Embriyonik Fare Heart Immunofluorescence kullanarak kardiyomiyosit Geliştirme Analizi

Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan embriyonik fare kalbinde miyokiyal ve kardiyomiyosit olgunlaşmasını değerlendirmektir. Bu, önce embriyonik kalbin kesme ortamında yönlendirilmesi ve dondurulmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, kalp uygun yönde kriyo kesitine alınır.

Daha sonra kalp bölümleri, ilgilenilen proteinlerin immünofloresan etiketlemesine tabi tutulur. Son olarak, immün lekeli kalp kesitlerinin konfokal mikroskobu gerçekleştirilir. Sonuç olarak, MyFi ve diğer kardiyomiyosit yapılarının gelişimini göstermek için iki boyutlu ve üç boyutlu görüntü analizleri kullanılır.

Bu yöntem, mutasyonların ve kardiyak genlerin MyFi montajını nasıl etkilediği ve entere edilmiş diskler ve müşteriler gibi belirli yapıların ortaya çıkması gibi kardiyak gelişim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Embriyonik kalpleri yakalamak, dondurmak için, kimyasal bir başlıkta 3,5 santimetrelik bir Petri kabını doldurmak için en uygun kesme sıcaklığını veya OCT ortamını kullanın. Serin. Sıvı azot içinde iki metil bütan.

Fare embriyonik kalplerini metin protokolüne göre izole ettikten sonra, kalpleri OCT'ye yerleştirin ve OCT içeren yedi milimetrelik bir kalıba aktarmadan önce birkaç saniye dengelenmelerine izin verin. Kalbin iç duvarını kalıbın dibine yönlendirin. Kalıbı yavaşça sıvı nitrojen soğutmalı iki metil bütan içine yerleştirin.

İki metil bütan sıvısının OCT'ye temas etmesine veya OCT katı beyaz olana kadar kalbin donmasına izin vermemeye dikkat edin. Daha sonra kalıbı kuru buz içeren bir buz kovasına aktarın. Tüm kalpler donduktan sonra, kriyo kalıplarını folyoya sarın ve kriyoseksiyona hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Embriyonik kalpleri düzeltmek için, 12 folyo kültür plakasının kuyularını doldurmak için PBS'de% 4 PFA kullanın. Embriyonik kalpleri metin protokolüne göre inceledikten sonra, her kalbi bir PFA kuyusuna yerleştirin ve gece boyunca dört santigrat derecede sabitleyin Kalpleri plastik bir transfer pipeti kullanarak kriyo korumak için, her kalbi 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne taşıyın PBS'de 1.5 mililitre% 15 Sükroz ve kalp tüpün dibine batana kadar dört santigrat derecede hafifçe çalkalayın. Her kalbi PBS'de% 30 sükroza aktarın ve kalp tüpün dibine batana kadar dört santigrat derecede hafifçe çalkalayın.

Bu videoda daha önce gösterildiği gibi embriyoları OCT'de dondurun. Kriyo kalıplarını kriyostat odasına yerleştirdikten ve eksi 17 santigrat dereceye eşit olduktan sonra, kriyo kalıbını ters çevirin ve kalp bloğunu kalıptan çıkarmak için hafif bir basınç uygulayın. Kalbin ön duvarını kalıplanmış doku bloğunun tepesine yönlendirin.

Mandrene büyük bir damla OCT yerleştirin ve kalp bloğunu OCT damlasının üzerine monte edin. Oryantasyonu, kalbin ön duvarı aynadan en uzak olacak şekilde tutmak. Kalbin aynanın üzerinde donmasına izin verin.

Mandreni ve monte edilmiş kalp bloğunu kriyostat nesne tutucusuna yükleyin. Bıçağın açısı numuneye göre üç ila beş derece olacak şekilde ayarlayın. Pozitif yüklü bir kaplama ile ön işleme tabi tutulmuş mikroskop slaytları üzerine 10 mikrometre kesiti toplayın.

İmmünofloresan gerçekleştirmek için eksi 80 santigrat derecede saklamadan önce numunelerin tamamen kurumasını bekleyin. OCT'yi bölümlerden sabitledikten ve/veya çıkardıktan sonra, hafifçe çalkalayarak 45 dakika boyunca bloke etmek için PBS'de seyreltilmiş bir x engelleme tamponu kullanın. Farede üretilen bir birincil antikor kullanılıyorsa, bir eşek veya keçi anti fare IgG H artı L monovalent FAB fragmanı ekleyin, PBS'de% 0.1 ila 20 arasında seyreltilmiş ve hafifçe çalkalayarak oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin.

Bir x bloke edici tamponda seyreltilmiş birincil antikor veya antikorlar ekleyin ve oda sıcaklığında veya gece boyunca dört santigrat derecede iki saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, bölümleri 10 dakika boyunca üç kez yıkamak için bir XPBS kullanın. Oda sıcaklığında, toplayıcı konjuge konjuge ikincil antikor, numunelere bloke edici tamponda bir ila 500 oranında seyreltilir ve iki saat boyunca ışıktan korunarak inkübe edilir.

Oda sıcaklığında, bölümleri oda sıcaklığında ışıktan koruyarak 10 dakika boyunca üç kez yıkamak için bir XPBS kullanın. Sürgünün her iki ucuna iki damla orta damla koyarak slaytları solmaya karşı koruma ortamına monte edin ve örtmek için bir kapak fişi kullanın. Kapak fişlerini kapatmak için oje kullanın.

Dört santigrat derecede, görüntüye hazır olana kadar ışıktan koruyarak saklayın. Dört x objektif ve lazer floresan kullanarak numuneyi ve ilgi alanını bulun. Harita olarak kullanmak için görüntüyü yakalayın.

Yüksek büyütme oranında görüntüleme yaparken. Slayt sahnesinde küçük ayarlamalar yaparak slaydı çıkarın. Ardından 60 x yağa daldırma hedefine geçin.

Objektifin üzerine küçük bir damla yağ damlatın ve sürgüyü kaydırma sahnesine yerleştirin. Ardından, örneği tekrar bulun, lazer gücüne maruz kalma süresini ve gruplamayı her kanal için istenen seviyelere ayarlayın. Metin protokolünün yönergelerine göre en uygun ayarlar belirlendikten sonra, deney içindeki tüm doku bölümleri için numune ayarlarını kullanın.

Analiz için kullanılacak olan her kanal için en uygun yoğunluk aralığını not etmek için yoğunluk histogramını kullanın. Uygun lazer kanallarını seçerek alım işlevini kullanarak bir Zack oluşturun. Ardından Z yığınının üst ve alt sınırlarını seçin.

Yazılım tarafından sağlanan optik dilim kalınlığının yarısı kadar bir Zack adım boyutu seçin. Görüntü analizi için Fiji veya karşılaştırılabilir bir program kullanarak görüntüleri toplamak için çalıştır'a tıklayın. Zack dosyasını özel bir renk modu seçeneğiyle açın ve kanallar ayrı pencerelere bölün.

Görüntü açılır menüsünden, parlaklığı ayarla kontrast aracını açın ve her kanalda en uygun histogram yoğunluk aralığını ayarlayın. Daha önce belirlendiği gibi, bu kanal aralıklarını analiz edilen tüm Zacks'e uygulayın. Ardından görüntü renginden, menüyü aşağı çekin, tek tek kanalları tek bir bileşik görüntüde birleştirin.

Görüntü Yığınları Z proje menüsünü kullanarak, bileşik görüntüden düzleştirilmiş bir Z yığını oluşturun. Bu görüntü 3D görüntüden önemli ölçüde daha parlak olacağından, aşırı doygunluğu önlemek için kontrol örneğinin histogram yoğunluk aralığını ayarlayın ve aynı ayarları deneysel düzleştirilmiş Zack'e uygulayın Bir 3D görüntü oluşturmak için önce görüntü yığınları 3D proje menüsünü seçin. Dönme için x eksenini veya Y eksenini seçin.

Dilim aralığını, Z yığını adım boyutuyla aynı mikron sayısı olarak ayarlayın. İstediğiniz toplam dönüşü seçin ve dönüş açısı artışını bir olarak ayarlayın. Ardından, eklentiler açılır menüsünden J 3D görüntüleyici görüntüsünü açın.

Bileşik görüntü oluşturulan ekranı hacim olarak seçin ve yeniden örnekleme faktörünü bir veya iki olarak ayarlayın. Bu şekiller, bir çırpıda dondurulmuş, asetonla sabitlenmiş bir kalpte, S alfa aktinin'e karşı antikorun tekrarlanabilir şekilde etiketlenmiş Z disklerinde ve yüksek özgüllüklü ve minimal arka plana sahip entere disklerde farklı proteinlerin cos boyaması için tipik sonuçları göstermektedir. Yapışma bağlantı proteini beta-katenine karşı antikor, hem kardiyomiyositlerin hem de kardiyomiyosit olmayan hücrelerin zarını bağladı ve SFA aktinin ile kolokalizasyon, E 16.5 beta bir Embriyonik kalpte integrin immünofloresansı özellikle zordur, ancak bu çalışmalarda beta bir integrin boyama, SFA Aktinin etiketli Z diskleri ile aynı periyodikliğe sahip sinyal ortaya çıkardı, muhtemelen E 16.5'te şekillenen yeni ortaya çıkan müşterileri yansıtıyor.

E 12.5'te, SFA aktinin ve tropo misin boyama paterni, dış kompakt bölgedeki olgun miyofibrillerle tutarlı trabeküler kardiyomiyositlerde düzenli periyodiklik gösterdi, SFA aktinin lineerden daha noktalıydı ve tropo miyozin sinyali lineer NCA yapışık boyama yerine yaygındı ve E 12.5 kalplerinde trabeküler kardiyomiyositler, muhtemelen interlenmiş diskleri temsil eden yoğun SFA aktinin boyama alanlarıyla birlikte lokalize oldu. Burada gösterilen, bir yaşam eylemi RFP Ruby transgenik fareden SFA aktinin ve filamentli akton için etiketlenmiş bir PFA sabit E 12.5 embriyonik kalptir. SFA aktin sinyalinin gürültü oranı, donmuş kalp bölümlerine göre daha azaldı.

Üç boyutlu görüntü rekonstrüksiyonu, bir kardiyomiyosit içindeki MyFi'nin kabaca birbirine paralel olduğunu, ancak bireysel kardiyomiyositlerin birbirine göre değişen açılarda yönlendirildiğini ortaya koydu. Bu videoyu izledikten sonra, fare kalbi gelişimi sırasında MyFi ve kardiyomiyosit olgunlaşmasını değerlendirmek için embriyonik kalpleri nasıl düzgün bir şekilde yönlendireceğinizi ve kriyo kesitini nasıl alacağınızı ve ayrıca immünotik boyama, konfokal mikroskopi ve görüntü analizi yapacağınızı iyi anlamalısınız. Itiraf.