Name: Sendai Virüs ve santrifüj kullanılarak Kan Hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücre Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Keşfedin, santrifüj kullanarak periferik kan mononükleer hücrelerini indüklenmiş pluripotent kök hücrelere yeniden programlama yöntemini. Bu protokol, ilaç tarama ve rejeneratif tıpta PBMC kaynaklı iPSC kullanımını kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Bilim, BİT ve Gelecek Planlaması Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) aracılığıyla Temel Bilim Araştırma Programı'ndan bir hibe ile desteklenmiştir (2013R1A1A1076125).

Etik Beyanı: Bu çalışma protokolü Kore Katolik Üniversitesi (KC12TISI0861) kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmıştır. Kandan Monositik Hücreleri 1. İzolasyon <ol><li> monositik hücrelerin izolasyonu (Gün -5) <ol><li> Bir hücre hazırlama borusu (CPT) ve kan alımı taze kan, en az 10 ml elde etmek. </li><li> Yeni 50-ml&#39;lik konik tüpe kan transferi ve 1 steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltilmiş: 4 oranında. NOT: seyreltme oranının daha yüksek daha yüksek bir saflık için kullanılabilir. </li><li> Yeni 50-ml&#39;lik konik tüpe yoğunluk gradyanlı ortam 10 ml ilave edilir ve dikkatli bir şekilde yoğunluk gradyan medyanın üstüne seyreltilmiş kan tabaka. bir santrifüjleme fren oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca 750 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle, yeni bir 50 ml konik tüp buffy tabaka transferi tüp PBS 30 ml ekleyin ve hücreleri yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 515 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. &lt;/ Li&gt; <li> PBS atın ve kan hücre medya 0.5 ml hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> Hücre sayımı ve 24 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu için 1 x 10 6 hücre plaka. Buharlaşmayı önlemek için çevre gözlere PBS ilave edin. </li><li> Transdüksiyon önce% 5, 37 ° C&#39;de CO2 5 gün boyunca hücrelerle stabilize. hücreleri bozmadan gün 3-4 taze kan hücre ortamının bir ek 0.5 ml ilave edilir. </li></ol></li></ol> Sendai Virüs tarafından 2. İletimi <ol><li> İletimi (Gün 0) <ol><li> Toplayın ve 15 ml konik tüp kan hücreleri transferi ve hemasitometre kullanarak onları saymak. </li><li> Transdüksiyon başına 3 x 10 5 hücre hazırlanması ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 515 x g&#39;de santrifüj hücreleri. </li><li> Emme ile Süpernatantı atın ve kan hücre medya 0.5 ml hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> olmayan bir kaplı 24 oyuklu plaka iyi hücreleri aktarın. </li><li> buz Sendai virüsü karışımı çözülme ve su eklemekspended hücreleri. imalatçının tavsiyelerine göre hücrelere Sendai virüsü ekleyin. </li><li> bir sızdırmaz film ile plaka kapatılır ve 30 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 1,150 x g&#39;de da santrifüj. </li><li> Santrifüj işleminden sonra,% 5 bir gece boyunca CO2 (O / N) 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li></ol></li><li> besleyici matris hücre transferi (Gün 1) <ol><li> Sonraki gün, kaplama vitronektin ile 24 oyuklu plaka. bir son 5 ng / ml arasında bir konsantrasyonda PBS içinde vitronektin çözeltisi ile seyreltilir. 24-iyi plaka iyi vitronektin 1 ml ilave edilir ve en az 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. Kullanmadan önce Kaplama çözeltisini çıkarın. Kaplanmış plakalar, 3 gün boyunca oda sıcaklığında saklanabilir. </li><li> iyi kaplanmış hücreleri ve virüs içeren tüm medya aktarın. </li><li> Taze kan hücre ortamının bir ek 0.5 ml kalan hücreleri toplamak ve hücre ihtiva eden bir oyuğa ekleyin. </li><li> 35 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1,150 x g&#39;de plaka santrifüjleyin. </li><li> yüzde sonrarifugation, süpernatant kaldırmak iPSC ortam 1 ml ekleyin ve% 5 CO2 göre O / N 37 ° C &#39;de hücreleri korumak. </li></ol></li><li> Ikinci hücre transferi (Gün 2) <ol><li> Kat aşama 2.2.1 tarif edildiği gibi 5 ug / ml, vitronektin ile yeni bir 24-yuvalı plakanın yuvalarına. Her transdüksiyon için plakanın bir kuyu kullanın. </li><li> yeni kaplanmış vitronektin plakaya ilk plaka hücre süspansiyonu aktarın. Not: gerekli değilse, süspansiyon hücreleri iptal edilebilir. Aşama 2.3 açıklanan prosedüre süspansiyon hücreleri ile 2-3 kez tekrarlanabilir. adımlar tekrarlanır edilecek olursa, hücreler hasat. </li><li> Bununla birlikte,% 5 CO2 göre O / N 37 ° C &#39;de muhafaza edilmesi için, ilk plaka oyuğuna iPSC ortam 1 ml ekleyin ve inkübe edilir. </li><li> 37 ° C&#39;de eklenmiş hücreleri korumak ve% 5 CO2 ve taze iPSC ortamı ile günlük ortam değişikliği yapılması. Koloniler transdüksiyon sonra günlerde 14-21 görünecektir. </li><li> Centrifuge 1,150 x g&#39;de 10 dakika süre ile 35 ° C &#39;de süspansiyon hücreleri ihtiva eden yeni kaplanmış plaka. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, CO2 O / N,% 5, 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> Ertesi gün, süpernatant kaldırmak ve taze iPSC ortam ile değiştirin. Not: Aşama 2.3 açıklanan prosedüre süspansiyon hücreleri ile 2-3 kez tekrarlanabilir. adımlar tekrarlanır olacaksa, süpernatant hücrelerin hasat ve adım 2.3 tekrarlayın. </li><li> % 80 kaynaşma elde edilene kadar her gün ortam değişiklikleri ile bağlı hücreleri korumak. </li></ol></li></ol> 3. yeniden programlandı hücre bakım <ol><li> 24-plaka kültürden sonra erken bakım <ol><li> Hücreler birleştiklerinde kez 7-10 gün transdüksiyon sonra, bir vitronektin kaplamalı, 60 mm yemek hazırlamak. bir son 5 ng / ml arasında bir konsantrasyonda PBS içinde vitronektin çözeltisi ile seyreltilir. çanak vitronektin 1 ml ilave edilir ve en az 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> yıkaPBS ile hücre ve hücreleri ayırmak için PBS / 1 mM EDTA 1 ml. </li><li> 2 dakika için CO2, 37 ° C&#39;de inkübe ve% 5. </li><li> hücreler hasat ve 2 dakika boyunca 250 x g&#39;de ve oda sıcaklığında santrifüj. Süpernatantı ve taze iPSC medya 3 ml hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> yeni kaplanmış 60 mm çanak üzerine tüm yeniden süspanse hücreleri Plate. </li><li> Hücreler% 80 birleşmeye kadar% 5 CO2 içinde 37 ° C sıcaklıkta tekrar hücrelere 10 mM RHO kinaz inhibitörü ekleyin ve korur. </li></ol></li><li> koloni görünümü Split (Altklonlaması Hazırlık) <ol><li> Aşama 3.1.2 de tarif edildiği gibi, bir vitronektin kaplı, 100 mm tabak için hazırlayın. </li><li> Hücrelerin PBS ile yıkayın ve hücreleri ayırmak için PBS / 1 mM EDTA 1 ml. </li><li> 2 dakika için CO2, 37 ° C&#39;de inkübe ve% 5. </li><li> hücreler hasat ve 2 dakika boyunca 250 x g&#39;de ve oda sıcaklığında santrifüj. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve çanak başına 1 x 10 4 hücre hazırlamak.</li><li> 250 xg&#39;de hücreleri Santrifüj ve RT 2 dakika süreyle. </li><li> IPSC medya 6 ml, yeniden süspanse 1 x 10 4 hücre kaplamalı 100 mm çanak üzerine onları plaka ve medyaya 10 mM RHO kinaz inhibitörü ekleyin. </li><li> Büyük koloniler görünene kadar hafta% 5 37 ° C&#39;de CO2 hücreleri inkübe edin. NOT: Bakım ve alt klonlama için koloniler genişletin. Alt-klonlama genellikle 5 pasajlar altında yapılır. </li></ol></li><li> Koloni çözümü ayrılmakta iPSC koloni kullanarak toplama <ol><li> Koloni toplama, tohum aşamasında 3.2.7 de belirtildiği gibi bir vitronektin kaplı, 100 mm çanak 1 x 10 4 hücre, bir hafta önce. </li><li> Vitronektin 2 ml solüsyon eklenmesi ve en az 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilerek bir vitronektin kaplanmış 60 mm çanak hazırlayın. </li><li> Bir mikroskop (40X veya 100X büyütme) aracılığıyla gözlemleyerek, bir işaretleyici kalem kullanarak kesin sınırlarla koloniler işaretleyin. Adım 3.3.2 yapılan yeni plakadan vitronektin çözüm çıkarın ve 6 ml ekleyinIPSC ortam, 10 mM RHO kinaz ile takviye edilmiştir. </li><li> hücrelerin kültür ortamı çıkarın ve PBS 3 ml ile yıkayın. </li><li> iPSC koloni ayırma çözeltisi 1 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 s için inkübe. </li><li> plakadan çözüm kaldırmak ve ilave bir 30 saniye boyunca oda sıcaklığında inkübe. </li><li> P200 pipet kullanarak, plakadan medya 200 ul çizin ve pipetle hedef koloniler ayırmak. Yeni 100 mm çanak dağınık koloniler aktarın. </li><li> Inkübe ve% 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de hücreleri korumak. NOT: onlar 10. Karakterizasyonu en az 10 pasajlar sonra yapıldığını geçit ulaşıncaya kadar saf iPSC koloni elde ettikten sonra, hücreler muhafaza edilmiştir. Antikor seyreltikleri, ve primer bilgiler Tablo 1 ve 2&#39;de gösterilmektedir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+engineering+of+human+pluripotent+stem+cells+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application.</a> Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+and+personalized+medicine%3A+current+progress+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives.</a> Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).</li>
<li>Seki, T., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+induced+pluripotent+stem+cells+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application.</a> World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).</li>
<li>Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+iPSCs+from+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+non-integrative+Sendai+virus+in+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions.</a> Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).</li>
<li>Ohmine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+GMP-grade+hematopoietic+progenitor+cells+and+mononuclear+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).</li>
<li>Mae, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+and+robust+induction+of+nephrogenic+intermediate+mesoderm+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells.</a> Nat Commun. 4, 1367(2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Embriyonik kök hücreler (ESCs) birçok takım eksiklikler göstermiştir için, alternatif bir araca gerek gerekmiştir. Bu nedenle, Yamanaka tarafından uyarılmış pluripotent kök hücrelerinin gelişimi (iPSCs) uluslararası mercek altına geldi. Yamanaka Pluripotency yetişkin somatik hücre içine sadece dört gen ekleyerek uyarılan edilebileceğini keşfetti beri neredeyse on yıl olmuştur. iPSCs olgun somatik hücrelerden &quot;uyarılmış&quot; olduklarından, bir zamanlar EKH ilgili endişe olmuştu etik sorunları kaçmasına olabilir. EK...

Kök hücreleri, son birkaç on yıl 1 Klinik terapisinde en cazip malzemelerden biri olmuştur. Kök hücrelerin çekici özellikleri Pluripotency ve kendini yenilemek yeteneği vardır. 1981 yılında ilk embriyonik kök hücrelerin (ESCs) fare embriyo 2 izole edilmiştir. teknik insan embriyosunun uygulanmıştır Ancak, birkaç etik konuları karşılaştı. Dr. Yamanaka ve ekibi fare somatik hücrelerden ilk pluripotent hücre reprogrammed zaman 2006 yılında, kök hücre alanı kendi imkanı kazanmış ve faiz 3 canlanan edildi. Birkaç tanımlanmış faktörleri teslim ederek, pluripotent kök hücreler başarıyla yetişkin somatik hücrelerden &quot;uyarılmış&quot; olduğunu ve böylece adlandırılmıştır &quot;(iPSCs) uyarılmış pluripotent kök hücreler.&quot; 2007 yılında, bu teknik EKH kesin özelliklere sahip hücreler üreterek, insan hücrelerinde 4 uygulanmış fakat etik tartışmaların hiçbiri. Teorik olarak, iPSCs herhangi bir birey veya hastadan elde edilen herhangi bir hücre tipinden oluşturulabilir. Hastaya özel iPSCs hastalık fenotipleri ve her hastanın epigenetik koşullarını taklit edebilirsiniz potansiyel bir araç olarak artıyor. Gen düzenleme veya patojenik durumu tersine çevirmek için başka yöntemler kullanılarak, hastaya özel iPSCs, kişiselleştirilmiş ilaç 5 kullanılabilir. Bunlar 6 otomatik nakli daha uygun hale verici ile aynı bağışıklık kimliğe sahip çünkü Ayrıca, iPSCs az bağışıklık reddi ile ilişkilidir. Bu nedenle, iPSCs hastalık modelleme, ilaç tarama ve rejeneratif tedaviler en umut verici bir platform haline gelmiştir. Bu faydaları, sürekli geliştirilmekte olan küçük hücre kaynağından zaman az miktarda daha saf ve daha yüksek verim verebilir geliştirilmiş protokoller göz önüne alındığında. Gelecekteki uygulama için en verimli protokol bulma biri önemli unsurlardan primer hücre tipidir. Erken iPSC üretimi proto çoğucols orijinal iPSC hatları deri fibroblastları 4 indüklenen beri yapışık hücreler için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, bu hücrelerin izole edilmesi ve hazırlanması, emek yoğun işlemlerdir. Ayrıca, cilt fibroblast izolasyonu daha geniş bir uygulama için büyük bir eksiklik olabilir invaziv cerrahi prosedürleri içermektedir. Bu nedenle, iPSCs ve daha fazla kullanım için, uygun edinimi ile bir hücre kaynağı gereklidir. Bu oldukça minimal invaziv prosedür 7-9 ile elde edilir çünkü kan ideal bir hücre kaynağı olarak kabul edilir. Bu çalışmada, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) için hiPSCs üreten protokole basit modifikasyon geliştirdi. Bu CD34 + hücreleri gibi belirli bir hücre tipi, zor genişletme işlemi olmadan, tam kan hücreleri veya PBMC&#39;ler seri Yamanaka faktörleri içeren Sendai virüsü ile transdüksiyon sonra santrifüjleme ile matris kaplı plakalar üzerine kaplandı. Bu yöntem için gerekli süre azalırtransduse yüzen hücreleri bağlanma ve kendi eklemek mümkün değildi yeniden programlanan hücrelerin kaybı azalmıştır.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Plasticware</strong</td></tr><tr><td>>100 mm Çanak</td><td>TPP&nbsp;</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>6 Kuyulu Plaka</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Kornik Tüp</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Kornikal Tüp</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Tek Kullanımlık Pipet</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Tek Kullanımlık Pipet</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>12 Kuyulu Plaka</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>24 Kuyulu Plaka</td><td>TPP</td><td>92024</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">PBMC İzolasyon Malzemeleri</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Sağlık</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>9805</td><td>Kan hücresi ortamı</td></tr><tr><td>CC110</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>8697</td><td>Kan Hücre Ortamı Takviyesi (100x)</td></tr><tr><TD Colspan="4">iPSC Üretimi ve Kültür Malzemeleri</td></tr><tr><td>CytoTune-iPSC Sendai Yeniden Programlama Kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A16518</td><td></td></tr><tr><td>TeSR-E8 Ortamı</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>5940</td><td>iPSC ortamı</td></tr><tr><td>Vitronektin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>KAYA İnhibitörü</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express (TrypLE)</td><td>Life Technologies</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>12604-039</td><td>Koloni ayırma solüsyonu</td></tr><tr><td colspan="4">Kalite Kontrol Malzemeleri</strong</td></tr><tr><td>>18 mm Kapak Camı</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>%4 Paraformaldihit</td><td>Tech & Yenilik</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini&nbsp;</td><td>Vektör Laboratuvarı</td><td>SP-5050&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SSEA4 Antikor</td><td>Milipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oct4 Antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 Antikor</td><td>Milipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sox2 Antikoru</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-81 Antikor</td><td>Milipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf4</td><td>Antikoru Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG (H + L) antikoru</td><td>Moleküler Prob</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 keçi anti-tavşan IgG (H + L) antikoru</td><td>Moleküler Prob</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Moleküler Prob</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Altın antifade reaktifini uzatın</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Sürgülü Cam, Kaplamalı&nbsp;</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>İzoprilalkol</td><td>Milipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Sentez kiti</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>i-Taq DNA Polimeraz</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10X TBE Tamponu&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>yükleme yıldızı</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1kb (+) DNA merdiven işaretleyicisi</td><td>Enzimonomik</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>Alkalin Fosfataz</td><td>Millipore</td><td>SCR004</td><td></td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Durulama Tamponu</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0520.1000</td><td>Durulama Tamponu</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td>Durulama Tamponu</td></tr><tr><td>Hidroklorik Asit</td><td>Duksan</td><td>1129</td><td>Durulama Tamponu</td></tr></tbody></table>

sendai virüs ve santrifüj kullanılarak kan hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücre Üretimi

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) son gelişme olgun somatik hücreler farklılaşmamış bir, pluripotent duruma geri kanıtladı. İlk deneyler, genellikle deri fibroblast ile yapıldı vb keratinositler, idrar hücreler, fibroblastlar, Şimdi, yeniden programlama çeşitli yetişkin somatik hücre tipleri ile yapılır. Ancak, bu hastaların fibroblastlar elde etmek için invazif cerrahi prosedür gerekli. Bu nedenle, kan ve idrar hücreleri gibi süspansiyon hücreleri, çünkü birincil hücreler elde rahatlık yeniden programlama için ideal olarak kabul edildi. Burada, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) için iPSC üretilmesi için etkili bir yöntem sunulmaktadır. Yeni, matris kaplı plaka kullanılarak santrifüj seri olarak transduced PBMC&#39;ler kaplama olarak, bu protokol kolayca iPSC koloniler sağlayabilir. Bu yöntem aynı zamanda göbek kordonu kan tek-çekirdekli hücreleri (CBMCs) için de geçerlidir. Bu çalışma, basit ve etkili bir Prot sunarPBMC&#39;ler ve CBMCs yeniden programlanmasını ocol.

Bu protokol kanından izole PBMC&#39;ler yeniden programlamak için basit bir yöntem sunar. Seri kaplama ve santrifüj kombinasyonu kullanılarak, iPSCs başarıyla üretildi. Bu yöntemle, iPSCs izole edilmesi ya da belirli bir hücre tipi genişletmeden tam kan hücrelerinin küçük bir miktar ile oluşturulabilir. Başarıyla küçük hücre kültürü plakasının sadece 1x10 4 hücrelerinden iPSCs oluşturulur. yeniden programlama önce, ...

Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) yeniden programlanması için bir protokol öneriyoruz. Transdüksiyon kan hücrelerini santrifüjleme ile matris kaplı plakalara kaplayarak, iPSC'ler yüzen hücrelerden başarılı bir şekilde indüklenir. Bu teknik, PBMC'ler ve CBMC'ler gibi hücreler için basit ve etkili bir yeniden programlama protokolü önerir.

Sendai Virüs ve santrifüj kullanılarak Kan Hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücre Üretimi

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Bu çalışmanın genel amacı, santrifüj yoluyla seri ekim kullanarak periferik kan mononükleer hücrelerini indüklenmiş pluripotent kök hücrelere yeniden programlamaktır. Başlangıçta iPSC'ler, fibroblastların yeniden programlanmasıyla üretilmiştir. Günümüzde yeniden programlama için çeşitli hücre türleri kullanılmaktadır.Ancak, kanın erişilebilirliği nedeniyle PBMC'ler; ilaç tarama, hastalık modelleme ve rejeneratif tıp geliştirmede iPSC'lerin ileri uygulamaları için kabul görmüş bir hücre kaynağı olabilir. Bu çalışma aracılığıyla, santrifüj kuvveti ekleyerek PBMC'lerin kullanıldığı iPSC yeniden programlama protokolünü paylaşacağız. Bu protokol, yüzen hücrelerin yeniden programlanması sırasında başka bir seçenek sunacaktır.Prosedürü göstermek için laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Nam ile çalışacağız. Monositik hücreleri izole etmek için öncelikle, bir hücre hazırlama tüpü kullanılarak kan alma yoluyla en az on mililitre taze kan temin edin. Ardından, kanı yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın ve steril PBS ile bir e dört oranında seyreltin.Ardından, yeni bir 50 mL'lik konik tüpe on mililitre yoğunluk gradyanı medyumu ekleyin ve seyreltilmiş kanı yoğunluk gradyanı medyumunun üzerine dikkatlice katmanlandırın. Daha sonra, örneği oda sıcaklığında, santrifüj freni kullanmadan 30 dakika boyunca 750 ×g'de santrifüjleyin. 30 dakika sonra, buffy tabakasını dikkatlice yeni bir 50 mL'lik konik tüpe aktarın.30 mililitre PBS ekleyin ve hücreleri yıkayın. Ardından, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 515 ×g'de santrifüjleyin. Sonrasında PBS'yi dökün ve hücreleri 0,5 mililitre kan hücresi besiyerinde yeniden süspanse edin.Ardından, hücreleri sayın ve 24 kuyucuklu bir plakaya ekleyin. Buharlaşmayı önlemek için çevre kuyucuklara PBS ekleyin. Sonrasında, transdüksiyon öncesinde hücreleri 37 °C'de beş gün boyunca stabilize edin.Hücreleri rahatsız etmeden, üçüncü veya dördüncü günde ek olarak 0.5 milliliters taze kan hücresi besiyeri ekleyin. Bu prosedürde, kan hücrelerini 15-milliliter konik tüpe aktarın ve bir hemositometre kullanarak sayın. Ardından, transdüksiyon için üç çarpı on üzeri beş hücre hazırlayın ve hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 515 times g hızında santrifüjleyin.Ardından, süpernatanı vakumla uzaklaştırın ve hücreleri 0.5 milliliters kan hücresi besiyerinde yeniden süspande edin. Daha sonra, hücreleri kaplanmamış bir 24 kuyucuklu plakanın bir kuyucuğuna aktarın. Sendai virüs karışımını buz üzerinde çözdürün ve süspande edilen hücrelere ekleyin.Plakayı bir sızdırmazlık filmi ile kapatın ve 30 °C'de 30 dakika boyunca 1.150 ×g'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, hücreleri 37 °C'de %5 karbondioksit ortamında gece boyunca inkübe edin. Bir 24 kuyucuklu plağı vitronectin ile kaplamak için, ertesi gün vitronectin çözeltisini PBS içinde seyrelterek 5 µg/mL son konsantrasyon elde edin.Ardından, bir kuyucuğa bir mililitre vitronectin ekleyin ve oda sıcaklığında en az bir saat inkübe edin. Sonrasında, kaplama solüsyonunu uzaklaştırın ve hücreler ile virüs içeren tüm besiyerini kaplanmış kuyucuğa aktarın. Daha sonra, kalan hücreleri 0,5 mililitre taze kan hücresi besiyeri ile toplayın ve bunu hücre içeren kuyucuğa ekleyin.Ardından, plakayı 35 °C'de on dakika boyunca 1.150 ×g'de santrifüj edin ve ardından hücreleri gece boyunca %5 karbondioksit içeren 37 °C ortamda tutun. İkinci hücre transferi için, kuyucuğu daha önce açıklandığı gibi mililitre başına beş mikrogram vitronectin ile kaplayın. Her bir transdüksiyon için plakanın bir kuyucuğunu kullanın ve hücre süspansiyonunu birinci plakadan yeni kaplanmış vitronectin plakasına aktarın.Bu sırada, idame için ilk plakanın bir kuyucuğuna bir mililitre iPSC medyumu ekleyin ve %5 karbondioksit içeren 37 °C'de inkübe edin; medyumu her gün taze iPSC medyumu ile değiştirin. Koloniler, transdüksiyondan sonraki 14 ila 21. günlerde ortaya çıkacaktır. Süspansiyon halindeki hücreleri içeren yeni kaplanmış plakayı, 35 °C'de on dakika boyunca 1.150 ×g'de santrifüj edin.Santrifüjden sonra, hücreleri 37 °C sıcaklıkta %5 karbondioksit içeren ortamda gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, süpernatantı uzaklaştırın ve yerine taze indüklenmiş pluripotent kök hücre besiyeri ekleyin. Hücreler %80 konfluens düzeyine ulaşana kadar, besiyerini günlük olarak değiştirerek yapışık hücreleri muhafaza edin.Koloni seçme işleminden bir hafta önce, vitronektin kaplı 100 mm'lik bir kaba 1x10⁴ hücre ekin. Ardından, iki mL vitronektin çözeltisi ekleyerek vitronektin kaplı 60 mm'lik bir kap hazırlayın ve bunu oda sıcaklığında en az bir saat inkübe edin. Mikroskop altında gözlemleyerek, sınırları belirgin olan kolonileri kabın altına bir markör kalemle işaretleyin.Vitronektin solüsyonunu yeni plakadan uzaklaştırın ve on milimolar RHO kinaz ile desteklenmiş altı mililitre indüklenmiş pluripotent kök hücre medyumu ekleyin. Ardından, hücrelerdeki kültür medyumunu uzaklaştırın ve hücreleri üç mililitre PBS ile yıkayın. Sonrasında, bir mililitre iPSC koloni ayırma solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 30 saniye boyunca inkübe edin.Ardından, çözeltiyi plakadan uzaklaştırın ve oda sıcaklığında 30 saniye daha inkübe edin. 30 dakika sonra, plaktan 200 microliters besiyeri çekin ve hedef kolonileri pipetleme yoluyla ayırın. Daha sonra, dağılmış kolonileri yeni bir 60-millimeter kapta transfer edin.Hücreleri, onuncu pasaj aşamasına ulaşana kadar 37 °C sıcaklıkta ve %5 karbondioksit içeren ortamda inkübe edin ve muhafaza edin. Yeniden programlamanın erken aşamasında, iPSC'ler yapışık durumdaki yeniden programlanmamış diferansiye hücrelerle karışıktı. Genişletme öncesinde, iPSC'ler ve diğer hücreler ayırt edilebilecek kadar farklıydı.Hücrelerin düşük yoğunlukta ekilmesiyle, seçime uygun büyüklükte koloniler elde edildi. Koloni izole edildikten sonra, hücre kümeleri tekil hücrelere ayrıştırıldı ve kültüre edildi. Sonrasında saf iPSC kolonileri gözlemlendi.Saf indüklenmiş pluripotent kök hücreler çoğaltıldıktan sonra, hücrelerin kalitesi test edildi. İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin diferansiye olmamış durumunu doğrulamak için hücreler alkalen fosfataz ile boyandı. İzole edilen indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetilen kolonilerin tamamı pozitif boyanma gösterdi.Pluripotent belirteçler, immünofloresan boyama ile doğrulanmıştır. Yeniden programlanmış hücreler SSEA4, Oct4, Sox2, TRA-1-81, Klf4 ve en önemlisi TRA-1-60 gibi pluripotent belirteçleri yüksek düzeyde eksprese etmiştir; pluripotent belirteçlerin ekspresyonu RTPCR ile doğrulanmıştır. Santrifüj ile seri ekim yöntemi kullanılarak, geçiş amaçlı kullanılan PBMC'lerin matris kaplı plakaya tutunması sağlanmıştır.Ekler sunulmuş olup, iPSC kolonileri saflaştırma için tekrarlanır. Bu protokol kullanılarak, PBMC'lerden bir ay içinde iPSC üretilebilir. Bu protokol, transduce edilmiş hücrelerin yapışması için gereken süreyi azaltır ve kendi başına yapışamayan yeniden programlanmış hücrelerin kaybını önler.Bununla birlikte, bu prosedür uygulanırken, tamamen yeniden programlanmış koloni oluşturan iPSC'lerin saflaştırılması kritik olabilir. Daha önce, bu protokolü kullanarak PBMC'leri ve mononükleer hücreleri başarıyla yeniden programladık. Elde edilen kan hücresi türevli iPC'ler, çeşitli araştırma alanlarında yaygın olarak kullanılabilir.Bu protokol, ilerideki uygulamalar ve çalışmalar için diğer yüzen süspansiyon hücresi türlerinin yeniden programlanma sürecine yardımcı olabilir.

induced-pluripotent-stem-cell-generation-from-blood-cells-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Burada tek bir lentiviral yeniden programlanması vektörü kullanılarak periferal kan 3-4 ml insan iPSCs üretimi için basit ve etkili bir protokol göstermektedir. Hazır kan hücrelerinin yeniden programlanması daha geniş bir araştırma toplum için erişilebilir kılarak IPSC teknoloji kullanımı hızlandırmak için vaat ediyor.

STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

Bu video, periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMNC'ler) Sendai virüsü kullanılarak indüklenmiş nöral kök hücrelere (iNSC'ler) yeniden programlanmasını göstermektedir. Sendai virüsü, hücreleri yeniden programlamak için verimli ve güvenli bir araç sunan, entegre olmayan bir virüstür.

Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden (PBMNC'ler) İndüklenmiş Nöral Kök Hücrelerin (iNSC'ler) Üretilmesi: PBMNC'leri iNSC'lere Yeniden Programlamak için Sendai Virüsü Tabanlı Bir Prosedür

Burada, biz tutarlı sonuç ve geliştirilmiş verimlilik gösterir Sendai virüs ile transgen-özgür insan iPSCs içine insan somatik hücreleri yeniden programlamak için kurulan yöntem sunuyoruz.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

Burada bir episomuna göre yeniden programlama strateji ve histon deasetilaz inhibitörleri kullanılarak periferal kandan alınan insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi için bir protokol açıklar.

Epizomlar ve HDAC inhibitörleri kullanarak Blood Verimli iPS Hücre Üretimi

Bir yöntem de periferik kan hücrelerinden zenginleştirilen hematopoietik projenitör hücrelerinden insan nöral kök hücrelerini elde etmek için geliştirilmiştir.

Periferik kan Hematopoetik Progenitör Hücreleri İnsan Sinir Kök Hücre Doğrudan İndüksiyon

Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs), klinik uygulamalar ve temel araştırma için hastaya özgü dokuların bir kaynağı temsil eder. Burada, non-entegre epizomal plasmidleri kullanılarak viral içermeyen iPSCs içine donmuş buffy kat elde edilen insan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMNCs) yeniden programlamak için detaylı bir protokol mevcut.

Bütünleşmeyen episomal plasmidler kullanılarak dondurulmuş Buffy tüylerdeki uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu protokol, transkripsiyon faktörlerinin zorlanmış ekspresyonu yoluyla insan pluripotent kök hücrelerinden hemojenik endotel ve multipotansiyel hematopoietik progenitörlerin verimli indüksiyonunu açıklar.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Transkripsiyon Faktörleri aşırı ifadesinin doğrudan Hemogenic Endotelyumunun uyarılması ve Kan

Bu protokol, yeniden programlama faktörleri içeren matrigel ve Sendai virüs vektörlerinin bir kombinasyonunu kullanarak, besleyicisiz koşullarda insan periferik T hücrelerinden indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) nasıl üretileceğini açıklar.

Besleyici içermeyen şartlar Sendai virüs kullanılarak insan periferik T hücrelerinden uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu protokolün amacı, melanom tümörüne sızan lenfositlerin indüklenmiş pluripotent kök hücrelere yeniden programlanması için protokolü göstermektir.

İnsan Melanom tümör-süzücü lemfositler ile ilgili uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu protokol, insan yetişkin periferik kan hücrelerinden entegrasyon gerektirmeyen iPSC'lerin verimli bir şekilde üretilmesi için ayrıntılı bir yöntemi açıklar. Yeniden programlama faktörlerini ifade etmek için dört oriP/EBNA bazlı epizomal vektörün kullanılmasıyla, KLF4, MYC, BCL-XL veya OCT4 ve SOX2, 1 mL periferik kandan binlerce iPSC kolonisi elde edilebilir.

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Keşfedin, santrifüj kullanarak periferik kan mononükleer hücrelerini indüklenmiş pluripotent kök hücrelere yeniden programlama yöntemini. Bu protokol, ilaç tarama ve rejeneratif tıpta PBMC kaynaklı iPSC kullanımını kolaylaştırır.

Sendai Virüs ve santrifüj kullanılarak Kan Hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücre Üretimi

Daha fazla video keşfet