrolitre DENGELİ genleşme ortamını çekirdek sevgi vetesine ekleyin ve herhangi bir beyaz yüzen ölü hücre kalıntısından kaçınarak hemen tüm numuneyi toplayın ve ön ısıtma ortamının kuyusuna bırakın. Daha sonra hücreleri 10. veya 11. günde nemlendirilmiş inkübatöre geri yerleştirin. Altı kuyulu bir doku kültürü plakasının her bir kuyusunu HBSS'de bir mililitre% 0.1 jelatin ile jelatin ile kaplayın ve daha sonra plakayı nemlendirilmiş inkübatöre yerleştirin veya inkübasyon sırasında en az beş dakika bir şişe çözülme aktarın, iki kez 10 ila altı 3000 santigrat ışınlanmış fare, embriyonik, fibroblast veya mes'i 10 mililitre önceden ısıtılmış meth ortamına, ve sonra hücreler aşağı dönerken hücreleri santrifüjleyin.

Jelatin çözeltisini altı oyuklu plakadan aspire edin ve ardından mes'i 12 mililitre taze meth ortamında yeniden süspanse edin. Kaplanmış jelatinin her bir oyuğuna hemen iki mililitre OFM dağıtın. Altı. Plakayı iyice kapatın ve plakayı 12. güne kadar nemlendirilmiş inkübatöre geri yerleştirin.

12. günde, çekirdekten etkilenen hücreleri kuyudan 15 mililitrelik bir konik tüpe toplayın, kalan hücreleri toplamak için gösterildiği gibi kuyuyu yıkayın. Hücreleri döndürdükten sonra, peleti 12 mililitre taze hazırlanmış yeniden programlama ortamında askıya alıyoruz ve her bir besleyici hücre kuyucuğuna iki mililitre hücre dağıtıyoruz. Altı oyuklu plakada, plakayı 75 GS ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca santrifüjleyin ve ardından plakayı nemlendirilmiş inkübatöre geri yerleştirin ve ortamı bir ila iki hafta boyunca her gün değiştirin.

İndüklenebilir pluripotent hücre kolonileri ortaya çıktığında, hücreleri, çekirdek sevgisinden üç gün sonra ve kaplamadan üç gün sonra histon deasetilaz inhibitörleri içeren taze hazırlanmış insan embriyonik kök hücre ortamı ile beslemeye başlayın, çekirdek etkilenen hücreleri indüklenebilir meth üzerine yerleştirin. Başarılı bir NU nükleer sevgisinin etkinliği floresan mikroskobu ile tahmin edilmelidir Örneğin, burada gösterilen EGFP için, toplam hücre popülasyonunun yaklaşık% beş ila 10'unun EGFP yeniden programlanmış indüklenebilir pluripotent kök hücre kolonilerinin NU nükleer sevgisinden yaklaşık iki hafta sonra ortaya çıkmaya başlayacağı tipik bir çekirdek sevgi deneyidir. Koloniler genellikle iyi tanımlanmış sınırlara sahip daireseldir ve yüksek nükleer-sitoplazmik orana sahip küçük, sıkıca paketlenmiş hücreler ve tamamen karakterize edilmiş temsili çizgilerin görünür nükleolleri dahil olmak üzere karakteristik insan embriyonik kök hücre morfolojisi ile tanımlanabilir.

Alkalin fosfataz aktivitesi için pozitif olan tüm testler, standart pluripotens belirteçlerini eksprese eder ve bir kez ustalaştıktan sonra endojen pluripotens genlerini yeniden aktive eder. Bu teknik, düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse, dört hafta içinde sürekli olarak entegrasyonsuz IPSC oluşturabilir. Bu prosedürü takiben, herhangi bir doku tipi ile ilgili soruları yanıtlamak için farklılaşma çalışmaları yapılabilir.