Name: Embriyonik Fare Heart Immunofluorescence kullanarak kardiyomiyosit Geliştirme Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Keşfedin embriyonik fare kalbinde kardiyomiyosit olgunlaşmasını immunofluoresans ve konfokal mikroskopi ile. Bu yöntem, kalp gelişimi ve doğuştan kalp defektleri araştırmalarında yüksek çözünürlüklü yapısal analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, yararlı tartışmalar için Dr. Hilary Clay, Stephen Wilson, Anna Payne-Tobin ve James Smyth'e teşekkür eder. Mikroskopi, San Francisco'daki California Üniversitesi'ndeki Kardiyovasküler Araştırma Enstitüsü Görüntüleme Çekirdeği'nde yapıldı. Bu çalışma NIH K08 HL105657 (LDW) ve NIH HL65590 (SRC) tarafından desteklenmiştir.

NOT: Tüm deneysel işlemler UCSF Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. 1. Kriyoprezervasyon ve Embriyonik Fare Kalpler Fiksasyon. 1.1) embriyonik kalpleri Ek dondurma <ol><li> Optimal Kesme Sıcaklık 3,5 cm petri ve 7 mm&#39;lik cryomolds doldurun (Ekim), orta (Malzeme Tablo). Kimyasal bir kaput, sıvı azot içinde bir 2-difluorobenzil bromür soğutun. </li><li> 10 cm&#39;lik petri kaplannın içinde, 3.5 cm&#39;lik petri kaplarının içine, 10 ml PBS, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), 30 ml koyun, ve buz üzerinde her petri kapları yerleştirin. Bir 10 cm&#39;lik çanak ve hamile fare başına birkaç 3,5 cm yemekler hazırlayın. </li><li> Daha önce buz soğukluğunda PBS diseksiyon yapılması, 15 tarif edildiği gibi embriyolar izole edin. </li><li> Kısaca, CO 2 narkoz ve servikal dislokasyon kullanarak hamile kadın euthanize. <ol><li> Karın bir kesi yapmak alo damarları keserek rahim teşrihrahim içi eğrilik ng ve buz soğukluğunda PBS içeren 10 cm&#39;lik bir petri tabağına rahim aktarın. </li><li> Buz soğukluğunda PBS içeren bağımsız bir 3.5 cm Petri için, her bir embriyonun transfer arasında rahim içinde kesilir. 15 anlatıldığı gibi, her embriyo izole edin. </li><li> Ince forseps kullanılarak perikard boşluğu açın aorta, vena kava ve pulmoner venlerin de keserek uzak akciğer ve damar kalp kaldırmak ve OCT içeren 3,5 cm petri içine aktarın. </li><li> Bundan sonra, kalp OCT içeren 7 mm&#39;lik kalıba kalp transferi, birkaç saniye içinde Ekim muvazene edelim. Kalıbın dibine kalbin ön duvarını yönlendirin. </li></ol></li><li> Yavaşça, sıvı nitrojen soğutmalı 2-metilbütan içine kalıp yerleştirin. Kendine iyi bak 2-metilbütan sıvı Ekim veya kalp dokunmak için izin değil. Ekim beyaz katı kadar, sonra kuru buz içeren bir buz kovası için kalıp aktarmak dondurun. Bir sonraki embriyo üzerinde hareket ettirin. </li><li> Wrap cryosectioning için hazır olana kadar -80 ° C &#39;de folyo ve mağaza cryomolds. </li></ol> 1.2) Alternatif: Paraformaldehit (PFA) sabitleme, soğukta koruyucu ve Ekim embriyonik kalpleri gömme <ol><li> 1x PBS içinde% 4 PFA ile 12-çukurlu bir doku kültür plakasının deliklerine doldurun. </li><li> 1.1.3 açıklandığı gibi embriyonik kalpleri parçalara ayır. Iyi içeren% 4 PFA içine her kalp yerleştirin ve 4 ° CO / N ile sabitleyin. </li><li> Donmaya karşı koruma sağlamak: plastik bir transfer pipeti kullanılarak, PBS içinde 1.5 ml% 15 sukroz ihtiva eden bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü, her bir kalp hareket ve kalp tüpün dibine batar kadar yavaşça (4 ° C &#39;de O / N birkaç saat ajite ). PBS içinde% 30 sükroz, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ihtiva eden 1.5 ml her kalp transfer ve kalp (O / N birkaç saat) tüpün dibine batar kadar yavaşça tekrar 4 ° C&#39;de çalkalayın. </li><li> Plastik bir transfer pipet kullanarak, Ekim içine Kriyo-korumalı kalp koyun ve muvazene edelimBirkaç dakika fazla sakaroz kaldırmak için, sonra OCT içeren 7 mm kalıp içine kalp aktarın. Kalıbın dibine kalbin ön duvarını yönlendirin. </li><li> Sıvı azot içinde soğutulmuş 2-metilbütan veya kuru buz ya da kalıbı Ekim kalbin dondurun. </li><li> Cryosectioning için hazır olana kadar -80 ° C &#39;de folyo ve mağaza cryomolds sarın. </li></ol> 2. Cryosectioning <ol><li> -17 ° C&#39;ye ayarlayın kriyostat sıcaklığı. </li><li> Talep kriyostat odasına cryomolds ve 15-20 dakika boyunca sıcaklığına gelmesini. </li><li> Cryomold ters çevirin ve kalıp kalp bloğu çıkarmak için hafif baskı uygulayın. Kalıplı doku bloğu üstüne kalbin ön duvarını yönlendirin. </li><li> Aynanın üzerine Ekim büyük bir damla yerleştirin ve aynasının üzerine dondurma Ekim damla üzerine kalp bloğu monte edin. Kalbin ön duvar aynası uzak olacak şekilde yönlendirmeyi tutun. </li><li> Chuck yükleyin ve he monteKriyostat nesne tutucu üzerine sanat bloğu. Bıçağının açısı örnek 3-5 ° &#39;olacak şekilde ayarlayın. </li><li> Pozitif yüklü bir kaplama ile önceden tedavi edilmiştir mikroskop lamı üzerine 10 um bölümler toplamak (Malzeme Tablo). -80 ° C&#39;de saklamadan önce tamamen kurumasını bekleyin. </li></ol> 3. İmmünofloresan <ol><li> Ek Dondurulmuş kesitler için, tamir ve oda sıcaklığında bir çeker ocak içinde, 10 dakika boyunca aseton içinde doku geçirgenliği. </li><li> Hızlı bir şekilde dondurulup PFA sabit bölümler için, Ekim ayrılması için 20 dakika süre ile, PBS% 0.1 Triton X-100 içinde inkübe ve PFA sabit bölümleri geçirgenliği. </li><li> PBS içerisinde seyreltilmiş 1 x bloke edici tampon içinde 45 dakika için Blok. </li><li> Oda sıcaklığında 45 dakika boyunca PBS% 0.1 Tween 20, 100 (Tartışma) farede üretilen bir birincil antikor kullanıldığında, eşek veya keçi anti-fare IgG (H + L): 1 seyreltilmiş, tek değerli Fab parçası içinde inkübe edilir. </li><li> RT ya da 2 saat süre ile 1x bloke tamponu içinde seyreltilmiş birincil antikor veya antikorlar inkübeO / 4 ° C&#39;de N (özel dilüsyonlarının için Malzemeleri / Ekipman Tablo). </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika süre ile 1x PBS içinde üç kez bölümleri yıkayın. </li><li> 1 seyreltilmiş Alexa Fluor-konjuge sekonder antikor inkübe: 500 ışıksız bir ortamda oda sıcaklığında 2 saat için bloke edici tampon içinde. </li><li> Işıksız bir ortamda oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1 x PBS içinde üç kez bölümleri yıkayın. </li><li> İsteğe bağlı: daha sonra, çekirdek etiket, PBS ile durulayın (ışıktan korunmuş olarak) oda sıcaklığında PBS içinde 2000: Hoechst boya inkübe 1 seyreltilmiştir. </li><li> Sonrası düzeltme oda sıcaklığında 1 dakika boyunca,% 1 PFA bölümleri etiketli. </li><li> Bir lamel ile kaplama daha sonra slayt her ucundaki orta iki damla yerleştirerek ve (çekirdekler zaten etiketli değilse DAPI ile) Dağı, anti-solmaya ortamında slaytlar. Mühür oje ile lamelleri. Mağaza görüntü hazır olana kadar 4 ° C&#39;de ışıktan korunmuş bulunmaktadır. </li></ol> 4. Konfokal Görüntüleme ve Görüntü Analizi <ol><li> Uygun lazer dalga boylarında, kamera ve mikroskop konfokal inc açınsahne taşıyıcı ve z motoru luding. Görüntüleme yazılımı programı başlatın. Sırasıyla Hoechst-, Alexa 488- ve Alexa 568-boyanmış kesitler görüntülenmesi için 405, 488 ve 561 lazer dalga boylarını kullanarak. NOT: Bizim donanım ve yazılım özellikleri için Malzeme Tablosu bakın. </li><li> Slayt sahnede kontrol slayt (ters mikroskop için aşağı lamel) monte edin. </li><li> 4X objektif kullanılarak, (Malzeme Tablo) örnek ve ilgi alanını bulmak. Yüksek büyütme görüntüleme yaparken bir harita olarak kullanmak için görüntüyü yakalamak. </li><li> Slayt sahneye az ayarlamalar yaparak, slayt çıkarın. 60x immersiyon yağı hedefi değiştirin, (Malzeme Tablo) objektif yağ küçük bir damla koyun ve slayt sahneye (aşağı lamel) slayt değiştirin. </li><li> Yine örnek bulun. Her kanal için istenen seviyelere lazer gücü, pozlama süresini ve binning ayarlayın. NOT: Biz genellikle lazer 0.8 gücünü, 100 msn kamera pozlama süresini ve 2 binning kullanın (see Malzemeleri Masa) donanım ve yazılım özellikleri için; Optimal ayarları ampirik her bir deney için tespit edilmesi gerekmektedir. <ol><li> Optimal ayarları belirlendikten sonra, deney içinde tüm doku bölümleri için aynı ayarları kullanabilirsiniz. (Bu bilgi analizi için kullanılacak) Her kanal için optimum yoğunluk aralığını dikkat yoğunluk histogramı kullanın. </li></ol></li><li> Sonra z yığının üst ve alt sınırlarını seçin, uygun lazer kanalları seçin: edinim fonksiyonunu kullanarak az yığını oluşturun. Yazılım tarafından sağlanan optik dilim kalınlığı bir buçuk değer az yığın adım boyutunu seçin. Görüntüleri toplamak için &quot;run&quot; tıklayın. </li><li> Fiji 16 veya görüntü analizi için benzer bir program kullanın. Fiji içinde, Özel renk modu seçeneği ve ayrı pencerelerde bölünmüş kanallar z yığın dosyasını açın. Menüsünden açılan Image &quot;Parlaklık / Kontrast Ayarı&quot; aracını açın; Her bir kanal içinde, sve optimum histogram yoğunluğu aralığı 4.5.1 belirledi. Tüm z yığınlarının bu kanal aralıkları uygulayın analiz edilir. </li><li> Image-&gt; Renk açılan menüsünü kullanarak tek bir kompozit görüntü içine tek tek kanalları Birleştirme. </li><li> Tuşlayın-&gt; Stacks-&gt; z proje menüsü kullanılarak kompozit görüntü düzleştirilmiş z yığını oluşturun. Bu görüntü 3D görüntü önemli ölçüde daha parlak olacaktır; kontrol örneği doyma önlemek ve deneysel düzleşmiş z yığını aynı ayarları uygulamak için histogram yoğunluk aralığını ayarlayın. </li><li> 3D görüntü oluşturmak için, önce kullanmak Image-&gt; Stacks-&gt; 3B proje menüsü 17. X ekseni veya dönme y-eksenini birini seçin. Z yığın adım büyüklüğü gibi mikron aynı sayıda olarak dilim aralığı ayarlayın. Istenen toplam rotasyon seçin ve sonra Eklentiler açılan menüden Image J 3D Görüntüleyici açmak 1. dönme açısı artışını ayarlamak. Cilt kompozit 4.8 oluşturulan görüntü, ekran seçin, ve Re set1 ya da 2 faktör örnekleme yapılmasıdır. </li></ol>

<ol><li>Risebro, C. A., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+ventricles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Scientific+World+Journal%22%5BJournal%5D)">Formation of the ventricles.</a> The Scientific World Journal. 6, 1862-1880 (2006).</li>
<li>Ji, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+cardiac+function+during+early+mouse+embryogenesis+coincides+with+entry+of+primitive+erythroblasts+into+the+embryo+proper%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper.</a> Circulation research. 92, 133-135 (2003).</li>
<li>Bennett, P. M., Maggs, A. M., Baines, A. J., Pinder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transitional+junction%3A+a+new+functional+subcellular+domain+at+the+intercalated+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">The transitional junction: a new functional subcellular domain at the intercalated disc.</a> Molecular biology of the cell. 17, 2091-2100 (2006).</li>
<li>Sparrow, J. C., Schock, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initial+steps+of+myofibril+assembly%3A+integrins+pave+the+way.+Nature+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 10, 293-298 (2009).</li>
<li>Kastner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+A+deficiency+and+mutations+of+RXRalpha%2C+RXRbeta+and+RARalpha+lead+to+early+differentiation+of+embryonic+ventricular+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Vitamin A deficiency and mutations of RXRalpha, RXRbeta and RARalpha lead to early differentiation of embryonic ventricular cardiomyocytes.</a> Development. 124, 4749-4758 (1997).</li>
<li>Zhang, W., Chen, H., Qu, X., Chang, C. P., Shou, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+ventricular+trabeculation%2Fcompaction+and+the+pathogenesis+of+the+left+ventricular+noncompaction+cardiomyopathy+%28LVNC%29%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+medical+genetics+Part+C%2C+Seminars+in+medical+genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of ventricular trabeculation/compaction and the pathogenesis of the left ventricular noncompaction cardiomyopathy (LVNC).</a> American journal of medical genetics Part C, Seminars in medical genetics. 163C, 144-156 (2013).</li>
<li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+localization+of+alpha3beta1+integrin+isoforms+in+association+with+myofibrillogenesis+during+cardiac+myocyte+development+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+adhesion+and+communication%22%5BJournal%5D)">Cellular localization of alpha3beta1 integrin isoforms in association with myofibrillogenesis during cardiac myocyte development in culture.</a> Cell adhesion and communication. 7, 85-97 (1999).</li>
<li>Lu, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vinculin%2Fsarcomeric-alpha-actinin%2Falpha-actin+nexus+in+cultured+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The vinculin/sarcomeric-alpha-actinin/alpha-actin nexus in cultured cardiac myocytes.</a> The Journal of cell biology. 117, 1007-1022 (1992).</li>
<li>Schultheiss, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+distribution+of+subsets+of+myofibrillar+proteins+in+cardiac+nonstriated+and+striated+myofibrils%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Differential distribution of subsets of myofibrillar proteins in cardiac nonstriated and striated myofibrils.</a> The Journal of cell biology. 110, 1159-1172 (1990).</li>
<li>Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Costameres%2C+focal+adhesions%2C+and+cardiomyocyte+mechanotransduction.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">Costameres, focal adhesions, and cardiomyocyte mechanotransduction. American journal of physiology.</a> Heart and circulatory physiology. 289, H2291-H2301 (2005).</li>
<li>Sinn, H. W., Balsamo, J., Lilien, J., Lin, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+novel+Xin+protein+to+the+adherens+junction+complex+in+cardiac+and+skeletal+muscle+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Localization of the novel Xin protein to the adherens junction complex in cardiac and skeletal muscle during development.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 1-13 (2002).</li>
<li>Lu, S., Borst, D. E., Horowits, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-RAP+expression+during+mouse+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">N-RAP expression during mouse heart development.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 201-212 (2005).</li>
<li>Hirschy, A., Schatzmann, F., Ehler, E., Perriard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+cardiac+cytoarchitecture+in+the+developing+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Establishment of cardiac cytoarchitecture in the developing mouse heart.</a> Developmental biology. 289, 430-441 (2006).</li>
<li>Whitman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desmoplakin+and+talin2+are+novel+mRNA+targets+of+fragile+X-related+protein-1+in+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Desmoplakin and talin2 are novel mRNA targets of fragile X-related protein-1 in cardiac muscle.</a> Circulation research. 109, 262-271 (2011).</li>
<li>Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryonic+development+in+a+serum-free+whole+embryo+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22BMC%22%5BJournal%5D)">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC. 11, 274(2010).</li>
<li>Swope, D., Cheng, L., Gao, E., Li, J., Radice, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+cadherin-binding+proteins+beta-catenin+and+plakoglobin+in+the+heart+leads+to+gap+junction+remodeling+and+arrhythmogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Loss of cadherin-binding proteins beta-catenin and plakoglobin in the heart leads to gap junction remodeling and arrhythmogenesis.</a> Molecular and cellular biology. 32, 1056-1067 (2012).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact+mice+for+studying+F-actin+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lifeact mice for studying F-actin dynamics.</a> Nature. 7, 168-169 (2010).</li>
<li>Shi, S. R., Shi, Y., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+immunohistochemistry%3A+review+and+future+prospects+in+research+and+diagnosis+over+two+decades%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval immunohistochemistry: review and future prospects in research and diagnosis over two decades.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 59, 13-32 (2011).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%27+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> The Journal of cell biology. 172, 9-18 (2006).</li>
<li>Risebro, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prox1+maintains+muscle+structure+and+growth+in+the+developing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Prox1 maintains muscle structure and growth in the developing heart.</a> Development. 136, 495-505 (2009).</li>
<li>Ehler, E., Rothen, B. M., Hammerle, S. P., Komiyama, M., Perriard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibrillogenesis+in+the+developing+chicken+heart%3A+assembly+of+Z-disk%2C+M-line+and+the+thick+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Myofibrillogenesis in the developing chicken heart: assembly of Z-disk, M-line and the thick filaments.</a> Journal of cell science. 112 (Pt 10), 1529-1539 (1999).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

uygun doku fiksasyon tekniği ve seyreltme ampirik her bir antikor için belirlenmelidir. Elimizde olanlar, ek donma s-α-aktinin, β-katenin, β1-integrin, tropomiosin, Talin ™ (gösterilmemiştir) ve N-kaderin dahil olmak üzere birçok kardiyomiyosit antijenleri, PFA tespit üstündür; aksine, PFA tespit fokal yapışma kinaz için daha iyi sonuçlar elde edilir (gösterilmemiştir). PFA tarafından oluşturulan protein çapraz bağlarının epitopları ve sınır antikor bağlanma maskeleyebilir; antijen geri alma gibi durumlarda gerekli olabilir ve antijen alma yöntemleri başka 20 bulunabilir. PFA konsantrasyon veya Sabitleme uzunluğu ampirik her bir antikor için ve her bir gelişme aşamasında tespit edilen optimal şartlara epitop maskeleme azaltmak için azaltılabilir. Primer antikor kontrol olarak bağışıklık-öncesi serumun bir &quot;birincil antikoru&quot; co içeren yeni bir antikor ya da kardiyak mutantını karakterize ederken, uygun negatif kontrollere kullanılmalıdırntrol. Nakavt farelerin kullanılması ideal bir negatif kontrol ancak erken öldürücülüğü burada okudu gen ürünlerinin çoğu için kullanımını önler. Yeterli hacimlerinin kullanımı tamamen aynı immunofloresan engelleme, antikor deney ve kontrol slaytlar batırmak için, ve çözümlere bölümlerin tek tip pozlama sağlamak için inkübasyon sırasında slaytlar nazik sallanan olarak yıkama çözümleri önemliydi. Bu yaklaşım, bir deney içinde bölümlere ve slaytlar arasında boyanarak teknik değişkenlik minimize. Maliyetli antikor çözeltisi hacmi sınırlar olduğunda, doku bölümleri dışında çözüm akışını sınırlandırmak ve uzun inkubasyon sırasında bir nemlendirilmiş oda içinde slaytlar tutmak için Pap kalem kullanın. Bir monoklonal fare birincil antikor - ve bu nedenle, bir anti-fare ikincil antikoru - kullanılıyor, endojen fare immünoglobülinleri kapsayacak şekilde ikinci bloke edici aşama, spesifik olmayan arka plan sinyali azaltmak için gerekli olan (adım 3.4) olur. Uygun mikroskopi ve görüntü işleme teknikleri biyolojik doğru bilgi edinme 21 için kritik öneme sahiptir. Her renk için - (16-bit görüntü için 65535 seviyesi 0) yoğunluk histogramı her yoğunluk seviyesinde piksel dağılımını gösterir. Arka plan, parlaklık, kontrast ve Histogram tepe kuşatan bir yoğunluk görüntü aralığını ayarlayarak ayarlanabilir; koşulları arasında geçerli karşılaştırmalar yapmak, kontrol ve deney koşulları arasında aynı ayarları kullanılmalıdır. Bu protokol, yerli embriyonik fare kalbinde kardiyomiyosit olgunlaşmasını ve gelişmesini analiz etmek için güvenilir bir yöntem sağlar. Kardiyomiyosit-spesifik proteinlerin immünofloresan sık sık gelişimi sırasında kardiyomiyositlerde işaretlemek için kullanılır iken, birkaç çalışmada yüksek çözünürlüklü myofibril yapının analizi ve birleştirilmiş diskler ve costameres 12-14,22,23 çıkışına izin tekniklerini kullanır. Bu teknik, v için kullanılabilirYapısal anormallikler mekanizmalarına ışık tutabilir kardiyomiyosit olgunlaşmasında değişikliklerin belirlenmesi bir aracı olarak, gelişimsel kalp kusurlarına neden mutasyonlar ivo değerlendirmesi.

Kardiyomiyositler orta hatta göç ve doğrusal kalp tüpü 1,2 formu sonra gelişimi sırasında, kalp kasılmaları yakında başlayacak. sarkomer kardiyomiyosit içinde temel kasılma birimidir; Bu son derece organize iskelet yapısı sarkomerik α-aktinin (s-α-aktinin) ve M hattına demirlemiş miyozin lifleri (Şekil 1) Z-disk demirlemiş aktin filamentleri içerir. Kardiyomiyosit olgunlaştıkça, sarkomer hücrenin boyunca uzanan Miyofibril oluşturmak için seri araya. Miyofibril birleştirilmiş disk tarafından kardiyomiyosit uçlarına tespit edilir, örneğin s-α-aktinin 3 adherens Z-diski elemanlarının bir alt kümesi ile bir geçiş birleşme içeren hücre-hücre birleşim yapısı, örneğin N-kaderin olarak birleşme proteinleri ve β katenin, boşluk birleşme proteinleri ve dezmozomlar (Şekil 1) 4. Uzunlamasına zarının, aynı zamanda çevresel myofibrils Z-diskler boyuncacostameres yoluyla hücre membranına bağlanabilir; Bu özel fokal yapışmalarda (Şekil 1) 4 myofibril, plazma membranı, ve kardiyomiyosit yapıya ilave bir yapısal destek sağlamak için, hücre dışı matris arasındaki bir çapa sağlar. Erken kalp gelişiminde, kardiyomiyositlerde ventriküler boşluk içine çıkıntı yapan ve nispeten olgun Miyofibril 5 içeren, bağ olarak da bilinen parmak şeklinde çıkıntılar olarak düzenlenmiştir. Kalp geliştirme ilerledikçe, alt-epikardiyal bölgede kardiyomiyositler ventriküler duvarları içermektedir, ancak sarkomer ve myofibril montaj trabeküler miyokardın 5,6 ile karşılaştırıldığında gecikmiş olan kompakt miyokard oluşturmak için çoğalırlar. Sarkomerinde ve myofibril montaj modelleri kültürlü basit ama bir üç boyutlu ortam, kan akışını eksikliği kardiyomiyositlerinde 7-10, ve diğer kardiyak hücre ile temas üzerine immunofloresan çalışmaları büyük ölçüde geliyorin vivo mevcut s. fare embriyonik merkezinde immünoflüoresans kullanarak Yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmalar teknik olarak zorlu ve birkaç çalışma fare kalp gelişimi sırasında birleştirilmiş diskler ve costameres ortaya çıkmasını incelemiş bulunuyoruz. katenin β adherens kavşak proteini embriyonik gün birleştirilmiş diskler (E) 17.5 11, N-kaderin doğum sonrası gün 0 13 karşı E18.5 12 ile birleştirilmiş diskleri temsil edebilir lineer yapılara lokalize ve costameres tespit edilmiş lokalize görünüyor E18.5 14, ama bu proteinler önceki gelişimsel zaman noktalarında 11-13 de yaygın ve daha sürekli zar dağılımını gösterir. Burada, biz intercala ortaya çıkması da dahil olmak üzere myofibril kardiyomyosit gelişimi ayrıntılı analizi, olanak immün ve kesitli fare embriyonik kalplerin floresan mikroskopi için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem tarifted gibi erken E12.5 E16.5 ve de doğmakta olan costameres olarak diskler. Bu protokol, sarkomer oluşumu gibi myofibril kardiyomyosit olgunlaşması üzerindeki mutasyonlar etkilerini tarama için de yararlı olabilir.

<table><tbody><tr><td>Cryomold, Tek Kullanımlık Taban Kalıbı, 7x 7 mm</td><td>Richard-Allen Scientific</td><td>58949</td><td>Bu boyut Fisher Scientific Cryomold'da mevcut değildir</td></tr><tr><td>, Tek Kullanımlık Taban Kalıbı, 15 x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-159</td><td>Ayrıca Richard-Allen Scientific'ten de temin edilebilir, katalog numarası 58950</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Optimal Kesme Sıcaklığı (OCT) orta 4583</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>2-metil bütan</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td>1x PBS, pH 7.2-7.4'te taze% 4'lük çözelti kullanın.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>1X PBS'de %15 ve %30 solüsyon kullanın.</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık transfer pipeti</td><td>Fisher Scientific</td><td>S30467-1</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>"Plus", pozitif yüklü kaplamayı gösterir ve slayta doku yapışmasını korumak için kritik öneme sahiptir.</td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Sigma</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Batı Bloke Edici Ajan</td><td>Roche</td><td>11921673001</td><td>İkincil antikorlar farklı türlerden olduğunda immünofloresan için bloke edici tampon. PBS'de 1x'e kadar seyreltin.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Anti-fare IgG (H + L) monovalent Fab parçası</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-007-003</td><td>Keçi Anti-fare IgG (H + L) de mevcuttur. Endojen immünoglobulinleri bloke etmek için.</td></tr><tr><td>Anti-s-&#945;-aktinin antikoru</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td>Fare monoklonal, klon EA53. Çıtçıtlı donmuş/asetonla sabitlenmiş bölümler için 1:400 oranında seyreltin, PFA ile sabitlenmiş bölümler için 1:300 oranında seyreltin. Fare dokusu üzerinde inkübasyondan önce, endojen fare immünoglobulinlerini anti-fare IgG (H + L) monovalent Fab fragmanı ile bloke edin.</td></tr><tr><td>Anti-&#946; katenin antikoru</td><td>Hücre Sinyali</td><td>9587s</td><td>Tavşan poliklonal. Çıtçıtlı dondurma/aseton fiksasyonu gerektirir. 1:400 oranında seyreltin.</td></tr><tr><td>Anti-&#946; 1 integrin antikoru</td><td>R& D</td><td>AF2405</td><td>Keçi poliklonal. 1:200 oranında seyreltin. Çıtçıtla dondurulmuş/asetonla sabitlenmiş doku boyama, PFA'ya sabitlenmiş dokudan daha üstündür.</td></tr><tr><td>Anti-tropomiyozin antikoru</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası, Iowa Üniversitesi</td><td>CH1</td><td>Fare monoklonal. Çıtçıtlı dondurma/aseton fiksasyonu gerektirir. 1:200 oranında seyreltin. Fare dokusu üzerinde inkübasyondan önce, endojen fare immünoglobulinlerini anti-fare IgG (H + L) monovalent Fab fragmanı ile bloke edin.</td></tr><tr><td>Anti-N-kaderin antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7939</td><td>Tavşan poliklonal. 1:200 oranında seyreltin. Çıtçıtla dondurulmuş/asetonla sabitlenmiş doku boyama, PFA'ya sabitlenmiş dokudan daha üstündür.</td></tr><tr><td>Anti-talin antikoru</td><td>Sigma</td><td>T3287</td><td>Fare monoklonal, klon 8d4. Çıtçıtlı dondurma/aseton fiksasyonu gerektirir. 1:200 oranında seyreltin. Fare dokusu üzerinde inkübasyondan önce, endojen fare immünoglobulinlerini anti-fare IgG (H + L) monovalent Fab fragmanı ile bloke edin.</td></tr><tr><td>Anti-fosfotirozin 397 fokal yapışma kinaz antikoru</td><td>Invitrogen</td><td>700255</td><td>Tavşan monoklonal antikoru. PFA fiksasyonu gerektirir. 1:500 oranında seyreltin.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Eşek Anti-Fare IgG (H + L) Antikor</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Eşek Anti-Tavşan IgG Antikor</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Keçi Anti-Fare IgG (H + L) Antikor</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L) Antikor</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A-11011</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 boya</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>H3570</td><td>Nükleer leke</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vektör laboratuvarları</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Lameller</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>MLC 400B Monolitik Lazer Birleştirici Lazer kutusu</td><td>Keysight (eski adıyla Agilent)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clara Interline CCD kamera</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti ters çevrilmiş mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1 Dönen disk konfokal tarayıcı ünitesi</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Apochromat 4X hava objektifi</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Sayısal açıklık (NA) 0,2, Çalışma mesafesi (WD) 15,7 mm</td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Apochromat VC 60x yağ immesion objektifi (MRD01602)</td><td>Nikon&nbsp; &nbsp;</td><td>NA 1.4, WD 0.13 mm</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements Görüntüleme Yazılımı</td><td>Nikon</td><td>http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü analiz yazılımı</td><td>Fiji</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td></td></tr></tbody></table>

embriyonik fare heart immunofluorescence kullanarak kardiyomiyosit geliştirme analizi

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Kalp gelişimi sırasında, miyokard özgü yapısal ve işlevsel sarkomer, kasılma myofibrils, interkalasyonlu diskler dahil birimler ve costameres nesil zaman ve mekan içinde birden çok bileşenden koordineli birleşimi gerektirir. Bu bileşenlerin montajında ​​bozulması gelişimsel kalp kusurları yol açar. Immunofluorescent boyama teknikleri myofibril olgunlaşmasını prob kültürlü kardiyomiyositlerde yaygın olarak kullanılan, ancak bu ex vivo yaklaşım myocytes tam endokardiyal ipuçları kültürünü, normal vivo mekanik girdilerin eksikliği ve yokluğu olarak ayırt edecek hangi ölçüde sınırlıdır. Fare kalp geliştirme çalışmaya immunofloresan tekniklerinin uygulanması arzu ama daha teknik açıdan zor ve yöntemler sıklıkla kalp gelişiminin erken dönemlerinde sarkomer görselleştirmek için yeterli hassasiyet ve çözünürlük eksikliği. Burada, biz mu-immunostain co sağlam ve tekrarlanabilir bir yöntem tarifltiple proteinler veya embriyonik fare kalbinde immunofluorescent boyama ile bir floresan proteini birlikte görselleştirmek ve gelişmekte Miyofibril, interkalasyonlu diskleri ve costameres analiz etmek için bu yöntemi kullanın. Bu yöntem ayrıca gelişimsel kalp kusurlarına yol mutasyonlar neden kardiyomiyosit yapısal değişiklikleri değerlendirmek için uygulanabilir.

Bir çırpıda dondurulmuş ve aseton-sabit kalbinde farklı proteinlerin ortak boyama için 6 gösteri tipik sonuçlarla 2 Şekil. Söz konusu antikorun yeniden üretilebilir etiketli Z diskler, yüksek seçicilik ve en az bir arka plan (Şekiller 2A, 3A, 4A, 5A, 6A ve 6C) ile birleştirilmiş diskler s-α-aktinin Şekil 6 göstermektedir ki, anti-fare IgG (H + L), tek değerli Fab parçası etkili bir şekilde engeller, endojen fare IgG anti-fare ikincil antikorlar ile bağlanma. katenin β adherens birleşme proteinine karşı antikor kardiyomiyositlerde olmayan kardiyomiyosit hücrelerin hem de zara bağlı ve beklendiği gibi s-α-aktinin ile birlikte yeri, E16.5 (Şekil 2C ve D) olduğu varsayılan birleştirilmiş diskler oluştu Yetişkin kalp 18 β katenin boyama desen. βEmbriyonik merkezinde 1 integrini immünofloresan özellikle zordur ve çoğu zaman fokal yapışmalarda 14 tanımlamak için başarısız olur, ancak bu çalışmalarda β1 integrin boyama muhtemelen en oluşturucu oluşmakta olan costameres yansıtan s-α-aktinin etiketli Z diskler gibi eşit periyodikliğe sahip bir sinyal ortaya E16.5 (Şekil 3D). E12.5, s-α-aktinin ve tropomiosin (sarkomer ince filaman proteini) imüno-s-α-aktinin bu hücreler (Şekil 4A ve 5A&#39;da olgun myofibrils tutarlı trabeküler kardiyomiyositlerde normal periyodik bir boyama modeli ortaya koymuştur Şekil 4B tropomiyozin için). Muhtemelen interkalate diskleri temsil E12.5 kalpleri de trabeküler kardiyomiyositler N-kaderin boyama yoğun s-α-aktinin boyama alanlarında (C - - D ve Şekil 6A Şekil 5B) ile colocalize eğiliminde. Içindetrabeküler miyositlerine kontrast, kompakt bölgede s-α-aktinin doğrusal daha noktasal oldu, ve tropomiyozin boyama yaygın ziyade doğrusal oldu (Şekil 4A ve 4B). Böylece, sarkomer montaj trabeküler miyokarda göre kompakt daha sonra ortaya çıkabilir. Ayrıca, kompakt bölgesinde s-α-aktinin ve tropomiyozin ayırıcı desenler ince filament içine dahil edilmesine tropomiyozin myofibril mecliste bir sonraki olay olabilir iken bu s-α-aktinin, puncta ve erken olgunlaşmamış Z-diskler içine düzenler öneririz. Şekil 7, Film 1 ve Film 2 PFA sabit E12.5 embriyonik kalp tipik sonuçları göstermektedir. Bu örneklerde, bir LifeAct-RFPruby transgenik embriyo görüntüleme için kullanıldı; LifeAct-RFPruby transgen 19 filamentli aktin etiketler ama PFC tespit gerektirir. S-α-aktinin ile etiketlenmiş Z diskler çok alanda görselleştirmek için kolay, ancak bir sinyal-gürültü oranı Decré oldu<html> şekild dondurulmuş kalp bölümleri (Şekil 7A) göre ased; bu sinyal epitopların protein çapraz-bağlantılar tarafından maskelenebilir olan PFA sabit doku, s-α-aktinin imüno tipik. Şekil 7B, filamentli aktin&#39;in eş canlandırılmasını göstermektedir miyofibril (ok uçları) içinde S-α-aktinin imüno trabeküler miyositlerde (oklar) bitişik endokardiyal hücreleri içinde ve ipliksi aktin. Üç boyutlu görüntü oluşturma ek ayrıntıları ortaya çıkarmıştır: tek tek kardiyomiyositlerde daha kolay kardiyomiyosit içinde Miyofibril kabaca birbirine paralel edildi ayırt edilmiştir, ancak tek tek kardiyomiyositlerde birbirinden (Şekil 7C ve D, film 1 ve Film 2 arasında değişen açılarda yönlendirilmiş ). endokardiyal hücreler ve kardiyomiyositlere arasındaki yakın yaklaşım iyi de üç boyutlu görünümler takdir edilmiştir. <html> &quot;&gt; <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52644/52644fig1.jpg" /> M serisi aktin filamentler üst üste miyozin lifleri, çapa yaparken Şekil 1. kardiyomiyosit sarkomer, interkalasyonlu diskler ve costameres. Z-disk, aktin filamentleri çapa. M serisi - - Z-disk ünitesi sarkomer bir Z-disk içerir. Seri olarak birden fazla sarkomer bir myofibril oluşturur. myofibril lateral ucu interkalasyonlu disk denilen özel bir hücre-hücre kavşak yapısına kardiyomiyosit enine sınırında içine ekler. Periferik kaslarında myofibriller kardiyomiyositlere arasındaki ekstraselüler matriks ile fokal yapışıklıklar oluşturan costameres aracılığıyla boyuna kardiyomiyosit plazma zarına bağlanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> pload / 52.644 / 52644fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. s-α -actinin ve embriyonik gün 16.5 β katenin immünofloresan. Kalp çıkarıldı, ek dondurulmuş, cryosectioned, aseton ile fikse edilmiş ve s-α-aktinin karşı (A), fare monoklonal klon EA53 antikoru kullanılarak immünohistokimyasal olarak boyanmış, burada etiketli kardiyomiyosit Z-disk ve birleştirilmiş diskler ve katenin β adherens birleşme proteinine karşı (B) tavşan polycloncal antikor. (C) Birleştirilmiş görüntüleri s-α-aktinin ve β katenin boyama gösterir. (D) Büyütülmüş paneli C ilgi alanı ; yıldızlarla işareti s-α-aktinin ve β katenin eş-lokalizasyonu ile birleştirilmiş diskleri tahmin. Görüntüler panelleri AC sol üst epikardiyal tabaka ile, periferik sol ventrikül duvar veya kompakt myokardda elde edilmiştir. O dışarı Yoğunluk histogram görüntü aralığı 460-1600 (f mümkün 0-65.535) hem s-α-aktinin / 488 nm ve β katenin / 561 nm lazer kanallar için. Ölçek çubuğu 10 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52644/52644fig3.jpg" /> Şekil 3. s-α -actinin ve embriyonik gün 16.5 1 integrin immünofloresan β. Kalp çıkarıldı, ek dondurulmuş, cryosectioned, aseton ile fikse edilmiş ve s-α-aktinin karşı (A), fare monoklonal antikoru EA53 klonu kullanılarak immunosteyn ve integrin β1 fokal yapışma proteinine karşı (B), keçi poliklonal antikor. (C) birleştirilmiş ve görüntüler kardiyomiyosit olarak β1 integrini ve non-kardiyomiyosit hücreleri göstermektedir. Not hem yaygın vekardiyomiyositler integrin β1 sinyali noktalı (D) Z-diskler s-α-aktinin-boyama yakındaki benzer dönemsellik panel C. Not punktat, periyodik β1 integrin boyama (oklar) ilgi alanı Büyütülmüş.; Bu yapıların costameres temsil edebilir. Çıkan sol ventrikül kompakt miyokard elde edilmiştir. Β1 integrin / 561 nm lazer kanal için s-α-aktinin / 488 nm lazer kanal ve 460-600 için (mümkünse 0-65.535 dışarı) Yoğunluk histogram görüntüleme aralığı 460-1200. Ölçek çubuğu 10 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52644/52644fig4.jpg" /> Şekil 4. s- α -actinin ve embriyonik gün 12.5 at tropomiyozin immünoflüoresans: myofibril organizasyonunda<html> trabeküler ve kompakt miyokard. yavru embriyolardan Kalpler eksize edildi, dondurulmuş, cryosectioned, aseton ile fikse edilmiş ve myofibril ince filaman karşı s-α-aktinin ve (B) fare monoklonal antikora karşı (A), fare monoklonal klon EA53 antikoru kullanılarak immunosteyn oturmaktadır Protein tropomiyozin (Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası CH1). Trabeküler (oklar) ve kompakt miyokard (ok başları) gösterilir. Sıkı tabakanın (A) puncta aynı zamanda lineer boyama dahil boyanma bir dizi kıyasla trabeküler miyokardiyumda normal periyodik doğrusal s-α-aktinin boyama, dikkat edin. Ayrıca kompakt miyokardiyumda trabeküler miyokardiyumda düzenli dönemsellik ama daha yaygın boyama ile doğrusal tropomiyozin boyama unutmayın. Tropomiyozin kanalı için s-α-aktinin kanalı ve 460-1,000 için (mümkünse 0-65.535 dışarı) Yoğunluk histogram görüntüleme aralığı 460-1,400. Ölçek çubuğu 10 mikron.&quot;Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52644/52644fig5.jpg" /> Şekil 5. s-α -actinin ve embriyonik gün 12.5 N-kadherin immünofloresan:. Trabeküler kardiyomiyositlerde Miyofibril ve araya diskler kalp çıkarıldı, ek dondurulmuş, cryosectioned, (A), fare monoklonal klon EA53 Aseton kullanılarak sabitlenmiş, ve immunosteyn s-α-aktinin ve fokal yapışma proteini, N-kaderin karşı (B), tavşan poliklonal antikora karşı antikor. 0.2 mikron optik dilim az yığını olarak toplandı ve z yığınları görüntüler oluşturmak için düzleştirilmiş edildi. (C) Birleştirilmiş basık yığınları trabeküler kardiyomiyositlere içinde N-kaderin ve s-α-aktinin boyama hem göstermek well Panel C ilgi Hoechst boyası ile etiketlenmiş çekirdekleri (D) Büyütülmüş alanı olarak.; yıldız s-α-aktinin ve N-kaderin ortak lokalizasyonu ile birleştirilmiş diskleri işaretleyin. S-α-aktinin / 488 nm ve N-kaderin / 561 nm lazer kanalları hem Hoechst / 405 nm lazer kanal için (mümkünse 0-65.535 dışarı) ve 470-2,000 Yoğunluk histogram görüntüleme aralığı 470-1,200. Ölçek çubuğu 10 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52644/52644fig6.jpg" /> Şekil 6. Anti-fare IgG (H + L), tek değerli Fab parçası etkili bir şekilde bloke endojen fare anti-fare ikincil antikorlar ile bağlanma IgG. Embriyonik kalp çıkarıldı E12.5, ek aseton sabitlenmiş, cryosectioned ve immunosteyn, donduruldu. <strong&gt; (AC) Bölümler, N-kaderin karşı s-α-aktinin ve tavşan poliklonal primer antikora karşı fare monoklonal klonu EA53 birincil antikor maruz, anti-fare IgG, tek değerli Fab fragmanı ve ardından 1 x bloke edici tampon ile bloke yıkandı ve maruz bırakıldı Alexa Fluor 488 anti-fare ve Alexa Fluor 586 anti-tavşan ikincil antikorlar. yoğunluk histogram görüntüleme aralığı 480-2500 kullanarak (A) Birleştirilmiş görüntünün (mümkünse 0-65.535 dışarı). Yıldızlarla notu bölgeler olan N-kaderin sinyali. Olasılıkla doğmakta interkalate diskleri temsil trabeküler kardiyomiyositlerinin, enine sonuna sınırlı (B) N-kaderin-tek yoğunluk histogram görüntüleme aralığı 480-2,500 kullanarak kanal edilir. (C) s-α -actinin sadece yoğunluk histogram görüntüleme aralığı 480-2,500 kullanarak kanal. (DG) Bölümler tavşan poliklonal maruz, 1x engelleme tampon sadece (hiçbir anti-fare IgG tek değerlikli Fab fragmanı engelleme adımı) ile bloke edildiN-kadherin, sadece (herhangi bir fare monoklonal birincil antikor) yıkandı ve Alexa Fluor 488, anti-fare ve Alexa Fluor 586 anti-tavşan sekonder antikor maruz bırakılmıştır. (D) karşı birincil antikor yoğunluğu histogram ekranı aralığı 480-2500 kullanarak görüntü birleştirilmiştir. (E) N-kaderin-tek yoğunluk histogram görüntüleme aralığı 480-2500 kullanarak kanal. (F) s-α-aktinin sadece yoğunluk histogram görüntüleme aralığı 480-2,500 kullanarak kanal. (G) s-α-aktinin-tek kanal kullanarak anti-fare IgG, tek değerli Fab parçası bloke aşamasının bulunmadığı ortamda, endojen fare IgG arka algılama ortaya yüksek hassasiyetli yoğunluk histogramı gösterge aralığı 480-530. (HK) Bölümler anti-fare IgG&#39;si ve ardından 1 x bloke edici tamponu ile bloke edilmiştir tek değerli Fab parçası, N-kadherin (herhangi bir fare monoklonal birincil antikor) yıkandı karşı tavşan poliklonal birincil antikora maruz bırakılır ve Alexa Fluor 488, anti-fare ve A maruzlexa Fluor 586 anti-tavşan ikincil antikorlar. (H) yoğunluk histogram görüntüleme aralığı 480-2,500 kullanarak görüntü birleşti. (I) N-kaderin-tek yoğunluk histogram görüntüleme aralığı 480-2,500 kullanarak kanal. (J) s-α-actinin- sadece kanal yoğunluğu histogram görüntüleme aralığı 480-2,500 kullanarak. (K) s-α-aktinin sadece arka plan endojen fare IgG tespiti eksikliği gösterir, yüksek hassasiyet yoğunluğu histogram görüntüleme aralığı 480-530 kullanarak kanal zaman anti-fare IgG tek değerlikli Fab fragmanı engelleme adımı kullanılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/52644/52644fig7.jpg" /> Şekil 7. s- α -actinin ve trabeküler Cardi aktin organizasyonus-α-aktinin karşı fare monoklonal klon EA53 antikor Z diskler ve birleştirilmiş diskler etiketlemek için kullanıldı olurken embriyonik gün 12,5 omyocytes. LifeAct-RFPruby transjenik fare soyu, lifli aktin 19 görselleştirmek için kullanılmıştır. Embriyolar PFA-tespit edildi. 0.2 um optik dilim az yığın olarak toplanmıştır (A) Düz z yığın s-α-aktinin boyama hızlı bir şekilde dondurulup aseton sabit bölümleri (Şekil 2-5) göre PFA sabit dokuda daha yaygın olduğunu gösteriyor.. (B ) Düz z yığın ipliksi aktin ve hem s-α-aktinin gösterir. Kaslarında myofibriller (ok uçları) içinde Z-diskler arasında lokalize İpliksi aktin floresan. İpliksi aktin floresan da trabeküler miyositleri (oklar) hat endokardiyal hücreler görüldü. (C) yığının üst bakıldığında trabeküler kardiyomiyositlerinin Üç boyutlu görünümü. (D) Üç boyutlu görünümtrabeküler kardiyomiyositler olarak yığının altından inceledi. Yoğunluk Histogram görüntüleme aralığı 470-900 (mümkün 0-65.535 dışarı) 488 nm lazer kanal ve A ve B 561 nm lazer kanal için hem; C ve D Ölçek bar 10 mikron her iki kanal için görüntü aralığı 460-800. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/Movie1.mov">Film</a> 1. S- α -actinin ve embriyonik günde 12.5 ile trabeküler kardiyomiyositlerde aktin örgütünün 360 ° dönme 3D görünümü. Şekil 6 görüntü yığını Fiji görüntü analiz programı dahilinde Resim J 3D Görüntüleyici eklentisi kullanarak üç boyutlu hale getirildi. Yoğunluk Histogram görüntüleme aralığı 470-800 (mümkün 0-65.535 dışarı) 488 nm ve 561 nm lazer kanalları hem. &lt;/ P&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/Movie2.mov">Film</a> 2. Embriyonik günde 12.5 ile trabeküler kardiyomiyositlerde s- α -actinin ve aktin örgütü Seçilmiş 3D görünümleri. Şekil 6 görüntü yığını Fiji görüntü analiz programı dahilinde Resim J 3D Görüntüleyici eklentisi kullanarak üç boyutlu hale getirildi. X, y ve z eksenleri etrafında küçük rotasyonlar nispeten kardiyomiyositlere ama çoğu kardiyomiyositlere arasındaki zayıf uyum içinde Miyofibril hizalanmış gösterdi. Küçük rotasyonlar da kardiyomiyositlere etrafında s-α-aktinin eksik endokardiyal hücrelerinin yakın yaklaşım gösterdi. Yoğunluk Histogram ekran aralığı 470-800 488 nm ve 561 nm lazer kanalları hem (mümkün 0-65.535 dışarı).

Konjenital kalp kusurlarına yol açan mutasyonlar, gelişim sırasında kardiyak yapının in vivo araştırılmasından yararlanır, ancak fare embriyonik kalbindeki yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmalar teknik olarak zordur. Burada, gelişmekte olan fare kalbindeki kardiyomiyosite özgü yapıları değerlendirmek için sağlam bir immünofloresan ve görüntü analizi yöntemi sunuyoruz.

Embriyonik Fare Heart Immunofluorescence kullanarak kardiyomiyosit Geliştirme Analizi

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan embriyonik fare kalbindeki miyofibril ve kardiyomiyosit olgunlaşmasını değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle embriyonik kalbin kesim ortamında yönlendirilip dondürülmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, kalp uygun yönelimde kriyoseksiyonla dilimlenir.Ardından, kalp kesitlerinde ilgilenilen proteinlerin immünofloresan işaretlemesi gerçekleştirilir. Son olarak, immün boyalı kalp kesitlerinin konfokal mikroskobisi yapılır. Nihayetinde, MyFi ve diğer kardiyomiyosit yapılarının gelişimini göstermek için iki boyutlu ve üç boyutlu görüntü analizleri kullanılır.Bu yöntem, mutasyonların ve kardiyak genlerin MyFi montajını ve interkalat diskler ile kostamerler gibi spesifik yapıların ortaya çıkışını nasıl etkilediği gibi, kardiyak gelişim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Embriyonik kalpleri aniden dondurmak için, bir kimyasal çeker ocakta 3,5 santimetrelik bir Petri kabını optimal kesme sıcaklığı veya OCT medyumu ile doldurun. Sıvı azot içerisinde iki metil bütan ile soğutun.Metin protokolüne uygun olarak fare embriyo kalpleri izole edildikten sonra, kalpler OCT içine yerleştirilir ve yedi milimetrelik OCT içeren bir kalıba aktarılmadan önce birkaç saniye boyunca dengelenmelerine izin verilir. Kalbin iç duvarı kalıbın tabanına gelecek şekilde yönlendirin. Kalıbı, sıvı nitrojen ile soğutulmuş iki metil bütan içerisine nazikçe yerleştirin.OCT katı beyaz renk alana kadar iki metil bütan sıvısının OCT veya kalp dondurucuyla temas etmemesine dikkat edin. Ardından kalıbı, içinde kuru buz bulunan bir buz kovasına aktarın. Tüm kalpler donduktan sonra, kriyokalıpları folyoya sarın ve kriyoseksiyon işlemine hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.Embriyonik kalpleri sabitlemek için, 12'li folyolu bir kültür plağının kuyucuklarını PBS içinde %4 PFA ile doldurun. Embriyonik kalpleri metin protokolüne uygun olarak çıkardıktan sonra, her bir kalbi PFA içeren bir kuyucuğa yerleştirin ve dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca sabitleyin. Kalpleri kriyoprotekte etmek için, plastik bir transfer pipeti kullanarak her bir kalbi, PBS içinde %15 sükroz içeren 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve kalp tüpün dibine çökene kadar dört derece santigrat sıcaklıkta nazikçe çalkalayın. Her bir kalbi PBS içinde %30 sükroza aktarın ve kalp tüpün dibine çökene kadar dört derece santigrat sıcaklıkta nazikçe çalkalayın.Embriyoları, bu videonun önceki kısımlarında gösterildiği gibi OCT içinde dondurun. Kriyokalıpları kriyostat haznesine yerleştirip sıcaklığı -17 °C'ye eşitledikten sonra, kriyokalıbı ters çevirin ve kalp bloğunu kalıptan çıkarmak için hafif bir basınç uygulayın. Kalbin ön duvarını, kalıplanmış doku bloğunun üst kısmına gelecek şekilde yönlendirin.Chuck üzerine büyük bir damla OCT yerleştirin ve kalp bloğunu OCT damlasının üzerine monte edin. Kalbin ön duvarı chuck'tan en uzak olacak şekilde yönlendirmeyi koruyun. Kalbin chuck üzerinde donmasını bekleyin.Mandreni ve üzerine monte edilmiş kalp bloğunu kriyostat nesne tutucusuna yerleştirin. Bıçağın açısını numuneye göre üç ila beş derece olacak şekilde ayarlayın. Pozitif yüklü bir kaplama ile ön işlem görmüş mikroskop lamlarına 10 mikrometrelik kesitler toplayın.İmmünofloresan uygulama öncesinde, örneklerin -80 °C'de saklanmadan önce tamamen kurumasını bekleyin. Kesitler fikse edildikten ve/veya OCT uzaklaştırıldıktan sonra, nazikçe çalkalayarak 45 dakika boyunca PBS ile seyreltilmiş 1x bloklama tamponu ile bloklama yapın. Farede üretilmiş bir primer antikor kullanılıyorsa, PBS %0,1 tween 20 içerisinde 1:100 oranında seyreltilmiş donkey veya goat anti mouse IgG H artı L monovalent FAB fragmanı ekleyin ve nazikçe çalkalayarak oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin.Bir katı bloklama tamponunda dilüe edilmiş primer antikor veya antikorları ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat veya 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası, kesitleri 1x PBS ile 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Oda sıcaklığında, bloklama tamponunda 1:500 oranında dilüe edilmiş konjuge sekonder antikoru örneklere ekleyin ve ışıdan koruyarak iki saat boyunca inkübe edin.Oda sıcaklığında, kesitleri ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 10 dakika boyunca üç kez XPBS ile yıkayın. Lamın her iki ucuna ikişer damla medium damlatarak lamları anti fade medium ile kapatın ve üzerini örtmek için bir lamelli kullanın. Lamelleri mühürlemek için oje kullanın.Görüntüleme aşamasına kadar 4 °C'de, ışıktan korunarak saklayın. 4x objektif ve lazer floresansı kullanarak örneği ve ilgilenilen alanı bulun. Harita olarak kullanmak üzere görüntüyü yakalayın.Yüksek büyütmede görüntüleme yaparken, lam tablasında minimum ayarlama yaparak lamı çıkarın. Ardından, 60 x immersiyon objektifine geçiş yapın.Objektifin üzerine küçük bir damla yağ damlatın ve lamı tekrar lam tablasına yerleştirin. Ardından, örneği yeniden bulun; her kanal için lazer gücünü, pozlama süresini ve binning ayarlarını istenen seviyelere getirin. Metin protokolündeki yönergelere göre optimal ayarlar belirlendikten sonra, deneydeki tüm doku kesitleri için bu örnek ayarlarını kullanın.Analiz için kullanılacak olan her kanal için optimal yoğunluk aralığını belirlemek amacıyla yoğunluk histogramını kullanın. Uygun lazer kanallarını seçerek görüntüleme fonksiyonunu kullanarak bir Z serisi oluşturun. Ardından Z serisinin üst ve alt sınırlarını belirleyin.Yazılım tarafından sağlanan optik kesit kalınlığının yarısı değerinde bir Zack adım boyutu seçin. Fiji veya benzeri bir görüntü analiz programını kullanarak görüntüleri toplamak için çalıştır (run) düğmesine tıklayın. Zack dosyasını, özel bir renk modu seçeneğiyle ve kanallar ayrı pencerelere bölünmüş şekilde açın.Görüntü açılır menüsünden parlaklık ve kontrast ayarı aracını açın ve her bir kanal için optimal histogram yoğunluk aralığını belirleyin. Daha önce belirlendiği üzere, bu kanal aralıklarını analiz edilen tüm Zacks örneklerine uygulayın. Ardından, görüntü renk açılır menüsünden, bireysel kanalları tek bir kompozit görüntüde birleştirin.Görüntü Yığınları (Image Stacks) Z proje menüsünü kullanarak kompozit görüntüden düzleştirilmiş bir Z yığını oluşturun. Bu görüntü 3D görüntüden önemli ölçüde daha parlak olacağından, aşırı doygunluğu önlemek için kontrol örneğinin histogram yoğunluk aralığını ayarlayın ve aynı ayarları deneysel düzleştirilmiş yığa uygulayın. 3D bir görüntü oluşturmak için önce görüntü yığınları 3D proje menüsünü seçin. Rotasyon için X eksenini veya Y eksenini seçin.Kesit aralığını, Z yığınının adım boyutuyla aynı mikron değerine ayarlayın. İstenen toplam rotasyonu seçin ve rotasyon açısı artışını bir olarak ayarlayın. Ardından, eklentiler açılır menüsünden Image J 3D görüntüleyiciyi açın.Birleşik görüntü oluşturma ekranını hacim (volume) olarak seçin ve yeniden örnekleme faktörünü bir veya ikiye ayarlayın. Bu şekiller, şok dondürülmüş ve asetonla fikse edilmiş bir kalpte farklı proteinlerin ko-boyaması için tipik sonuçları göstermektedir; S alfa aktinin karşıtı antikor, Z disklerini ve interkale diskleri yüksek özgünlükle ve minimum arka plan ile tekrarlanabilir şekilde işaretlemiştir. Adhezyon bağlantı proteini beta-katenin karşıtı antikor, hem kardiyomiyositlerin hem de kardiyomiyosit olmayan hücrelerin membranına bağlanmış ve E 16.5'te interkale disk olduğu tahmin edilen bölgelerde SFA aktinin ile kolokalizasyon gerçekleşmiştir. Embriyonik kalpte beta bir integrin immünofloresansı özellikle zorlayıcıdır, ancak bu çalışmalardaki beta bir integrin boyaması, SFA Aktinin ile işaretlenmiş Z diskleri ile aynı periyodisiteye sahip bir sinyal ortaya çıkarmıştır; bu durum muhtemelen E 16.5'te oluşmaya başlayan yeni kostamerleri yansıtmaktadır.E 12.5 aşamasında, SFA aktinin ve tropomiyozin boyama paterni, dış kompakt bölgedeki olgun miyofibrillerle uyumlu olarak trabeküler kardiyomiyositlerde düzenli bir periyodisite göstermiştir; SFA aktinin, lineer olmaktan ziyade daha noktasal bir görünüm sergilemiş ve tropomiyozin sinyali lineer yerine difüz kalmıştır. E 12.5 kalplerdeki NCA adherent boyama ve trabeküler kardiyomiyositler, muhtemelen interkale diskleri temsil eden yoğun SFA aktinin boyama alanları ile kolokalize olmuştur. Burada, life act RFP Ruby transgenik bir fareden alınan, SFA aktinin ve filamentli aktin için işaretlenmiş PFA ile fikse edilmiş E 12.5 embriyonik kalp gösterilmektedir. SFA aktin sinyal-gürültü oranı, şok dondurulmuş kalp kesitlerine kıyasla azalmıştır.Üç boyutlu görüntü rekonstrüksiyonu, bir kardiyomiyosit içindeki MyFi'ların yaklaşık olarak birbirine paralel olduğunu, ancak münferit kardiyomiyositlerin birbirlerine göre farklı açılarda yönlendiğini ortaya koymuştur. Bu videoyu izledikten sonra, embriyonik kalplerin nasıl doğru şekilde yönlendirileceği ve kriyoseksiyon yapılacağı ile fare kalp gelişimi sırasında MyFi ve kardiyomiyosit olgunlaşmasını değerlendirmek için immün boyama, konfokal mikroskopi ve görüntü analizi yöntemlerinin nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Admit.

analysis-cardiomyocyte-development-using-immunofluorescence-embryonic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Zebra balığı embriyonik kalp immün yapmak için hızlı bir şekilde açıklanmıştır. Tüm montaj immün yaklaşımı ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, çok daha az işlem süresi içinde kalp hücre / hücre içi yapıları ortaya yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde sağlayan antikorlar, penetrasyon önemli ölçüde artırır.

Zebra balığı Embriyonik Kalp Dissected, immün

Birincil fare kardiyomyosit kültürleri miyofibriler organizasyon ve fonksiyon soruşturma için önemli araçlardan biridir. Aşağıdaki protokol neonatal fare kalpleri birincil kardiyomiyositlerde izolasyonunu ve kültür açıklar. Elde edilen kültürler, daha sonra kardiyomiyosit biyomekanik, biyokimyasal ve hücre-biyolojik tahlillerin çeşitli için kullanılabilmektedir.

İzolasyon ve Kültür Yenidoğan Fare kardiyomiyositlerin

Biz, (E) 9.5 ve daha sonraki aşamalarında embriyonik gün fare embriyoları olan embriyonik veya pluripotent hücrelerinden elde edilen iç ve aşılanmış hücrelerden hücre kaderine ve fenotipi hem izlenmesi amacıyla, boyalar enjekte DNA vektörleri, virüs, ve hücreler, bir dizi yöntem tarif gelişme.

Embriyonik Fare Kalpler Gelişmekte Hücre Etiketleme ve Enjeksiyon

Bozulmamış embriyonik ve doğum sonrası kalplerin derinliklerindeki floresan protein etiketli hücreleri hacimsel olarak görüntülemek için bir protokol tanımlıyoruz. Tüm montaj boyama ile birlikte doku temizleme yöntemlerini kullanarak, embriyonik veya doğum sonrası bir kalbin içindeki tek floresan protein etiketli hücreler net ve doğru bir şekilde görüntülenebilir.

Görüntüleme Tek hücreli Çözünürlük embriyonik ve Postnatal Kalpleri Temizlendi

Biz optik açıklık ve konfokal mikroskobu ile takip standart immünolojik boyama yöntemleri kullanarak, E15.5 kadar bütün embriyonik fare kalplerinde koroner damarların analizi için bir protokol mevcut. Bu teknik, dizi bölgelerinin zaman alıcı analizi için gerek kalmadan tüm kalp boyunca kan damarlarının görselleştirme sağlar.

Temizlendi Embriyonik Kalpler Koroner Damarlar Analizi

Kardiyomiyositlerde hücre bölünmesini hücre döngüsü varyasyonlarından ayırt etmek için, iki transgenik fare hattı kullanarak protokoller sunuyoruz: kardiyomiyosit çekirdeklerinin kesin olarak tanımlanması için Myh6-H2B-mCh transgenik fareler ve hücre bölünmesini hücre döngüsü varyasyonlarından ayırt etmek için CAG-eGFP-anilin fareleri.

Doğum sonrası kardiyomiyositlerde Hücre Döngüsü Varyasyonları görselleştirme ve Çekirdeklenme Belirlenmesi

Burada, Bütün Dağı ayirt ve nicel hacimsel analizi erken sahne fare embriyo yansıma tabanlı bir protokol açıklayın. Bu teknik nitelik ve nicelik geliştirme sırasında kalp yapıları değerlendirmek ve diğer organ sistemleri yaygın olarak adapte olması teklif için güçlü bir yaklaşım olarak mevcut.

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

Bu yöntemde, embriyonik kalp dokuları cerrahi olarak microdissected, ayrışmış, fluorescently etiketli ve ana bilgisayar embriyonik dokuların implante vardır. Bu kişi veya doku düzeyinde gelişimsel organizasyon ektopik hemodinamik koşullar ve/veya değiştirilmiş parakrin/juxtacrine ortamlar altında eğitimi için bir platform sağlar.

Embriyonik Cardiomyocytes kuş embriyo implantasyonu Vivo için Mikroenjeksiyon tabanlı sistem

Biz bütün Dağı epifluorescent mikroskobu ventrikül belirli MLC-2v-tdTomato muhabir çakma fareler disseke fare embriyosu üzerinde kullanarak fare kalp geliştirme incelemek için protokolleri mevcut. Bu yöntem her aşamasında emek yoğun histochemical yöntemleri olmadan fare kalp geliştirme sırasında ventrikül oluşumu doğrudan görselleştirmek için bize izin verir.

Bütün Mount Epifluorescence kullanarak fare embriyogenez sırasında kalp odası gelişimin analizi

Kardiyak progenitör hücrelerin 3D + zaman görüntülemesini sağlayan fare embriyo kültürü ve görüntülemesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu video araç seti, başarılı canlı görüntüleme için gereken temel becerileri ele alır, aksi takdirde yalnızca metin yayınlarından elde edilmesi zordur.

Fare Embriyosundaki Erken Kardiyak Progenitörlerin Canlı Görüntülenmesi

Keşfedin embriyonik fare kalbinde kardiyomiyosit olgunlaşmasını immunofluoresans ve konfokal mikroskopi ile. Bu yöntem, kalp gelişimi ve doğuştan kalp defektleri araştırmalarında yüksek çözünürlüklü yapısal analiz sağlar.

Embriyonik Fare Heart Immunofluorescence kullanarak kardiyomiyosit Geliştirme Analizi

Daha fazla video keşfet