Tasarım, Tedavi, Hücresel Kaplama ve Fonksiyonel Inter-bağlantılı Devreler oluşan Modüler Nöronal Ağları Kültüre Yüzey
15 Nisan 2015
Bu yazıda mekansal sınırlandırılmış işlevsel birbirine bağlı nöronal devrelerin oluşturduğu nitro modüler ağlarda büyümek için bir protokol açıklamaktadır. Bir polimerik maske kültürleme alt-tabaka üzerine hücresel yapışmayı teşvik etmek için model bir protein tabakası kullanılır. Kaplama nöronlar kaplı alanlarda kendiliğinden bağlantılarının kurulması ve elektrofizyolojik aktivite sergileyen üzerinde büyür.
Bu prosedürün genel amacı, mekansal olarak sınırlı, işlevsel, birbirine bağlı nöronal devrelerden oluşan in vitro modüler ağları büyütmektir. Bu, ilk olarak, kültür substratı üzerinde hücresel yapışmayı teşvik etmek için bir protein tabakasını modellemek üzere PDMS şablonlarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, kültür substratlarını temizlemektir.
Özellikle Petri kaplarının, lamellerin ve çoklu elektrot dizilerinin yüzeyleri. Daha sonra, PDMS şablonları kültür substratı üzerinde biriktirilir ve istenen yapışkan protein tabakası desenleri oluşturulur. Son adım, nöronal glial hücrelerin kaplanmasıdır.
Sonuç olarak, elde edilen modüler nöronal ağların dinamiklerini göstermek için çoklu elektrot dizisi kayıtları ve kalsiyum görüntüleme kullanılır. Bu yöntem, nöronal düzenekler arasındaki iletişim dinamiklerini araştırmak gibi sinirbilim alanındaki temel açık soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir ve deneysel koşullara karşı koyacaktır. Polimetil soran veya PDMS, önce bir kısım kürleme maddesinin 10 kısım baz ajan ile karıştırılmasıyla yapılır.
Beş dakika karıştırdıktan sonra, karışımı 15 dakika boyunca bir vakum odasına taşıyın. 15 dakika sonra, kabarcıkları kontrol edin ve çözeltiyi 15 dakika daha hazneye geri koyun. Ardından, döndürme kodlayıcıda bir gofret hazırlayın.
Nitrojen gazı için gaz düğmelerini açın. Döndürücünün üzerine bir gofret koyun ve vakumla yerine sabitleyin. Ardından gofretin üzerine ince bir tabaka PDMS dökün.
Gofret üzerinde 100 mikron kalınlığında bir PDMS kaplaması yapmak için gofreti PDMS ile 1000 RPM'de bir dakika döndürün. Ardından gofreti 100 santigrat derecede sıcak bir plakaya aktarın. Orada 30 dakika pişmesine izin verin.
PDMS sertleştikten sonra, şablonların kenarlıklarını daha fazla PDMS ile çizmek için bir pipet kullanın. Ardından eklenen PDMS'yi gofret üzerine pişirin. Daha önce olduğu gibi, PDMS sınırları sertleştiğinde, RIN'leri başlatmak için şablonu kenarlıklar boyunca kesin, silikon şablonu gofretten çıkarın.
23 milimetre kare cam kapak, damıtılmış su, ardından %70 etanol, ardından aseton, ardından izopropanol ve son olarak damıtılmış su ile kayar. Yine, kareleri bir nitrojen gazı akışı altında kurutun. Ardından, her bir kapak fişine bir desen PDMS şablonunu hafifçe bastırın.
Kapak fişlerini şablonlarla birlikte 15 dakika boyunca bir vakum odasına koyun. Vakumlandıktan sonra, şablonların üzerine bir mililitre PDL damlatın ve düzenekleri 20 dakika boyunca vakum odasına geri koyun. 20 dakikalık vakum döngüsünü bir kez tekrarlayın ve ardından ertesi gün PDL'nin gece boyunca kurumasını bekleyin.
Ağ hücrelerini destekleyecek petri kaplarını hazırlayın. Birinci. 3,5 santimetre bulaşıkları iki saat boyunca bir mililitre PDL ile örtün. Daha sonra oda sıcaklığında, PDL'yi aspirasyon ile tabaktan çıkarın.
Daha sonra bulaşıkları damıtılmış suyla yıkayın ve kurumaya bırakın. Bir tabak kuruduktan sonra, kapak kaymasının dört köşesine göre tabağa küçük bir hacimde silikon yağ ekleyin. Kapak fişlerini PDMS yukarı bakacak şekilde tabağın üzerine yerleştirin ve takıldıklarından emin olmak için hafifçe aşağı bastırın.
Şimdi kapak fişlerinden A-P-D-M-S'yi nazikçe cımbızlayın ve PDL desenini bırakın. Son olarak, bulaşıkları yedi dakika boyunca UV'ye maruz bırakarak sterilize edin. İlk olarak, çoklu elektrot dizisini musluk suyu altında yıkayarak temizleyin ve ardından konsantre bir enzimatik deterjanla sonikleştirin.
Bu adımları üç kez tekrarlayın. Daha sonra MEA'yı saf damıtılmış suda üç kez sonikleştirin, ardından bir başlık altında. MEA'yı önce damıtılmış suyla yıkayın.
UV ışığı ile 30 dakika sterilize edin. Ardından, önce destekleyici ağı hazırlayın. PDMS'yi 12 veya 24 oyuklu bir plakaya dökün.
PDMS sertleştikten sonra bir iğne ile çıkarın. Şimdi kalıp desteği olarak çalışan halkalar yapmak için disklerin ortasında delikler açın. Şimdi MEA'nın ortasına bir kalıp desteği yerleştirin ve MEA'nın açıkta kalan dış yüzeyini kaplayın.
Bunun odada iki saat oturmasına izin verin. Ardından, MEA'nın açıkta kalan dış yüzeyi olan PDL yıkamasını damıtılmış su ile aspire edin ve MEA'nın kurumasına izin verilebilmesi için kalıp desteğini çıkarın. Şimdi ters çevrilmiş bir mikroskop altında hazırlanmış bir mikro manipülatöre bir şablon ekleyin.
Desenli yapıyı MEA'nın elektrotlarına uyacak şekilde inceleyin ve hizalayın. Ardından şablonu MEA yüzeyine indirmek için mikro manipülatörü kullanın. Takıldıktan sonra, mikrom manipülatörünü kaldırın ve gerekirse, PDMS'nin ayrılmasını önlemek için az miktarda basınç uygulamak için cımbız kullanın.
Şimdi MEA'yı 15 dakika boyunca vakum odasına aktarın. Daha sonra şablona bir mililitrelik bir damla PDL uygulayın ve 20 dakikalık iki döngü için vakum odasına geri dönün. Ertesi gün PDL'yi gece boyunca kurumaya bırakın.
P DM S şablonlarını cımbız kullanarak ölçümlerden çıkarın. Son olarak, ölçümleri yedi dakika boyunca UV ile sterilize edin. Daha sonra hazırlık kültür hücrelerindeki hücreler için hazırdırlar ve metin protokolünde olduğu gibi süspansiyonlar hazırlarlar.
Resus, gerekli sayıda hücreyi askıya aldıktan sonra, bunları MEA veya kapak kaymasındaki desenli alanın ortasına yerleştirin. Bir MEA, 100 mikrolitrelik hacimler ve bir kapak fişi ile yüklenmelidir. 1000 mikrolitre barındırır.
Plaka hücrelerini 40 dakika inkübe edin, ardından hücreleri her dört günde bir korumak için kaplama ortamı ekleyin. Taze takviye edilmiş büyüme ortamını geri ekleyin. Altıncı veya yedinci günlerden sonra, modüller arasındaki nöronal bağlantılar bu noktada oluşmaya başlamalıdır.
Glial aşırı büyümeyi önlemek için kültür ortamını bir anti-mitotik ajan ile seyreltin. Dört gün in vitro olarak, 14 gün sonra PD DL kodlu 600 mikron karelik noktalar içine bağlanan nöronların oluştuğunu gözlemlemek mümkündür. Kültürde nöron, modüller içinde ve modüller arasında kendiliğinden bağlantı kurarak aktif fonksiyonel ağlar oluşturur.
300 mikron karelik nöronal devreler, aynı kaplama konsantrasyonunu korurken PDMS özellik boyutuna sahip olarak gözlendi. Kalsiyum görüntüleme, kültürlenmiş ağlarda geniş bir aktivite sağlamak için bir Forex hedefi kullanılarak gerçekleştirildi. Yeşil ve pembe modüller arasında daha fazla sayıda bağlantı görülürken, mavi ve kırmızı modüller diğer modüllere daha az bağlıdır.
1 milyon piksellik bir görüntü ile 30 hertz'de elde edilen bir film için kalsiyum olaylarının başlangıçlarının bir liste grafiği gösterilir. Yeşil ve pembe modüller yüksek oranda senkronize edilirken, mavi ve kırmızı modüller daha azdı. Böylece, üç farklı devreden oluşan kortikal modüler bir ağ, in vitro olarak 21 günde kaydedildi.
Bir MEA kullanarak, yaklaşık 600 mikron aralıklı nöronal devrelerin birbirine bağlı olduğu bulundu. Elektrofizyolojik aktiviteleri yeniden yapılandırıldı. Kesin bir zamanlama ani artış algılama algoritması kullanılarak, renk kodlu küme verileriyle bu verilerin beş dakikalık bir liste grafiği yapıldı.
Bu, tüm ağ ve tek küme etkinliği karşılaştırması sağlar ve küme içi senkronizasyon hakkında bilgi verir. Bu videoyu izledikten sonra, PDM şablonlarının nasıl hazırlanacağını ve bunları fonksiyonel modal ağın kurulmasına yol açan nöroglial hücrelerin yapışmasını modellemek için nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, mekansal olarak sınırlandırılmış ve fonksiyonel olarak birbirine bağlı nöronal devrelerden oluşan in vitro modüler ağların büyütülmesine yönelik bir protokolü tanımlamaktadır. Bu işlem, kültür substratı üzerinde hücresel yapışmayı destekleyen bir protein tabakasını desenlemek için PDMS şablonlar hazırlanarak gerçekleştirilir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Elektrofizyoloji
Arka Plan
- İn vitro nöronal ağlar, nöronal bağlantıların incelenmesi için temel öneme sahiptir.
- Nöronal devrelerin uzaysal olarak sınırlandırılması, fonksiyonel karşılıklı bağlantısallığı artırabilir.
- Hücresel adezyon, başarılı nöronal büyüme için kritiktir.
- Hücre kültüründe desenleme yapmak için yaygın olarak PDMS şablonlar kullanılır.
Çalışmanın Amacı
- In vitro ortamda modüler nöronal ağlar oluşturmak için bir yöntem geliştirmek.
- Bu ağların elektrofizyolojik özelliklerini incelemek.
- Ekilen nöronlar arasında spontan bağlantılar kurmak.
Kullanılan Yöntemler
- Protein desenleme için PDMS şablonların hazırlanması.
- Petri kapları ve lamel gibi kültür altlıklarının temizlenmesi.
- Yapışkan desenler oluşturmak için PDMS şablonların altlığa yerleştirilmesi.
- Nöronal glial hücrelerin desenli altlığa ekilmesi.
Ana Sonuçlar
- Mekansal olarak sınırlanmış nöronal devrelerin başarıyla oluşturulması.
- Nöronlar arasında spontan bağlantıların gösterilmesi.
- Kültürlenen ağlarda gözlemlenen elektrofizyolojik aktivite.
- Nöronal bağlantı üzerine yapılacak gelecek çalışmalar için protokolün doğrulanması.
Sonuçlar
- Protokol, in vitro ortamda modüler nöronal ağları etkili bir şekilde oluşturur.
- Uzamsal sınırlama, fonksiyonel karşılıklı bağlantısallığı artırır.
- Bu yöntem, ileri elektrofizyolojik çalışmalar için kullanılabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Bu in vitro modüler nöronal ağ metodolojisi, nöronal toplulukların hassas uzamsal kontrolünü sağlayarak nörobilim ilaç keşfinde hedef doğrulamadaki mekanistik risklerin azaltılmasını destekler. Nicelikle belirlenebilir elektrofizyolojik ve kalsiyum görüntüleme çıktılarına sahip fonksiyonel olarak birbirine bağlı devreler kuran bu yaklaşım, nöronal bağlantı analizlerinde öngörülebilir bir güven sağlar. Bu yöntem, ilaç keşif aşamasındaki temel bir zorluğu ele alır: bileşiklerin ağ senkronizasyonu ve iletişimi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için beyin devresi dinamiklerinin modellenmesi.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Modüller arası senkronizasyonu düzenlemek amacıyla kompartımanlar arası mesafeyi modüle ederek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Spontan nöronal devre oluşumu ve fonksiyonel ağ kurulumu aracılığıyla hedef etkileşimini değerlendirmek için hastalığa özgü bir sistem sağlar.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Ağ aktivite dinamiklerini değerlendirmek için çok elektrotlu dizi kayıtları ve kalsiyum görüntüleme yoluyla kantitatif bağımlı değişken ölçümleri üretir.
- Operasyonel Değer: Tutarlı hücresel yapışma için tekrarlanabilir PDMS şablon desenleme ve protein tabakası biriktirme yoluyla analiz standardizasyonunu destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Bağlantı yoğunluğunu senkronizasyon oluşumuyla ilişkilendirerek translasyonel biyobelirteç uyumu sağlar ve risk ayarlı ilerleme kararlarına imkan tanır.
- Operasyonel Değer: in vitro ortamda 6-7 gün sonra oluşan nöronal bağlantıların gözlemlenmesine ve 14. güne kadar stabilizasyonuna izin vererek preklinik model sürekliliğini kolaylaştırır.
Hat ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, nöronal iletişim dinamiklerinin hipotez testlerini mümkün kılarak erken keşif iş akışlarına entegre olur ve elde edilen çıktılar, ağ aktivitesi profillemesi aracılığıyla doğrudan öncü bileşik tanımlama sürecini bilgilendirir.
- Keşif Biyolojisi: Modüler ağlarda bağlantı yoğunluğunun modüller arası senkronizasyonu nasıl düzenlediğinin kontrollü şekilde araştırılmasına olanak tanıyarak yolakların açıklığa kavuşturulmasını destekler.
- Tarama: PDL desenli bölgelere tekrarlanabilir nöronal tutunma sağlayan standartlaştırılmış yüzey işlemi ve hücresel ekim protokolleri aracılığıyla analiz hazırlığı sunar.
- Analitik: Farklı deneysel koşullar altında küme içi ve kümeler arası senkronizasyonun nicel karşılaştırmasına imkan veren elektrofizyolojik spike tespiti ve kalsiyum olay başlangıcı ölçümleri sağlar.
- Translasyonel Araştırma: in vivo devre iletişim ilkelerini yansıtan spontan fonksiyonel ağ oluşumunu göstererek preklinik doğrulamaya bağlanır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Tekrarlanan tarama kampanyalarını ve hedef doğrulama çalışmalarını desteklemek amacıyla, farklı alt tabakalar (lameller, MEA'lar) üzerinde nöronal ağların desenlenmesi için yeniden kullanılabilir bir kapasite oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Yapısal topolojinin fonksiyonel bağlantısallığı nasıl etkilediğini incelemek için kontrol edilebilir bir sistem sağlayarak nöronal hedef doğrulamadaki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Deneyler genelinde tutarlı yüzey hazırlığı sağlayan vakum destekli PDL kaplama ve UV sterilizasyon adımlarıyla tekrarlanabilirliği artırır.
- Stratejik Değer: Bileşiklerin ağ senkronizasyonu üzerindeki doz-yanıt testlerini mümkün kılarak, MSS ilaç geliştirme sürecindeki geç aşama biyolojik risklerini azaltır ve karar verme süreçlerini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Nöronal hedeflerin mekanistik risklerinin azaltılmasına ışık tutan bağlantıya bağlı senkronizasyon eşiklerini nicelleştirerek, riske göre ayarlanmış önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Mikroakışkan şablon üretimi, nöronal hücre kültürü ve elektrofizyolojik/optik kayıt tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Spin kaplama ekipmanına, vakum odalarına, UV sterilizatörlere, çok elektrotlu dizilere (MEA) ve kalsiyum görüntüleme sistemlerine erişime bağlıdır.
- Laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliği sağlamak için şablon tasarımı, protein kaplama protokolleri ve ekim yoğunluklarının ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Ağ stabilitesini korumak ve aşırı büyümeyi önlemek için farklı nöronal alt tipler veya glial ko-kültür oranlarına yönelik adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Şablonun MEA elektrotlarıyla hassas şekilde hizalanması gerekliliği ve devre boyutlarını (örneğin, 300 mikron kare modüller) belirlemede PDMS özellik boyutuna olan bağımlılık gibi pratik sınırlamaları kapsar.
