Tasarım, Tedavi, Hücresel Kaplama ve Fonksiyonel Inter-bağlantılı Devreler oluşan Modüler Nöronal Ağları Kültüre Yüzey

Bu yazıda mekansal sınırlandırılmış işlevsel birbirine bağlı nöronal devrelerin oluşturduğu nitro modüler ağlarda büyümek için bir protokol açıklamaktadır. Bir polimerik maske kültürleme alt-tabaka üzerine hücresel yapışmayı teşvik etmek için model bir protein tabakası kullanılır. Kaplama nöronlar kaplı alanlarda kendiliğinden bağlantılarının kurulması ve elektrofizyolojik aktivite sergileyen üzerinde büyür.

Bu prosedürün genel amacı, mekansal olarak sınırlı, işlevsel, birbirine bağlı nöronal devrelerden oluşan in vitro modüler ağları büyütmektir. Bu, ilk olarak, kültür substratı üzerinde hücresel yapışmayı teşvik etmek için bir protein tabakasını modellemek üzere PDMS şablonlarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, kültür substratlarını temizlemektir.

Özellikle Petri kaplarının, lamellerin ve çoklu elektrot dizilerinin yüzeyleri. Daha sonra, PDMS şablonları kültür substratı üzerinde biriktirilir ve istenen yapışkan protein tabakası desenleri oluşturulur. Son adım, nöronal glial hücrelerin kaplanmasıdır.

Sonuç olarak, elde edilen modüler nöronal ağların dinamiklerini göstermek için çoklu elektrot dizisi kayıtları ve kalsiyum görüntüleme kullanılır. Bu yöntem, nöronal düzenekler arasındaki iletişim dinamiklerini araştırmak gibi sinirbilim alanındaki temel açık soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir ve deneysel koşullara karşı koyacaktır. Polimetil soran veya PDMS, önce bir kısım kürleme maddesinin 10 kısım baz ajan ile karıştırılmasıyla yapılır.

Beş dakika karıştırdıktan sonra, karışımı 15 dakika boyunca bir vakum odasına taşıyın. 15 dakika sonra, kabarcıkları kontrol edin ve çözeltiyi 15 dakika daha hazneye geri koyun. Ardından, döndürme kodlayıcıda bir gofret hazırlayın.

Nitrojen gazı için gaz düğmelerini açın. Döndürücünün üzerine bir gofret koyun ve vakumla yerine sabitleyin. Ardından gofretin üzerine ince bir tabaka PDMS dökün.

Gofret üzerinde 100 mikron kalınlığında bir PDMS kaplaması yapmak için gofreti PDMS ile 1000 RPM'de bir dakika döndürün. Ardından gofreti 100 santigrat derecede sıcak bir plakaya aktarın. Orada 30 dakika pişmesine izin verin.

PDMS sertleştikten sonra, şablonların kenarlıklarını daha fazla PDMS ile çizmek için bir pipet kullanın. Ardından eklenen PDMS'yi gofret üzerine pişirin. Daha önce olduğu gibi, PDMS sınırları sertleştiğinde, RIN'leri başlatmak için şablonu kenarlıklar boyunca kesin, silikon şablonu gofretten çıkarın.

23 milimetre kare cam kapak, damıtılmış su, ardından %70 etanol, ardından aseton, ardından izopropanol ve son olarak damıtılmış su ile kayar. Yine, kareleri bir nitrojen gazı akışı altında kurutun. Ardından, her bir kapak fişine bir desen PDMS şablonunu hafifçe bastırın.

Kapak fişlerini şablonlarla birlikte 15 dakika boyunca bir vakum odasına koyun. Vakumlandıktan sonra, şablonların üzerine bir mililitre PDL damlatın ve düzenekleri 20 dakika boyunca vakum odasına geri koyun. 20 dakikalık vakum döngüsünü bir kez tekrarlayın ve ardından ertesi gün PDL'nin gece boyunca kurumasını bekleyin.

Ağ hücrelerini destekleyecek petri kaplarını hazırlayın. Birinci. 3,5 santimetre bulaşıkları iki saat boyunca bir mililitre PDL ile örtün. Daha sonra oda sıcaklığında, PDL'yi aspirasyon ile tabaktan çıkarın.

Daha sonra bulaşıkları damıtılmış suyla yıkayın ve kurumaya bırakın. Bir tabak kuruduktan sonra, kapak kaymasının dört köşesine göre tabağa küçük bir hacimde silikon yağ ekleyin. Kapak fişlerini PDMS yukarı bakacak şekilde tabağın üzerine yerleştirin ve takıldıklarından emin olmak için hafifçe aşağı bastırın.

Şimdi kapak fişlerinden A-P-D-M-S'yi nazikçe cımbızlayın ve PDL desenini bırakın. Son olarak, bulaşıkları yedi dakika boyunca UV'ye maruz bırakarak sterilize edin. İlk olarak, çoklu elektrot dizisini musluk suyu altında yıkayarak temizleyin ve ardından konsantre bir enzimatik deterjanla sonikleştirin.

Bu adımları üç kez tekrarlayın. Daha sonra MEA'yı saf damıtılmış suda üç kez sonikleştirin, ardından bir başlık altında. MEA'yı önce damıtılmış suyla yıkayın.

UV ışığı ile 30 dakika sterilize edin. Ardından, önce destekleyici ağı hazırlayın. PDMS'yi 12 veya 24 oyuklu bir plakaya dökün.

PDMS sertleştikten sonra bir iğne ile çıkarın. Şimdi kalıp desteği olarak çalışan halkalar yapmak için disklerin ortasında delikler açın. Şimdi MEA'nın ortasına bir kalıp desteği yerleştirin ve MEA'nın açıkta kalan dış yüzeyini kaplayın.

Bunun odada iki saat oturmasına izin verin. Ardından, MEA'nın açıkta kalan dış yüzeyi olan PDL yıkamasını damıtılmış su ile aspire edin ve MEA'nın kurumasına izin verilebilmesi için kalıp desteğini çıkarın. Şimdi ters çevrilmiş bir mikroskop altında hazırlanmış bir mikro manipülatöre bir şablon ekleyin.

Desenli yapıyı MEA'nın elektrotlarına uyacak şekilde inceleyin ve hizalayın. Ardından şablonu MEA yüzeyine indirmek için mikro manipülatörü kullanın. Takıldıktan sonra, mikrom manipülatörünü kaldırın ve gerekirse, PDMS'nin ayrılmasını önlemek için az miktarda basınç uygulamak için cımbız kullanın.

Şimdi MEA'yı 15 dakika boyunca vakum odasına aktarın. Daha sonra şablona bir mililitrelik bir damla PDL uygulayın ve 20 dakikalık iki döngü için vakum odasına geri dönün. Ertesi gün PDL'yi gece boyunca kurumaya bırakın.

P DM S şablonlarını cımbız kullanarak ölçümlerden çıkarın. Son olarak, ölçümleri yedi dakika boyunca UV ile sterilize edin. Daha sonra hazırlık kültür hücrelerindeki hücreler için hazırdırlar ve metin protokolünde olduğu gibi süspansiyonlar hazırlarlar.

Resus, gerekli sayıda hücreyi askıya aldıktan sonra, bunları MEA veya kapak kaymasındaki desenli alanın ortasına yerleştirin. Bir MEA, 100 mikrolitrelik hacimler ve bir kapak fişi ile yüklenmelidir. 1000 mikrolitre barındırır.

Plaka hücrelerini 40 dakika inkübe edin, ardından hücreleri her dört günde bir korumak için kaplama ortamı ekleyin. Taze takviye edilmiş büyüme ortamını geri ekleyin. Altıncı veya yedinci günlerden sonra, modüller arasındaki nöronal bağlantılar bu noktada oluşmaya başlamalıdır.

Glial aşırı büyümeyi önlemek için kültür ortamını bir anti-mitotik ajan ile seyreltin. Dört gün in vitro olarak, 14 gün sonra PD DL kodlu 600 mikron karelik noktalar içine bağlanan nöronların oluştuğunu gözlemlemek mümkündür. Kültürde nöron, modüller içinde ve modüller arasında kendiliğinden bağlantı kurarak aktif fonksiyonel ağlar oluşturur.

300 mikron karelik nöronal devreler, aynı kaplama konsantrasyonunu korurken PDMS özellik boyutuna sahip olarak gözlendi. Kalsiyum görüntüleme, kültürlenmiş ağlarda geniş bir aktivite sağlamak için bir Forex hedefi kullanılarak gerçekleştirildi. Yeşil ve pembe modüller arasında daha fazla sayıda bağlantı görülürken, mavi ve kırmızı modüller diğer modüllere daha az bağlıdır.

1 milyon piksellik bir görüntü ile 30 hertz'de elde edilen bir film için kalsiyum olaylarının başlangıçlarının bir liste grafiği gösterilir. Yeşil ve pembe modüller yüksek oranda senkronize edilirken, mavi ve kırmızı modüller daha azdı. Böylece, üç farklı devreden oluşan kortikal modüler bir ağ, in vitro olarak 21 günde kaydedildi.

Bir MEA kullanarak, yaklaşık 600 mikron aralıklı nöronal devrelerin birbirine bağlı olduğu bulundu. Elektrofizyolojik aktiviteleri yeniden yapılandırıldı. Kesin bir zamanlama ani artış algılama algoritması kullanılarak, renk kodlu küme verileriyle bu verilerin beş dakikalık bir liste grafiği yapıldı.

Bu, tüm ağ ve tek küme etkinliği karşılaştırması sağlar ve küme içi senkronizasyon hakkında bilgi verir. Bu videoyu izledikten sonra, PDM şablonlarının nasıl hazırlanacağını ve bunları fonksiyonel modal ağın kurulmasına yol açan nöroglial hücrelerin yapışmasını modellemek için nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız.