Sinir Sistemi Yeniden Yapılanma, Modülasyon ve Modelleme için Anatomik olarak İlham Almış Üç Boyutlu Mikro-Dokulu Mühendisli Sinir Ağları

Bu protokol, tübüler bir hidrojelin lümeni içerisinde ayrık nöronal popülasyonları birbirine bağlayan uzun, hizalanmış aksonal yollardan oluşan minyatür üç boyutlu yapılar olan mikro-doku mühendisliği ürünü nöral ağların veya micro-TENN'lerin fabrikasyonunu tanımlamaktadır. Micro-TENN'ler, beyin konnektomunun genel sistem düzeyindeki anatomisini, özellikle de uzun aksonal yollarla birbirine bağlanmış fonksiyonel olarak benzer nöron gruplarını taklit eder. Beyin yollarının sitomimarisini benzetmek için önceden büyütüldüklerinden, micro-TENN'ler travma veya nörodejeneratif hastalıklar nedeniyle kaybedilen nöral devrelerin hedeflenmiş yeniden inşasında ve nörobiyolojik çalışmalar için biyofidelyik modeller olarak uygulanabilir.

Bu protokolün en zorlayıcı yönlerinden biri, beyne minimal invaziv bir iletim sağlamak için nihayetinde gerekli olan mikron ölçekli form faktörü ile çalışmaktır. İlk olarak, cam kapiler tüpleri manuel olarak 2 ila 2,5 santimetrelik parçalara ayırın ve her bir parçanın içine bir akupunktur iğnesi yerleştirin. DPBS içinde yüzde üç oranında agarozu, boş bir petri kabının yüzeyine bir mililitre olacak şekilde aktarın.

Kılcal tüpü yerleştirilen iğne ile tutarak, tüpün bir ucunu kılcal etkiyle dolması için sıvı agaroz havuzuna temas ettirin. Sıvının yükselmesi durduğunda, kılcal tüpü havuzdan çıkarın ve bir petri kabının yüzeyine yatay olarak yerleştirin. Ardından, başparmak ve işaret parmağınızı tüpün her iki yanına yerleştirin ve sıkıca kavrayın.

Başparmak ve işaret parmağı mikro-kolonun tüpten kayıp çıkmasını engellerken, diğer elinizi kullanarak iğneyi hızla dışarı çekin. Ardından, mikro-kolonu yavaşça DPBS içeren bir kaba itmek için kapiler tüpe 30 gauge bir iğne yerleştirin. İnce bir pens yardımıyla bir mikro-kolonu dikkatlice DPBS'den boş bir kaba aktarın.

Kurumasını önlemek için bir mikropipet yardımıyla mikro sütunun üst kısmına 10 µL DPBS ekleyin. Stereomikroskop altında çalışırken, mikro sütunu istenen uzunluğa getirmek için bir mikro bisturi ile kesin. Ardından, düzeltilmiş mikro sütunu DBPS içeren farklı bir petri kabına aktarmak için ince pensler kullanın.

DPBS içeren petri kaplarındaki mikro sütunları ultraviyole ışık altında 30 dakika boyunca sterilize edin. 10 cm'lik bir petri kabının kapağına, bir matkap ucu kullanarak 1 cm ara ile 4x4 diziliminde 4 cm'lik bir alana 16 delik açın. Kimyasal çeker ocak içerisinde, bir petri kabının alt kısmını kullanarak 27 g PDMS ve 3 g kürleme maddesi tartın.

Ajanın eşit şekilde dağılması için bir mikro spatula ile karıştırın. Ardından PDMS kürleme ajanının üzerini delikli kapakla kapatın. Bir hortumun bir ucunu çeker ocak vakum portuna bağlayın ve diğer ucunu uygun boyutlu bir huninin sapına yerleştirin.

1 mL'lik bir pipet ucuna 1 mL'lik bir pipet pompası yerleştirip hortuma takın ve pompa, huni sapındaki hortumu sızdırmaz hale getirene kadar hortumu yukarı doğru çekin. Ardından, huniyi delinmiş kapak üzerine yerleştirin ve hortumu mevcut sağlam bir destekle sabitleyin. Hava kabarcıklarını yüzeye çıkarmak ve vakumlamak için vakum valfini beş dakika boyunca açık tutun.

Beş dakika sonra valfi kapatın, huniyi çıkarın ve kalan hava kabarcıklarını patlatmak için petri kabını çeker ocak yüzeyine birkaç kez hafifçe vurun. 12 kuyucuklu bir kültür plağının her bir kuyucuğuna, piramitleri yukarı bakacak şekilde piramidal kuyucuklu 3B yazıcıyla basılmış kalıplar yerleştirin. Ardından, plağın her bir kuyucuğu dolana kadar kalıpların üzerine PDMS kürleme ajanını dökün.

Kapağı kapatılmış plakayı kurutmak için 60 °C sıcaklıktaki bir fırında bir saat bekletin. PDMS dizilerini otoklavda sterilize ettikten sonra, bir biyogüvenlik kabininde çalışarak, steril bir 12 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna bir mikro-kuyucuk dizisi yerleştirin. Nöronal agregatlar oluşturmak için, bir mikropipet kullanarak PDMS dizisinin her bir mikro-kuyucuğuna 12 µL hücre süspansiyonu ekleyin.

Hücrelerin mikro kuyucukların tabanında toplanmasını sağlamak için plakayı 200 ×g kuvvetinde beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, ekilen tüm mikro kuyucukları kaplamak için her bir PDMS dizisinin üzerine dikkatlice yaklaşık iki mililitre kültür ortamı ekleyin. Plağı 37 °C'de ve %5 karbondioksit ortamında 12 ila 24 saat boyunca inkübe edin.

CEM çekirdek fabrikasyonuna başlamak için Tip 1 kolajen, laminin ve kültür ortamını bir mikro santrifüj tüpünde karıştırın ve pH değerini 7,2 ile 7,4 arasına ayarlayın. Ardından CEM içeren tüpü buz üzerine yerleştirin. Mikro kolonları boş 35 veya 60 milimetrelik petri kaplarına aktarmak için steril pens kullanın.

Ardından, bir stereomikroskop altında çalışırken, lümendeki kalıntı DPBS ve hava kabarcıklarını çıkarmak için 1000-µL'lik bir uca takılmış 10-µL'lik bir uç kullanın. Bir mikropipetle hızlıca 4-5 µL CEM çekin, ardından mikropipetin ucunu bir mikro-kolonun bir ucuna yerleştirin ve lümeni dolduracak kadar CEM boşaltın. Dehidrasyonu önlemek için, her mikro-kolonun etrafına 2 µL CEM ekleyin.

Hidrojel CEM mikro sütunlarını, petri kaplarında 37 °C'de %5 karbondioksit içeren ortamda 15 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun hemen ardından hücre ekimine geçin. Mikro sütunların bulunduğu petri kaplarındaki iki boş alana yaklaşık 10 ila 20 µL kültür medyumu aktarın.

Nöronal agregatları tek tek toplamak için bir mikro-pipet kullanın ve bunları konstrüktları içeren petri kabına aktarın. Hücre sağlığını korumak için agregatları pensle kültür ortamının küçük havuzlarından birine taşıyın. Bir stereomikroskop altında gözlem yaparken, tek yönlü mikro-TENN'ler için bir agregatı mikro-kolonların bir ucuna, çift yönlü mimari için ise her iki ucuna yerleştirmek üzere pens kullanın.

Ardından, dehidratasyonu önlemek ve agregat sağlığını korumak için ekim yapılmış mikro-kolonu diğer küçük kültür ortamı havuzuna taşıyın. Tüm mikro-kolonlar yüklendiğinde, agregatların CEM'e tutunmasını sağlamak için 37 °C'de %5 karbondioksit içeren ortamda 45 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası, stereomikroskop kullanarak agregatların mikro-kolonların uçlarında kaldığını doğrulayın.

Son olarak, micro-TENN'leri içeren petri kaplarını bir pipet yardımıyla kültür medyumu ile dikkatlice doldurun. Kapları, uzun süreli kültür için 37 °C sıcaklıkta ve %5 karbondioksit içeren bir inkübatöre yerleştirin. Bu faz kontrast görüntüleri, in-vitro ortamda sekiz güne kadar olan tek yönlü 2 mm uzunluğundaki micro-TENN'leri göstermektedir.

Bu görüntülerde, hizalanmış aksonal yollar lümen boyunca uzanırken, mikro-kolonun uç kısımlarındaki nöronal agregatlara dikkat edin. Burada görüldüğü gibi, aksonal yollar in-vitro beşinci güne kadar mikro-kolonun neredeyse tüm uzunluğuna yayılır. 5 milimetrelik çift yönlü mikro-TENN'lerde, aksonal yollar in-vitro 5. günde mikro-kolonun uzunluğunu doldurur ve bu mimari in-vitro en az 10. güne kadar korunur.

Aşağıdaki iki görüntü, prosedürle ilgili sorunların giderilmesine yardımcı olabilir. Bu görüntü, üretim sırasında DPBS, CEM veya kültür ortamının tamamen uzaklaştırılması ve/veya buharlaşması sonucunda tamamen susuz kalmış kurutulmuş bir hidrojel mikro-kolonu göstermektedir. Bu görüntü, akupunktur iğnesinin kapiler tüp ile eş merkezli hizalanmaması nedeniyle, lümenin dış duvar boyunca sıralandığı bir mikro-kolonu göstermektedir.

Son olarak, bu konfokal görüntü, in-vitro'da 28. gündeki çift yönlü bir mikro-TENN'i göstermektedir; hücre çekirdekleri mavi renkte Hoechst ile, aksonlar kırmızı renkte tudge one ile ve presinaptik butonlar yeşil renkte synapsin 1 ile boyanmıştır. Önerildiği üzere, presinaptik terminallerin varlığında, agregatlardan aksonal yollar boyunca hücre göçü görülmektedir. Mikro-TENN'ler, konnektom sitomimarisinin temel yönlerini taklit eden, anatomiden esinlenilmiş, bağımsız yapılardır; bu nedenle mikro-TENN'ler, beyne implantasyon sonrası kaybolan nöral yolların yerine konması için bir araç sağlayabilir.

Bu yöntemin kritik bileşenleri arasında, boylamsal aksonal büyümeye izin veren tübüler biyomalzeme kaplama şeması ve hücre gövdelerinin iç kısımdaki aksonal yolların uçlarıyla sınırlandırıldığı uygun sitomimarinin elde edilmesini sağlayan agregat yöntemi yer almaktadır. Bu yöntemlerde uzmanlaşıldıktan sonra, tekniğin prensipleri, spesifik uygulamaya bağlı olarak diğer hücre fenotipleri ve biyomalzeme bileşenleri ile mikro-TENN'ler oluşturmak için uygulanabilir.