Radyal Hareket ve retroviral replike olan bir vektör transduse, Yapışmayan Alloresponsive T lenfositlerinin sitotoksik işlev

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yapışkan tümör hücrelerinden oluşan bir monokatman üzerinde yapışkan olmayan efektör T lenfosit migrasyonunu göstermektir. Bu işlem, ilk olarak poli-D-lizin kaplı Teflon maskeli lamların kuyucuklarında yapışkan tümör hücrelerinden oluşan bir monokatman oluşturularak, ikinci adımda ise floresan işaretli efektör T lenfositlerin bir hücre sedimentasyon manifoldu kullanılarak monokatmanın merkezine çöktürülmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, yapışkan olmayan hücrelerin monokatman üzerindeki migrasyonunu görselleştirmek için ışık ve floresan mikroskobu kullanılır.

Sonuçlar, yapışkan bir tümör hücresi monokatmanı ile ko-kültürdeki yapışmayan T lenfositlerin migrasyon ve efektör fonksiyonlarının, lenfositlerin bir retroviral vektörle transdüse edilmesinden sonra da korunduğunu göstermektedir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, yapışmayan efektör T lenfositlerin radyal migrasyonunun, yapışkan tümör hücreleriyle ko-kültürde ölçülebilmesidir. Bu durum, sitozin deaminaz gibi bir ön-ilaç aktivatör geni eksprese edecek şekilde modifiye edilmiş allojenik sitotoksik T lenfositlerin, beyindeki tümörü ortadan kaldırmak için multimodal bir yaklaşım olarak test edilmesi nedeniyle, primer veya metastatik beyin tümörlü hastalar için geniş kapsamlı etkiler taşımaktadır.

Genel olarak, bu yöntemde yeni olan bireyler, tümör hücre büyümesinin adhezyon özelliklerindeki heterojenlik nedeniyle aderent tümör hücresi monokatmanları oluştururken zorluk yaşayacaklardır. Eşit bir tümör monokatmanı oluşturma ve aderent olmayan L-O-C-T-L'nin etkili bir şekilde çöktürülmesi için gereken adımlar, her iki hücre tipinin özelliklerine dair deneyimli bir anlayış gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir. Başlamak için, dört adede kadar sterilize edilmiş.

Steril 150 milimetre x 15 milimetre bir Petri kabı içerisine 10 kuyucuklu Teflon kaplı lamlar yerleştirin. Nem sağlamak amacıyla, lamların yanına iki ila üç mililitre steril su içeren 35 milimetre x 10 milimetre bir Petri kabı koyun. Ardından, her bir kuyucuğu 100 mikrogram/mililitre konsantrasyonundaki poly D lysine veya poly L lysine çözeltisi ile kaplayarak lamları önceden kaplayın.

Slaytları oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin, ardından solüsyonu aspire edin ve örnek kuyucukları hazırlanmış haldeyken kuyucuk yüzeyini iki kez PBS ile durulayın. Konfluen bir flasktaki aderent tümör hücrelerini hasat edin. Canlı hücre sayısını ışık mikroskobu ile sayın ve ardından hücreleri mililitre başına beş x 10⁶ hücre konsantrasyonunda süspande edin.

Tamponlanmış büyüme ortamına, tümör hücresi tipine bağlı olarak her kuyucuğa beş ila 10 µL hücre süspansiyonu ekleyin, kuyucuktaki hacmi ortamla 40 µL'ye tamamlayın ve hücrelerin eşit şekilde dağılması için pipetle yavaşça aşağı yukarı hareket ettirin. Kuyucuklara ekim yaptıktan sonra, tümör hücrelerinin oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çökelmesini bekleyin. Ardından Petri kabının kapağını kapatın ve dikkatlice %5 karbon dioksit içeren, 37 °C'ye ayarlanmış nemlendirilmiş bir inkübatöre aktararak en az 24 saat inkübe edin.

Monotabakadan bir miktar medyumu dikkatlice uzaklaştırıp yerine daha fazla hacimde taze komplet T-hücre medyumu ekleyerek kuyucuklardaki kültür medyumunu her gün değiştirin. Tümör hücresi monotabakası üzerine çöktürme işlemi için hücreler tipik olarak bir ila üç gün içinde konfluens olacaktır. Adherent olmayan T hücrelerini hasat edin ve analizden en az bir saat önce, üretici protokolüne uygun olarak hücre proliferasyon boyası ile işaretleyin.

Ardından, tümör hücresi lamlarını içeren nemlendirilmiş kabı biyolojik güvenlik kabinine yerleştirin. Kuyucukları pipetleme yoluyla PBS ile yıkayın ve ardından kuyucuklara %10 serum içeren 45 µL komple medyum ekleyin. Sterilize edilmiş bir hücre çöktürme manifoldunu, manifoldun ucundaki kanca lamın tabanına değene kadar kuyucukların üzerine kaydırın.

Besiyerinin manifold kanallarında görünür olduğundan emin olun. Ardından, yapışmayan hücreleri sayın ve onları besiyeri içerisinde mikrolitre başına 1 ila 2 × 10⁵ hücre olacak şekilde süspande edin.

Hücre çökelmesini engelleyebilecek hücre kümelerini ortadan kaldırmak için hücreleri nazikçe dağıtın. Her bir kuyu için hücre süspansiyonundan bir mikrolitre ile yavaşça manifold kanalına pipetleyin. Ardından, kanaldaki hücrelerin monokatman üzerine çökmesine izin vermek için düzeneği oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika inkübe edin.

Hücreler çöktükten sonra, lamla temas etmeden manifoldu nazikçe yukarı kaldırın. Hücre peletlerinin manifold kanalının çevresine oturduğundan emin olun. Mikroskop altında bakıldığında, oturan hücreler monokatmana hafifçe yapışmış olmalıdır; böylece lamı nazikçe hareket ettirmek peleti dağıtmayacaktır.

Hücrelerin çöktüğünden emin olduktan sonra, lamı karbondioksit ve nem haznesi ile donatılmış bir ters mikroskoba aktarın. Hücrelerin parlak alan ve çok kanallı floresan görüntülemesi için 4x objektifini kullanın. Belirli bir alanın parlak alan ve floresan kanallarındaki görüntülerini alın ve ardından görüntü yakalama yazılımı ile mikron çubukları ekleyin.

Tüm zaman noktaları elde edildikten sonra, lamı zaman noktaları arasında nemlendirilmiş bir inkübatörde saklayın. Görüntü dosyalarını görüntü düzenleme programına sürükleyip bırakın ve çok katmanlı bir görüntü dosyası oluşturmak için katman ekle seçeneğini belirleyin. Işık ve floresan görüntülerini tek bir katmanda birleştirin.

Sekiz milimetreye sekiz milimetrelik bir alanın fotoğraflarını çekmek için görüntüleme yazılımını kullanın. Yazılım, yakalanan görüntüleri, tüm kuyucuk boyunca en iyi temsil edilen kanalı kullanarak otomatik olarak birleştirecek şekilde ayarlanmalıdır. Yalnızca floresan kanalları görüntüleniyorsa, bu kanal yapışkan hücrelerin görüntülenmesi için kullanılan kanal olmalıdır.

Alternatif olarak, görüntüler görüntü düzenleme yazılımı kullanılarak birleştirilebilir. Bu işlem, görüntülerin birinden diğerine korunan bölgelerinin hizalanması ve eksiksiz bir resim oluşturulana kadar görüntülerin üst üste bindirilmesiyle gerçekleştirilir. Görüntü yazılımını kullanarak görüntüleri birbirine ekleyin.

Floresan T-hücresi agregasyonunu veya zaman içindeki yayılımını görselleştirmek için Image J yazılımını kullanarak birleştirilmiş görüntülerden yüzey yoğunluğu floresan haritaları oluşturun. Emerald yeşil floresan protein ekspresyon geni kodlayan replikasyon yeteneğine sahip bir retroviral vektör ile transduksiyonu yapılmış, Allo CTL olarak bilinen insan allo-reaktif sitotoksik T lenfositleri, glioma hücrelerinden oluşan bir monoton tabakanın merkezine yerleştirilmiştir. Dört saat sonra, Allo CTL'lerin 24 saat içinde görünür agregatlar oluşturduğu gözlemlenmiştir.

Tümör hücrelerinin lizisini gösteren boş alanlar yapışık hücre monokatmanında ortaya çıkmış ve bazı allo CTL'ler ön kenarın ötesine göç etmiştir. Floresan işaretli murin Allo CTL'ler, floresan işaretli gliom hücrelerinden oluşan bir monokatmanın merkezine yerleştirilmiştir; bir saat sonra Allo CTL'ler gliom hücreleriyle yakın ilişki kurmuştur; 48 saat sonra ise Allo CTL'ler monokatmanın merkezinden uzaklaşmıştır yüzey yoğunluğu. Bu görüntülerden ImageJ yazılımı ile floresan haritaları oluşturulmuştur ve 48 saat sonra merkezden belirgin bir göç olduğunu göstermektedir.

Sağlıklı kültür koşullarını sürdürmek için tümör hücresi monotabakasının kültür ortamının her gün değiştirilmesi önemlidir. Ayrıca, prosedürde uzmanlaşıldığında, yapışmayan hücrelerin çökelmesi yaklaşık 20 dakika sürmelidir. Allo CTL'lerin monotabaka boyunca göç etme hızı veya sitotoksik fonksiyonlarını gerçekleştirirken tümör hücreleriyle temas halinde kaldıkları süre hakkındaki soruları yanıtlamak için hücre yolu izleme gibi diğer yöntemler kullanılabilir.

Bu protokol, immüno gen tedavisi alanındaki araştırmacıların, tümör hücreleriyle ko-kültürdeki genle modifiye edilmiş T lenfositlerinin migrasyonunu incelemelerine yardımcı olacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, ko-kültür için yapışmayan ve yapışan hücrelerin nasıl hazırlanacağı ile yapışmayan hücrelerin tümör hücresi monokatmanı üzerindeki yatay radyal migrasyonunu incelemek için hücre çöktürme manifolduyla nasıl çalışılacağı konusunda kapsamlı bilgi sahibi olacaksınız.