Görüntü tabanlı Sitometrisi Tekniği Granülosit Fonksiyonu Değişiklikleri değerlendirin İn Vitro

Bu prosedürün genel amacı, granülosit fonksiyonunu iki parametreli bir yaklaşım olarak değerlendirmektir. Bu, oksidatif patlamayı görselleştirmek için önce hasta kan örneklerinden alınan granülositlerin biyo partiküller ve reaktif ile inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, inkübasyon sonrası fagositoz bloke edilir ve daha sonra ilgilenilen hücre yüzeyi reseptörleri, granülositlerin pozitif olarak tanımlanmasına izin vermek için etiketlenir.

Sonuç olarak, aktive edilmiş granülosit alt kümeleri, görüntü tabanlı akış sitometrisi ile tanımlanabilir ve izole edilebilir. Bu yöntem, beslenme alışkanlıklarının ve beslenme uygulamalarının değişikliklere ve granülosit fonksiyonuna nasıl katkıda bulunduğu gibi beslenme veya klinik immünoloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi olan Eric Prado olacak.

Periferik kan örneğinin çözülmesini sağladıktan sonra, SIU'ların biyo partikülleri ve DHE, oda sıcaklığında ve 37 santigrat derece B banyosunda etil malamlanır, reaktifler çözüldüğünde, steril bir başlık içinde dört ayrı 1.2 mililitrelik tüpe 20 mikrolitre ssus biyo partikül ekleyin. Daha sonra, biyo partikülleri içeren her tüpe 40 mikrolitre çözülmüş DHE ekleyin ve reaktifi tüplerin dibinde toplamak için tüpleri tezgahın üzerine hafifçe vurun. Her tüpe 100 mikrolitre karışık tam kan ekledikten sonra, pamuk uçlu bir aplikatör ile tüplerin iç kenarı boyunca kirletici kanı alın ve kanı ve reaktifleri üç döngü için elektronik bir pipet seti ile karıştırın.

Üçüncü döngüden sonra, tüm tüpleri ışıktan korunan bir buz kovasına yerleştirin. Daha sonra tüpleri 37 santigrat derece hızlı bir banyoda 10, 20 veya 40 dakika inkübe edin, tüm inkübasyonların aynı anda bitmesini sağlamak için 40 dakikalık tüpten başlayın. İnkübasyonların sonunda, tüplerin her birine 15 mikrolitre etil malamed dağıtın.

30 dakika sonra, hücreleri uygun antikorların her biri 10 mikrolitre ile inkübe edin. Bir saat sonra, hücreleri 750 mikrolitre beyaz kan hücresi düzeltmesi kırmızı kan hücresi biti çözeltisinde inkübe edin. Bir saat sonra, inkübasyon hücreleri santrifüjleyin ve süpernatanı vakumla aspire edin ve hücre peletinin üzerinde 100 mikrolitrelik bir artık sıvı hacmi bırakın.

Şimdi her numuneye 10 mikrolitre taze seyreltilmiş yedi A ve 50 mikrolitre PBS ve 25 mikrolitre kalibrasyon boncuğu ekleyin. Daha sonra tüpleri kapatın, folyoya sarın ve dört santigrat derecede saklayın. Görüntü tabanlı akış sitometresi hazır olduğunda, numuneleri analiz etmek için önceden tanımlanmış parametreleri kullanarak en az 3000 ULU saha olayı toplayarak her numune tüpünü çalıştırın.

Ham görüntü dosyalarına bir telafi matrisi uygulamak ve telafi edilmiş görüntü dosyaları oluşturmak için IDEA yazılımının otomatik yazılım telafi sihirbazını kullanın. Ardından, tek tek CIF dosyalarını IDEA yazılımına yükleyin ve her hasta numunesi için granülosit alt kümelerini tanımlamak için aşağıdaki grafikleri oluşturun. Önce uyarılmamış kontrolü bir referans standardı olarak kullanarak, ilk kapıları oluşturmak ve odakta olduğu düşünülen hücreleri tanımlamak için parlak alan gradyan kök ortalama karesinin histogramını kullanın.

Ardından, tekli hücreleri enkazdan ve çiftlerden ayırmak için, Parlak Alan en boy oranının parlak alan alanına karşı bir nokta grafiği oluşturun. Temiz bir hücre popülasyonu tanımlandıktan sonra, CD 45'e karşı CD 66'nın bir nokta grafiğini oluşturun B.To CD 45 pozitif CD 66 B pozitif granülositlerini pozitif olarak tanımlayın. Son olarak, aureus için parlak ayrıntı yoğunluğunun oksidatif patlama için parlak ayrıntı yoğunluğuna karşı bir nokta grafiği oluşturun.

Birinci ve dokuzuncu kanallarda parlak alan görüntülerini, üçüncü kanaldaki biyo partikülleri, dördüncü kanalda DHE'yi, beşinci kanalda yedi a a d, kanal 11'de CD 66 B'yi ve Kanal 12'de CD 45'i toplayan aktive edilmiş granülositlerin alt kümelerini tanımlamak için, birleşik DHE ve biyo partikül olaylarını gösteren iki renkli bir kaplama da oluşturulabilir. Görüntü tabanlı akış sitometrisi kullanılarak, homojen bir aktive granülosit popülasyonu üç farklı aktivasyon alt kümesine ayrılabilir. Bu yöntemle, üç alt kümeyi çözmenin en etkili yolu, oksidatif patlamaya karşı fagositoz için parlak ayrıntı yoğunluğunu çizmektir.

IDEAS yazılımında kolokalizasyon sihirbazının daha fazla kullanılması, yüksek aktivasyonun ayırt edici bir işareti olan granülositlerin eşzamanlı fagositozu ve oksidatif patlamasının varlığının ölçülmesine izin verir. Ek olarak, bu deneyde, 40 dakikalık inkübasyon süresi, yüksek derecede aktif granülositlerin en yüksek yüzdesini göstermiştir. Bu nedenle, protokole en az üç inkübasyon periyodunun dahil edilmesi, belirli bir klinik tedavinin granülositlerin zamansal aktivasyon durumunu nasıl değiştirebileceğinin belirlenmesini kolaylaştırır.

Bu prosedürü takiben, ek soruları yanıtlamak için boncuk bazlı multipleks tahliller gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Örneğin, biyo partiküllere maruz kaldıktan sonra sırtüstü içindeki GRANULOCYTE kemokin üretimi nasıl değişir?