Erken Postimplantation Fare Embriyolar içine Hücreleri veya DNA Kesinlikle lokalize Transferi Yöntemleri

Bu prosedürlerin genel amacı, hücrelerin veya DNA'nın implantasyon sonrası erken fare embriyolarına nasıl hassas bir şekilde aktarılacağını göstermektir. Bu yöntemler, in vitro kültürlenmiş hücrelerin in vivo potansiyelinin test edilmesi ve belirli embriyonik aşamalarda belirli genlerin işlevlerinin test edilmesi gibi gelişimsel biyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniklerin temel avantajları, herhangi bir özel ekipman gerektirmemeleri ve erken poz veren plantasyon faresi bryo'nun deneysel manipülasyonlarını mümkün kılmalarıdır Metin protokolüne göre E 7.5 veya E 8.5 gününde hamile bir dişi kurban ettikten sonra, uterusu izole etmek için makas ve forseps kullanın ve iki çift ince forseps ile M iki orta ile doldurulmuş 30 milimetrelik bir tabağa yerleştirin.

Myometriumu dikkatlice yırtın, ardından ekstra embriyonik boşlukları delmemeye dikkat ederek desiduayı soyun. Riker'ın zarını sıkıştırmak için forseps kullanarak çıkarın ve yavaşça embriyodan ayırın. Daha sonra bir stereo diseksiyon mikroskobu altında, yumurta sarısı kesesi amniyonunun ve op plasental koninin sağlam olduğundan emin olmak için embriyoları kontrol edin Bir pipetle, embriyoları M iki'lik temiz bir tabağa aktarın ve embriyoları kısmen soğutmak için buz veya bir buz platformu üzerinde 30 milimetrelik plastik bir Petri kabı kapağına yerleştirin.

Kültürlenmiş hücreleri fare embriyolarına aşılamak için metin protokolüne göre kültür ortamını ve kültür embriyolarını hazırlayın. Altı kuyucuklu bir kültür plakasından GFP'yi her yerde ifade eden eblast kök hücrelerini fiziksel olarak kazımak için 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak başlayın. Hücreleri embriyoları içeren tabağa aktarın.

Bir ağız pipeti yapmak için aspiratör tüpüne elle çekilmiş bir aşılama kılcal damarı takın, greftleme kılcal damarına 20 hücreden daha büyük bir veya daha fazla hücre kümesi çekmek için ağız pipetini nazikçe emdirin. Daha sonra büyük kümeleri dağıtmak için hücreleri nazikçe üfleyin. Yaklaşık 10 ila 20 hücre içeren bir küme seçin ve onu aşılama kılcal damarına çekin.

Yine, kümeyi bir çift forseps ile kılcal damarın açıklığına yakın tutmak. Embriyoyu gevşek bir şekilde yerinde tutun ve aşılama kılcal damarını ilgilenilen bölgeye yerleştirin. Bir açıklık oluşturmak için.

Yığını greftleme kılcal damarından nazikçe dışarı atın ve 10 ila 20 hücreden oluşan kısa diziyi embriyoda bırakın. Embriyoları aynı M iki ortamındaki tabağa bırakın ve aşılanmış embriyoları görüntülemek için bir floresan bileşik diseksiyon mikroskobu ve kamera kullanın. Embriyoların aşırı ışığa ve ısıya maruz kalmasını önlemek için görüntüleme süresini minimumda tutun.

Bir macun kullanarak görüntülemeden hemen sonra, embriyoları minimum hacimde M iki ortam ile önceden dengelenmiş kültür ortamına aktarın ve elektroporasyon deneylerini gerçekleştirmeden önce metin protokolündeki yönergelere göre kültüre aktarın, ince uçlu ve 10 mikrometreden daha az bir açıklığa sahip DNA enjeksiyon pipetlerini çekmek için yatay bir mikro pipet polar kullanın. Cam kılcal elektroporasyon için, DNA enjeksiyon pipetlerinin açıklığını temiz bir uçla ve kırık kenarlar olmadan 20 veya 30 mikrometre iç çapa kesmek için bir mikro dövme kullanın. Her bir platin elektrodu ince yalıtılmış bir tele takın ve yalıtım bandı ile kaplı bir mikroenjeksiyon iğne tutucusuna yerleştirin.

El yapımı bir kılcal elektrot hazırlamak için, 0,2 milimetre çapında bir platin tel, 20 veya 30 mikrometre çapında sabit bir açıklığa sahip bir elektroporasyon cam kılcal damarına yerleştirin. Elektrik akımını odaklamak ve plazma DNA'sını embriyodaki küçük bir ilgi alanına iletmek. L şeklinde bir elektrot yapmak için, 0,2 milimetre çapında bir platin teli bükün ve L'nin yatay kısmı yaklaşık bir milimetre uzunluğunda bir L şekli oluşturun.

İğne tutucuları standart mikro manipülasyon aleti tutucularına monte edin. Kılcal elektrodu güç kaynağının anoduna bağlayın. L şeklindeki elektrodu multimetrenin anoduna bağlayın.

Ardından multimetrenin katotunu güç kaynağının katoduna bağlayın. Elektroporasyon cam kılcalını PBS ile üst kısmın bir ila iki milimetresine kadar doldurun ve düz platin elektrodu, kılcal damarın dibine ulaşana kadar cam kılcal damara yerleştirin. L şeklindeki elektrotu PBS ile doldurulmuş 30 milimetre petri kabının yüzeyine sabitleyin.

DNA enjeksiyonu için pnömatik bir piko pompası kullanın. Enjeksiyon iğnesini lateral eblasttan embriyonun amniyotik boşluğuna yerleştirin ve boşluğa veya tamamen dolana kadar yaklaşık beş mikrolitre DNA çözeltisi enjekte edin. Embriyoyu patlatmamaya özen gösterin.

Daha sonra embriyoyu elektrotlar arasına dikkatlice yerleştirin ve kılcal elektrodu DNA'nın verileceği kesin konuma getirin. Her biri 50 milisaniye süren altı darbede 200 volt kullanarak, embriyoyu her darbe arasında bir saniyelik bir aralıkla elektropore etti. Bir sonraki embriyo için elektroporasyonu tekrarlamadan önce embriyoyu hemen önceden dengelenmiş kültür ortamına aktarın.

Elektroporasyondan iki saat sonra elektroporasyona maruz kalmış canlı veya ölü hücreleri tespit edin. Burada gösterilen metin protokolüne göre, EGFP'yi her yerde eksprese eden epi PSC'lere sahip, E 7.5 üzerine aşılanmış ve 24 saat boyunca ex vivo kültürlenmiş bir embriyodur. 10 ila 16 fsc, E 7.5 embriyolarına aşılandığında, konakçı embriyo içinde iyi bir şekilde birleşti ve çoğaldı.

Bununla birlikte, daha fazla hücrenin aşılanması daha iyi kimerizm ile sonuçlanmaz ve aslında burada gösterildiği gibi birleşmemiş kümelerle sonuçlanır. GFP eksprese eden plazmitlerin bu elektroporasyonunda gösterildiği gibi. GFP pozitif hücreler elektroporasyondan bir ila iki saat sonra tespit edildi.

Geç ilkel çizgi evresi embriyosundaki distal eblast hücreleri elektropore edildiğinde, etiketli hücreler kültürde 24 saat sonra nöral derme katkıda bulunur, bu da gastro evre embriyolardaki eblast hücrelerinin bilinen kader haritalarına karşılık gelir. Bu şekil, elektroporasyon için diğer elektrot türlerinin kullanılmasına benzer şekilde, kılcal elektrotun da hedeflenen bölgede bir dereceye kadar hücre ölümüne neden olduğunu göstermektedir. Bu bölge, komşu bölgelere kıyasla daha koyu renkli göründüğünden, ölü hücrelerin çekirdeklerini zar geçirimsiz uzak kırmızı floresan bir zarla etiketlemek.

Kılcal elektroporasyon tekniğinin, elektroporasyon bölgesinin yakınında sadece az sayıda ölü hücre ile sonuçlandığı doğrulandı. Bu prosedürleri denerken, embriyoları iki saat içinde kültürlemeye başlamak önemlidir. Kültürün sonunda uterusu farelerden izole ettikten sonra embriyolar sabitlenebilir.

Bir donörün veya elektro örgülü hücrelerin konakçı embriyolara katkısı gibi ek soruları yanıtlamak için kesit boyama gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerin DNA'sını implantasyon sonrası erken fare embriyolarına nasıl hassas bir şekilde aktaracağımızı iyi anlamış olmalıyız.