Sinir Sistemi Yeniden Yapılanma, Modülasyon ve Modelleme için Anatomik olarak İlham Almış Üç Boyutlu Mikro-Dokulu Mühendisli Sinir Ağları

Bu protokol, tübüler bir hidrojelin lümeni içinde ayrı nöronal popülasyonları kapsayan uzun hizalanmış aksonal yollardan oluşan minyatür üç boyutlu yapılar olan mikro doku mühendisliği yapılmış sinir ağlarının veya mikro-TENN'lerin üretimini tanımlar. Mikro-TENN'ler, beyin konektomunun genel sistem düzeyindeki anatomisini, özellikle de uzun aksonal yollarla bağlanan işlevsel olarak benzer nöron gruplarını kopyalar. Beyin yollarının sitomimarisini taklit etmek için önceden yetiştirildikleri için, mikro-TENN'ler travma veya nörodejeneratif hastalık nedeniyle kaybedilen nöral devrelerin hedefli rekonstrüksiyonu için ve nörobiyolojik çalışmalar için biyofidik modeller olarak uygulanabilir.

Bu protokolün en zorlu yönlerinden biri, beyne minimal invaziv bir doğuma izin vermek için nihayetinde gerekli olan mikron ölçekli form faktörü ile çalışmaktır. Cam kılcal tüpleri manuel olarak 2 ila 2,5 santimetrelik parçalara ayırarak başlayın ve her parçaya bir akupunktur iğnesi yerleştirin. DPBS'de bir mililitre yüzde üç agarozu boş bir petri kabının yüzeyine aktarın.

Kılcal boruyu sokulan iğnede tutarak, kılcal hareketle doldurmak için tüpün bir ucunu sıvı agaroz havuzuna temas edecek şekilde yerleştirin. Sıvının yükselmesi durduğunda, kılcal boruyu havuzdan çıkarın ve bir petri kabının yüzeyine yatay olarak yerleştirin. Ardından, başparmağınızı ve işaret parmağınızı tüpün her iki tarafına yerleştirin ve sıkıca kavrayın.

Başparmak ve işaret parmağı mikro sütunun kendisinin tüpten dışarı kaymasını önlerken iğneyi hızlı bir şekilde dışarı çekmek için diğer elinizi kullanın. Ardından, mikro sütunu DPBS içeren bir tabağa yavaşça itmek için kılcal boruya 30 gauge bir iğne sokun. İnce forseps kullanarak bir mikro sütunu DPBS'den boş bir tabağa dikkatlice aktarın.

Kurumayı önlemek için mikropipetli bir mikrokolonun üstüne 10 mikrolitre DPBS ekleyin. Stereomikroskop altında çalışırken, mikro sütunu istenen uzunlukta kısaltmak için bir mikro neşter ile açın. Ardından, kesilmiş mikro sütunu DBPS içeren farklı bir petri kabına aktarmak için ince forseps kullanın.

DPBS içeren petri kaplarındaki mikro sütunları ultraviyole ışık altında 30 dakika sterilize edin. 10 santimetrelik bir petri kabının kapağına 1 santimetrelik bir ayırma ile 4 santimetre 4'e 4 dizi olarak 16 delik açmak için bir matkap ucu kullanın. Kimyasal bir davlumbazın içinde, 27 gram PDMS ve üç gram kürleme maddesi ağırlığında bir petri kabının alt parçasını kullanın.

Ajanı eşit şekilde dağıtmak için bir mikro spatula ile karıştırın. Ardından PDMS kürleme maddesini delinmiş kapakla örtün. Bir hortumun bir ucunu çeker ocakın vakum portuna bağlayın ve diğer ucunu uygun boyutta bir huninin gövdesine yerleştirin.

Hortumun içine 1 mililitrelik bir uca 1 mililitrelik bir pipet ampulü yerleştirin ve ampul hortumu huninin gövdesine sızdırmaz hale getirene kadar hortumu yukarı doğru çekin. Ardından, huniyi delinmiş çanak kapağına yerleştirin ve hortumu mevcut sağlam bir destekle sabitleyin. Emme ve hava kabarcıklarını yüzeye çıkarmak için vakum valfini beş dakika açın.

Beş dakika sonra valfi kapatın, huniyi çıkarın ve kalan hava kabarcıklarını patlatmak için petri kabını çeker ocakın yüzeyine birkaç kez vurun. Piramitler yukarı bakacak şekilde 12 oyuklu bir kültür plakasındaki kuyucukların her birine piramidal bir kuyu 3D baskılı kalıp yerleştirin. Ardından, PDMS kürleme maddesini, plakanın her bir oyuğu dolana kadar kalıpların üzerine dökün.

Kapalı plakayı kuruması için 60 santigrat derecede bir saat fırına aktarın. PDMS dizilerini otoklavlama ile sterilize ettikten ve bir biyogüvenlik kabininde çalıştıktan sonra, steril 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bir mikro kuyu dizisi yerleştirin. Nöronal agregaları oluşturmak için, PDMS dizisinin her bir mikro kuyucuğuna 12 mikrolitre hücre süspansiyonu eklemek için bir mikropipet kullanın.

Mikro kuyucukların dibindeki hücrelerin toplanmasını zorlamak için plakayı beş dakika boyunca 200 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra, tüm tohumlanmış mikro kuyuları kaplamak için her bir PDMS dizisinin üstüne dikkatlice yaklaşık iki mililitre kültür ortamı ekleyin. Plakayı% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede 12 ila 24 saat inkübe edin.

CEM çekirdek üretimine başlamak için, Tip 1 kollajen, laminin ve kültür ortamını bir mikro santrifüj tüpünde karıştırın ve pH'ı 7,2 ila 7,4'e ayarlayın. Daha sonra CEM içeren tüpü buzun üzerine yerleştirin. Mikro sütunları boş 35 veya 60 milimetrelik petri kaplarına aktarmak için steril forseps kullanın.

Ardından, stereomikroskop altında çalışırken, lümenden kalan DPBS'yi ve hava kabarcıklarını çıkarmak için 1000 mikrolitrelik bir uca bağlı 10 mikrolitrelik bir uç kullanın. Mikropipetlenmiş bir mikropipete hızlı bir şekilde dört ila beş mikrolitre CEM çekin, ardından mikropipetlenmiş ucu bir mikro sütunun bir ucuna yerleştirin ve lümeni doldurmaya yetecek kadar CEM'i boşaltın. Dehidrasyonu önlemek için, her mikro sütunun etrafına iki mikrolitre CEM ekleyin.

Hidrojel CEM mikro sütunlarını petri kaplarında 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içinde 15 dakika inkübe edin. İnkübasyondan hemen sonra hücre tohumlamaya devam edin. Yaklaşık 10 ila 20 mikrolitre kültür ortamını, mikro sütunları tutan petri kaplarındaki iki boş alana aktarın.

Nöronal agregatları ayrı ayrı toplamak için bir mikropipet kullanın ve bunları yapıları içeren petri kabına aktarın. Hücre sağlığını korumak için agregaları forseps ile küçük kültür ortamı havuzlarından birine taşıyın. Stereomikroskop altında gözlem yaparken, tek yönlü mikro TENN'ler için mikro sütunların bir ucuna veya çift yönlü mimari için her iki uca bir agrega yerleştirmek için forseps kullanın.

Daha sonra, dehidrasyonu önlemek ve agrega sağlığını korumak için tohumlanmış mikro sütunu diğer küçük kültür ortamı havuzuna taşıyın. Tüm mikro kolonlar yüklendiğinde, agregaların CEM'e yapışmasını sağlamak için 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içinde 45 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, stereomikroskop kullanarak agregaların mikro sütunların uçlarında kaldığını doğrulayın.

Son olarak, mikro-TENN'leri içeren petri kaplarını bir pipet kullanarak kültür ortamı ile dikkatlice doldurun. Bulaşıkları uzun süreli kültür için% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Bu faz kontrast görüntüleri, in vitro olarak sekiz güne kadar tek yönlü 2 mililitre uzunluğunda mikro-TENN'leri gösterir.

Bu görüntülerde, hizalanmış aksonal yollar lümen boyunca çıkıntı yaparken, mikro kolonun uç noktalarındaki nöronal agregalara dikkat edin. Burada görüldüğü gibi, aksonal traktlar mikro kolonun neredeyse tüm uzunluğunu in vitro olarak beş gün uzatır. 5 milimetre çift yönlü mikro-TENN'ler için, aksonal yollar mikro kolonun uzunluğunu in vitro olarak 5 günde doldurur ve bu mimari en az 10 gün in vitro olarak korunur.

Aşağıdaki iki görüntü, yordamla ilgili sorunları gidermeye yardımcı olabilir. Bu resim, imalat sırasında DPBS, CEM veya kültür ortamının tamamen çıkarılması ve/veya buharlaşmasının bir sonucu olarak tamamen susuz kalmış bir kurutulmuş hidrojel mikro kolonu göstermektedir. Bu görüntü, akupunktur iğnesinin kılcal boru ile eşmerkezli hizalanmaması nedeniyle dış duvarı kaplayan lümenli bir mikro sütunu göstermektedir.

Son olarak, bu konfokal görüntü, 28 gün içinde in vitro, Hoechst ile mavi renkte hücre çekirdekleri için boyanmış ve kırmızı renkte tudge one ile etiketlenmiş aksonlar ve yeşil renkte sinapsin 1 ile etiketlenmiş pre-sinaptik butonlar ile çift yönlü bir mikro-TENN'yi göstermektedir. Aksonal yollar boyunca agregalardan hücre göçü, önerildiği gibi pre-sinaptik terminallerin varlığında görülür. Mikro-TENN'ler, konektom sitomimarisinin temel yönlerini taklit eden, bağımsız, anatomik olarak ilham alan yapılardır; bu nedenle, mikro-TENN'ler beyne implantasyon üzerine kaybedilen nöral yolların yerini almak için bir araç sağlayabilir.

Bu yöntemin önemli bileşenleri arasında, uzunlamasına aksonal büyümeye izin veren boru şeklindeki biyomateryal kaplama şeması ve iç kısım boyunca aksonal yolların uçlarıyla sınırlı hücre gövdelerinin uygun sitomimarisinin elde edilmesini sağlayan agrega yöntemi yer alır. Bu yöntemlere hakim olduktan sonra, bu tekniğin ilkeleri, spesifik uygulamaya göre diğer hücre fenotipleri ve biyomateryal bileşenleri ile mikro-TENN'ler oluşturmak için uygulanabilir.