Sendai Virüs ve santrifüj kullanılarak Kan Hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücre Üretimi

Bu çalışmanın genel amacı, periferik kan mononükleer hücrelerini, santrifüjleme ile seri kaplama kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücrelere yeniden programlamaktır. Başlangıçta, iPSC'ler, fibroblastların yeniden programlanmasıyla üretildi. Bugün, yeniden programlama için çeşitli kullanılmaktadır.

Bununla birlikte, kanın erişilebilirliği nedeniyle, PBMC'ler, ilaç taraması, tez modelleme ve rejeneratif tıp geliştirmede iPSC'lerin daha fazla uygulanması için kabul edilmeyen hücre kaynağı olabilir. Çalışma boyunca, merkezkaç kuvveti eklenerek PBMC'leri kullanarak iPSC'lerin yeniden programlanması hakkında bir protokol paylaşacağız. Bu protokol, yüzen hücreleri yeniden programlarken başka bir seçenek sağlayacaktır.

Prosedürü göstermek için, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Nam'ı kullanacağız. Monositik hücreleri izole etmek için, önce bir hücre hazırlama tüpündeki kan alımından en az on mililitre taze kan elde edin. Daha sonra, kanı 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarın ve bir ila dört oranında steril PBS ile seyreltin.

Daha sonra, yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe on mililitre yoğunluk gradyan ortamı ekleyin ve seyreltilmiş kanı yoğunluk gradyan ortamının üzerine dikkatlice katmanlayın. Ardından, numuneyi santrifüj molası vermeden oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 750 kez g'de santrifüjleyin. 30 dakika sonra, buffy tabakayı dikkatlice yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın.

30 mililitre PBS ekleyin ve hücreleri yıkayın. Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 515 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra, PBS'yi atın ve hücreleri 0.5 mililitre kan hücresi ortamında yeniden süspanse edin.

Bunu takiben, hücreleri sayın ve 24 oyuklu bir plakaya yerleştirin. Buharlaşmayı önlemek için çevredeki kuyucuklara PBS ekleyin. Bunu takiben, hücreleri transdüksiyondan önce 37 santigrat derecede beş gün boyunca stabilize edin.

Hücreleri rahatsız etmeden üç ila dördüncü günde ek olarak 0,5 mililitre taze kan hücresi ortamı ekleyin. Bu prosedürde, kan hücrelerini 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve bir hemasitometre kullanarak sayın. Daha sonra, transdüksiyon için beşinci hücrelere üç kez on hazırlayın ve hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 515 kez g'de santrifüjleyin.

Daha sonra, süpernatanı emme yoluyla atın ve hücreleri 0.5 mililitre kan hücresi ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri kaplanmamış 24 oyuklu bir plakanın kuyusuna aktarın. Sendai virüsü karışımını buzda çözdürün ve askıya alınan hücrelere ekleyin.

Plakayı bir sızdırmazlık filmi ile kapatın ve 30 santigrat derecede 30 dakika boyunca 1.150 kez g'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, hücreleri gece boyunca %5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede inkübe edin. 24 oyuklu bir plakayı vitronektin ile kaplamak için, ertesi gün, mililitre başına beş mikrogramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için vitronektin çözeltisini PBS'de seyreltin.

Daha sonra, bir kuyucuğa bir mililitre vitronektin ekleyin ve en az bir saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Daha sonra, kaplama solüsyonunu çıkarın ve hücreleri ve virüsü içeren tüm ortamı kaplanmış kuyucuğa aktarın. Daha sonra, kalan hücreleri ek olarak 0,5 mililitre taze kan hücresi ortamı ile toplayın ve hücre içeren kuyucuğa ekleyin.

Daha sonra, plakayı 35 santigrat derecede on dakika boyunca 1.150 kez g'de santrifüjleyin ve ardından hücreleri gece boyunca% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede tutun. İkinci hücre transferi için, kuyuyu daha önce tarif edildiği gibi mililitre vitronektin başına beş mikrogram ile kaplayın. Her transdüksiyon için plakanın bir kuyusunu kullanın ve hücre süspansiyonunu ilk plakadan yeni kaplanmış vitronektin plakasına aktarın.

Bu arada, bakım için ilk plakanın bir kuyusuna bir mililitre iPSC ortamı ekleyin ve taze iPSC ortamı ile günlük ortam değişimi ile %5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede inkübe edin. Koloniler, transdüksiyondan sonra 14 ila 21. günlerde ortaya çıkacaktır. Askıda hücreleri içeren yeni kaplanmış plakayı, on dakika boyunca 35 santigrat derecede 1.150 kez g'de santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, hücreleri gece boyunca %5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, süpernatanı çıkarın ve taze indüklenmiş pluripotent kök hücre ortamı ile değiştirin. Bağlı hücreleri,% 80 birleşme noktasına ulaşılana kadar günlük ortam değişikliği ile koruyun.

Koloni toplamadan bir hafta önce, vitronektin kaplı 100 milimetrelik bir tabakta dördüncü hücrelere bir kez on ila dördüncü hücre tohumlayın. Daha sonra, iki mililitre vitronektin çözeltisi ekleyerek vitronektin kaplı 60 milimetrelik bir tabak hazırlayın ve oda sıcaklığında en az bir saat inkübe edin. Mikroskopla gözlemleyerek, plakanın altındaki kolonileri bir işaretleyici kalem kullanarak net sınırlarla işaretleyin.

Vitronektin çözeltisini yeni plakadan çıkarın ve on milimolar RHO kinaz ile desteklenmiş altı mililitre indüklenmiş pluripotent kök hücre ortamı ekleyin. Daha sonra, kültür ortamını hücrelerden çıkarın ve üç mililitre PBS ile yıkayın. Ardından, bir mililitre iPSC koloni ayırma çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 30 saniye inkübe edin.

Bundan sonra, çözeltiyi plakadan çıkarın ve oda sıcaklığında 30 saniye daha inkübe edin. 30 dakika sonra, plakadan 200 mikrolitre ortam çekin ve hedeflenen kolonileri pipetleyerek ayırın. Ardından, dağınık kolonileri 60 milimetrelik yeni bir tabağa aktarın.

Hücreleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içinde onuncu pasaja ulaşana kadar inkübe edin ve koruyun. Yeniden programlamanın erken aşamasında, iPSC'ler bağlı yeniden programlanmamış farklılaşmış hücrelerle karıştırıldı. Genişlemeden önce, iPSC'ler ve diğer hücreler ayırt etmek için farklıydı.

Hücrelerin düşük yoğunlukta tohumlanmasıyla, toplanabilecek kadar büyük koloniler elde edildi. Koloniyi izole ettikten sonra, hücre kümeleri tek hücrelere ve kültüre ayrıldı. Daha sonra saf iPSC kolonileri görüldü.

Saf indüklenmiş pluripotent kök hücreler genişledikten sonra, hücrelerin kalitesi test edildi. Hücreler, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin farklılaşmamış durumunu doğrulamak için alkalen fosfataz ile boyandı. İzole edilmiş indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetilen kolonilerin tümü pozitif boyama gösterdi.

Pluripotent belirteçler immünofloresan boyama ile doğrulandı. Yeniden programlanmış hücreler, SSEA4, Oct4, Sox2, TRA-1-81, Klf4 ve en önemlisi TRA-1-60 gibi yüksek oranda eksprese edilen pluripotent belirteçler, pluripotent belirteçlerin ekspresyonu RTPCR ile doğrulandı. Santrifüjleme ile seri kaplama kullanılarak, transit bağlantı, metrik kaplamalı bir plaka üzerine PBMC kullanır.

Oradaki atataşmanlar bekletildiği gibidir ve iPSC kolonileri bir saflaştırma için tekrarlanır. Bu protokolü kullanarak, bir ay içinde PBMC'lerden iPSC oluşturulabilir. Bu protokol, transdüksiyonlu hücrelerin bağlanması için gereken süreyi azaltır ve kendi başına bağlanamayan yeniden programlanmış hücrelerin kaybını önler.

Bununla birlikte, tamamen yeniden programlanmış koloni oluşturan iPSC'lerin saflaştırılması, bu prosedürü denerken kritik olabilir. Önceden, bu protokolü kullanarak PBMC'leri ve mononükleer hücreleri başarıyla yeniden programladık. Üretilen kan hücresinden türetilmiş iPC'ler, çeşitli araştırma alanlarında yaygın olarak kullanılabilir.

Bu protokol, daha ileri uygulamalar ve çalışmalar için diğer yüzer süspansiyon hücresi türlerinin yeniden programlama sürecine yardımcı olabilir.