Radyal Hareket ve retroviral replike olan bir vektör transduse, Yapışmayan Alloresponsive T lenfositlerinin sitotoksik işlev

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yapışık tümör hücrelerinin tek tabakası üzerinde yapışık olmayan efektör T lenfosit göçünü göstermektir. Bu, ilk olarak, ikinci adım floresan etiketli efektör olarak, poli D lizin kaplı Teflon maskeli slaytların kuyucuklarında bir tek tabaka halinde yapışık tümör hücrelerinin oluşturulmasıyla elde edilir, T lenfositleri bir hücre sedimantasyon manifoldu kullanılarak monotabakanın merkezine çökeltilir. Daha sonra, yapışık olmayan hücrelerin tek tabaka üzerindeki göçünü görselleştirmek için ışık ve floresan mikroskobu kullanılır.

Sonuçlar, yapışık olmayan T lenfositlerinin yapışık bir tümör hücresi tek tabakası ile ko-kültürde migrasyon ve efektör fonksiyonlarının, lenfositler bir retroviral vektör ile transdüksiyondan sonra korunduğunu göstermektedir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en önemli avantajı, yapışık olmayan efektör T lenfositlerinin radial migrasyonunun yapışık tümör hücreleri ile kömür kültüründe ölçülebilmesidir. Bunun, primer veya metastatik beyin tümörleri olan hastalar için geniş kapsamlı etkileri vardır, çünkü sitozin deaminaz gibi bir ilaç yanlısı aktivatör geni eksprese etmek üzere modifiye edilmiş allojenik sitotoksik T lenfositleri, beyindeki tümörü ortadan kaldırmak için multimodal bir yaklaşım olarak test edilmektedir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, uyum özelliklerindeki tümör hücresi büyümesinin heterojenliği nedeniyle yapışık tümör hücresi tek katmanları oluşturmada mücadele edeceklerdir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü eşit bir tümör tek tabakası oluşturma ve yapışık olmayan L-O-C-T-L'nin etkili bir sedimantasyonu için adımlar, her iki hücre tipinin özelliklerinin deneyimli bir şekilde anlaşılmasını gerektirir. Başlamak için dörde kadar sterilize edin.

150 milimetreye 15 milimetre Petri kabında steril bir Teflon kaplı slayt. Nem sağlamak için slaytların yanına iki ila üç mililitre steril su içeren 35 milimetreye 10 milimetrelik bir Petri kabı yerleştirin. Daha sonra, her bir oyuğu mililitre başına 100 mikrogramlık bir poli D lizin veya poli L lizin çözeltisi ile kaplayarak slaytları hazırlayın.

Slaytları oda sıcaklığında bir saat inkübe edin, daha sonra çözeltiyi aspire edin ve hazırlanan numune kuyucukları ile kuyu yüzeyini PBS ile iki kez durulayın. Yapışık tümör hücrelerinin birleşik bir şişesini hasat edin. Işık mikroskobu ile canlı hücrelerin sayısını sayın ve ardından hücreleri mililitre başına beş kez 10 ila altı hücre konsantrasyonunda askıya alın.

Tamponlu büyüme ortamında, tümör hücresi tipine bağlı olarak her bir oyuğa beş ila 10 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin, kuyu hacmini orta ile 40 mikrolitreye getirin ve hücreleri eşit şekilde dağıtmak için yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin. Kuyucukları tohumladıktan sonra, tümör hücrelerinin 30 dakika oda sıcaklığında yerleşmesine izin verin. Daha sonra kapağı Petri kabının üzerine yerleştirin ve en az 24 saat boyunca %5 karbondioksit inkübe edilmiş 37 santigrat derece nemlendirilmiş bir inkübatöre dikkatlice aktarın.

Ortamın bir kısmını tek tabakadan dikkatlice çıkararak ve daha büyük hacimli taze tam T hücresi ortamı ile değiştirerek kuyucuklardaki kültür ortamını günlük olarak değiştirin. Hücreler, hücreleri tümör hücresi tek tabakası üzerine çökeltme için hazırlamak için tipik olarak bir ila üç gün içinde birleşecektir. Yapışmayan T hücrelerini hasat edin ve bunları testten en az bir saat önce üreticinin protokolüne göre bir hücre proliferasyon boyası ile etiketleyin.

Daha sonra, tümör hücresi slaytlarını içeren nemlendirilmiş odayı biyolojik güvenlik kabinine yerleştirin. Kuyuları PBS ile pipetleyerek yıkayın ve ardından kuyucuklara %10 serum içeren 45 mikrolitre tam ortam ekleyin. Sterilize edilmiş bir hücre sedimantasyon manifoldunu, manifoldun ucundaki kanca sürgünün altına değene kadar kuyuların üzerine kaydırın.

Ortamın manifold kanallarında görünür olduğundan emin olun. Sonra yapışmayan hücreleri sayın ve bir ila iki kez 10 ila beşte bir oranında askıya alın. Ortamdaki mikrolitre başına hücreler.

Hücre sedimantasyonuna müdahale edebilecek hücre kümelerini ortadan kaldırmak için hücreleri nazikçe parçalayın. Her biri için hücre süspansiyonunun bir mikrolitresini manifoldun kanalına yavaşça pipetleyin. Daha sonra, kanaldaki hücrelerin tek tabakaya yerleşmesini sağlamak için cihazı oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika inkübe edin.

Hücreler yerleştikten sonra, sürgüye dokunmadan manifoldu yavaşça düz bir şekilde yukarı kaldırın. Hücre peletlerinin manifold kanalının çevresine oturduğundan emin olun. Bir mikroskop kullanarak, oturmuş hücreler tek tabakaya hafifçe yapışmalıdır, böylece lamı hafifçe hareket ettirmek peleti dağıtmaz.

Hücrelerin çökeldiğini onayladıktan sonra, slaytı bir karbondioksit ve nem odası ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskoba aktarın. Hücrelerin parlak alan ve çok kanallı floresan görüntülemesi için dört x objektifi kullanın. Parlak alan ve floresan kanallarında belirli bir alanın görüntülerini alın ve ardından görüntü yakalama yazılımıyla mikron çubukları ekleyin.

Tüm zaman noktaları elde edildikten sonra slaydı zaman noktaları arasında nemlendirilmiş bir inkübatörde saklayın. Görüntü dosyalarını görüntü düzenleme programına sürükleyip bırakın ve birden çok katmana sahip bir görüntü dosyası oluşturmak için katman ekle seçeneğini seçin. Işığı ve floresan görüntüleri tek bir katmanda birleştirin.

Sekiz milimetreye sekiz milimetrelik bir alanın fotoğraflarını çekmek için çekim yazılımını kullanın. Yazılım, tüm kuyu boyunca en iyi temsil edilen kanalı kullanarak yakalanan görüntüleri otomatik olarak bir araya getirecek şekilde ayarlanmalıdır. Sadece floresan kanalları görüntüleniyorsa, bu, yapışık hücrelerin görüntülenmesi için kanal olmalıdır.

Alternatif olarak, görüntüler görüntü düzenleme yazılımı kullanılarak birleştirilebilir. Bu, korunan görüntülerin bölgelerini bir görüntüden diğerine hizalayarak ve tam bir resim oluşturulana kadar görüntüleri üst üste bindirilerek yapılır. Görüntü yazılımını kullanarak görüntüleri birleştirin.

Floresan T hücresi agregasyonunu veya zamana yayılmasını görselleştirmek için Image J yazılımıyla yüzey yoğunluğu floresan haritaları oluşturmak için birleştirilmiş görüntüleri kullanın. Zümrüt yeşili floresan protein ekspresyon genini kodlayan replikasyona yetkin bir retroviral vektör ile transdüksiyona sahip Allo CTL olarak bilinen insan allo reaksiyon sitotoksik T lenfositleri, bir tek tabaka glioma hücresinin merkezine oturtuldu. Dört saat sonra, tüm OCTL 24 saat içinde görünür agregalar oluşturmuştu.

Yapışık hücre tek tabakasında, tümör hücrelerinin parçalandığını gösteren boş yamalar ortaya çıktı ve bazı allo CTL'ler ön kenarın ötesine göç etmişti. Floresan olarak işaretlenmiş murin Allo CTL, bir saat içinde grip floresan olarak işaretlenmiş glioma hücrelerinin tek tabakasının ortasına oturtuldu Allo CTL, glioma hücreleriyle yakından ilişkili 48 saat boyunca, Allo CTL mono tabaka yüzey yoğunluğunun merkezinden uzaklaşmıştı. Floresan haritaları, bu görüntülerden görüntü J yazılımı ile oluşturuldu ve 48 saat sonra merkezden önemli ölçüde uzaklaşmayı gösteriyor.

Tümör hücresi tek tabakasının sağlıklı kültür koşullarını sürdürmesi için kültür ortamının günlük olarak değiştirilmesi önemlidir. Ek olarak, bir kez ustalaştıktan sonra, yapışmayan hücrelerin sedimantasyonu bu prosedürü takiben yaklaşık 20 dakika sürmelidir. Hücre yolu izleme gibi diğer yöntemler, allo CTL'nin tek tabaka boyunca göç etme hızı veya sitotoksik işlevlerini yerine getiren tümör hücreleriyle temas halinde oldukları süre hakkındaki soruları yanıtlamak için kullanılabilir.

Bu protokol, immün gen tedavisi alanındaki araştırmacıların, tümör hücreleri ile kokültür içinde gen modifiye T lenfositlerinin göçünü keşfetmelerine yardımcı olacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, kokültür başına yapışmayan ve yapışan hücrelerin nasıl hazırlanacağını ve yapışık olmayan hücrelerin tümör hücresi tek tabakası üzerinde yatay radyal göçünü incelemek için hücre sedimantasyon manifoldunun nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.