Embriyonik Fare Heart Immunofluorescence kullanarak kardiyomiyosit Geliştirme Analizi

Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan embriyonik fare kalbindeki miyofibril ve kardiyomiyosit olgunlaşmasını değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle embriyonik kalbin kesim ortamında yönlendirilip dondürülmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, kalp uygun yönelimde kriyoseksiyonla dilimlenir.

Ardından, kalp kesitlerinde ilgilenilen proteinlerin immünofloresan işaretlemesi gerçekleştirilir. Son olarak, immün boyalı kalp kesitlerinin konfokal mikroskobisi yapılır. Nihayetinde, MyFi ve diğer kardiyomiyosit yapılarının gelişimini göstermek için iki boyutlu ve üç boyutlu görüntü analizleri kullanılır.

Bu yöntem, mutasyonların ve kardiyak genlerin MyFi montajını ve interkalat diskler ile kostamerler gibi spesifik yapıların ortaya çıkışını nasıl etkilediği gibi, kardiyak gelişim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Embriyonik kalpleri aniden dondurmak için, bir kimyasal çeker ocakta 3,5 santimetrelik bir Petri kabını optimal kesme sıcaklığı veya OCT medyumu ile doldurun. Sıvı azot içerisinde iki metil bütan ile soğutun.

Metin protokolüne uygun olarak fare embriyo kalpleri izole edildikten sonra, kalpler OCT içine yerleştirilir ve yedi milimetrelik OCT içeren bir kalıba aktarılmadan önce birkaç saniye boyunca dengelenmelerine izin verilir. Kalbin iç duvarı kalıbın tabanına gelecek şekilde yönlendirin. Kalıbı, sıvı nitrojen ile soğutulmuş iki metil bütan içerisine nazikçe yerleştirin.

OCT katı beyaz renk alana kadar iki metil bütan sıvısının OCT veya kalp dondurucuyla temas etmemesine dikkat edin. Ardından kalıbı, içinde kuru buz bulunan bir buz kovasına aktarın. Tüm kalpler donduktan sonra, kriyokalıpları folyoya sarın ve kriyoseksiyon işlemine hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.

Embriyonik kalpleri sabitlemek için, 12'li folyolu bir kültür plağının kuyucuklarını PBS içinde %4 PFA ile doldurun. Embriyonik kalpleri metin protokolüne uygun olarak çıkardıktan sonra, her bir kalbi PFA içeren bir kuyucuğa yerleştirin ve dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca sabitleyin. Kalpleri kriyoprotekte etmek için, plastik bir transfer pipeti kullanarak her bir kalbi, PBS içinde %15 sükroz içeren 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve kalp tüpün dibine çökene kadar dört derece santigrat sıcaklıkta nazikçe çalkalayın. Her bir kalbi PBS içinde %30 sükroza aktarın ve kalp tüpün dibine çökene kadar dört derece santigrat sıcaklıkta nazikçe çalkalayın.

Embriyoları, bu videonun önceki kısımlarında gösterildiği gibi OCT içinde dondurun. Kriyokalıpları kriyostat haznesine yerleştirip sıcaklığı -17 °C'ye eşitledikten sonra, kriyokalıbı ters çevirin ve kalp bloğunu kalıptan çıkarmak için hafif bir basınç uygulayın. Kalbin ön duvarını, kalıplanmış doku bloğunun üst kısmına gelecek şekilde yönlendirin.

Chuck üzerine büyük bir damla OCT yerleştirin ve kalp bloğunu OCT damlasının üzerine monte edin. Kalbin ön duvarı chuck'tan en uzak olacak şekilde yönlendirmeyi koruyun. Kalbin chuck üzerinde donmasını bekleyin.

Mandreni ve üzerine monte edilmiş kalp bloğunu kriyostat nesne tutucusuna yerleştirin. Bıçağın açısını numuneye göre üç ila beş derece olacak şekilde ayarlayın. Pozitif yüklü bir kaplama ile ön işlem görmüş mikroskop lamlarına 10 mikrometrelik kesitler toplayın.

İmmünofloresan uygulama öncesinde, örneklerin -80 °C'de saklanmadan önce tamamen kurumasını bekleyin. Kesitler fikse edildikten ve/veya OCT uzaklaştırıldıktan sonra, nazikçe çalkalayarak 45 dakika boyunca PBS ile seyreltilmiş 1x bloklama tamponu ile bloklama yapın. Farede üretilmiş bir primer antikor kullanılıyorsa, PBS %0,1 tween 20 içerisinde 1:100 oranında seyreltilmiş donkey veya goat anti mouse IgG H artı L monovalent FAB fragmanı ekleyin ve nazikçe çalkalayarak oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin.

Bir katı bloklama tamponunda dilüe edilmiş primer antikor veya antikorları ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat veya 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası, kesitleri 1x PBS ile 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Oda sıcaklığında, bloklama tamponunda 1:500 oranında dilüe edilmiş konjuge sekonder antikoru örneklere ekleyin ve ışıdan koruyarak iki saat boyunca inkübe edin.

Oda sıcaklığında, kesitleri ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 10 dakika boyunca üç kez XPBS ile yıkayın. Lamın her iki ucuna ikişer damla medium damlatarak lamları anti fade medium ile kapatın ve üzerini örtmek için bir lamelli kullanın. Lamelleri mühürlemek için oje kullanın.

Görüntüleme aşamasına kadar 4 °C'de, ışıktan korunarak saklayın. 4x objektif ve lazer floresansı kullanarak örneği ve ilgilenilen alanı bulun. Harita olarak kullanmak üzere görüntüyü yakalayın.

Yüksek büyütmede görüntüleme yaparken, lam tablasında minimum ayarlama yaparak lamı çıkarın. Ardından, 60 x immersiyon objektifine geçiş yapın.

Objektifin üzerine küçük bir damla yağ damlatın ve lamı tekrar lam tablasına yerleştirin. Ardından, örneği yeniden bulun; her kanal için lazer gücünü, pozlama süresini ve binning ayarlarını istenen seviyelere getirin. Metin protokolündeki yönergelere göre optimal ayarlar belirlendikten sonra, deneydeki tüm doku kesitleri için bu örnek ayarlarını kullanın.

Analiz için kullanılacak olan her kanal için optimal yoğunluk aralığını belirlemek amacıyla yoğunluk histogramını kullanın. Uygun lazer kanallarını seçerek görüntüleme fonksiyonunu kullanarak bir Z serisi oluşturun. Ardından Z serisinin üst ve alt sınırlarını belirleyin.

Yazılım tarafından sağlanan optik kesit kalınlığının yarısı değerinde bir Zack adım boyutu seçin. Fiji veya benzeri bir görüntü analiz programını kullanarak görüntüleri toplamak için çalıştır (run) düğmesine tıklayın. Zack dosyasını, özel bir renk modu seçeneğiyle ve kanallar ayrı pencerelere bölünmüş şekilde açın.

Görüntü açılır menüsünden parlaklık ve kontrast ayarı aracını açın ve her bir kanal için optimal histogram yoğunluk aralığını belirleyin. Daha önce belirlendiği üzere, bu kanal aralıklarını analiz edilen tüm Zacks örneklerine uygulayın. Ardından, görüntü renk açılır menüsünden, bireysel kanalları tek bir kompozit görüntüde birleştirin.

Görüntü Yığınları (Image Stacks) Z proje menüsünü kullanarak kompozit görüntüden düzleştirilmiş bir Z yığını oluşturun. Bu görüntü 3D görüntüden önemli ölçüde daha parlak olacağından, aşırı doygunluğu önlemek için kontrol örneğinin histogram yoğunluk aralığını ayarlayın ve aynı ayarları deneysel düzleştirilmiş yığa uygulayın. 3D bir görüntü oluşturmak için önce görüntü yığınları 3D proje menüsünü seçin. Rotasyon için X eksenini veya Y eksenini seçin.

Kesit aralığını, Z yığınının adım boyutuyla aynı mikron değerine ayarlayın. İstenen toplam rotasyonu seçin ve rotasyon açısı artışını bir olarak ayarlayın. Ardından, eklentiler açılır menüsünden Image J 3D görüntüleyiciyi açın.

Birleşik görüntü oluşturma ekranını hacim (volume) olarak seçin ve yeniden örnekleme faktörünü bir veya ikiye ayarlayın. Bu şekiller, şok dondürülmüş ve asetonla fikse edilmiş bir kalpte farklı proteinlerin ko-boyaması için tipik sonuçları göstermektedir; S alfa aktinin karşıtı antikor, Z disklerini ve interkale diskleri yüksek özgünlükle ve minimum arka plan ile tekrarlanabilir şekilde işaretlemiştir. Adhezyon bağlantı proteini beta-katenin karşıtı antikor, hem kardiyomiyositlerin hem de kardiyomiyosit olmayan hücrelerin membranına bağlanmış ve E 16.5'te interkale disk olduğu tahmin edilen bölgelerde SFA aktinin ile kolokalizasyon gerçekleşmiştir. Embriyonik kalpte beta bir integrin immünofloresansı özellikle zorlayıcıdır, ancak bu çalışmalardaki beta bir integrin boyaması, SFA Aktinin ile işaretlenmiş Z diskleri ile aynı periyodisiteye sahip bir sinyal ortaya çıkarmıştır; bu durum muhtemelen E 16.5'te oluşmaya başlayan yeni kostamerleri yansıtmaktadır.

E 12.5 aşamasında, SFA aktinin ve tropomiyozin boyama paterni, dış kompakt bölgedeki olgun miyofibrillerle uyumlu olarak trabeküler kardiyomiyositlerde düzenli bir periyodisite göstermiştir; SFA aktinin, lineer olmaktan ziyade daha noktasal bir görünüm sergilemiş ve tropomiyozin sinyali lineer yerine difüz kalmıştır. E 12.5 kalplerdeki NCA adherent boyama ve trabeküler kardiyomiyositler, muhtemelen interkale diskleri temsil eden yoğun SFA aktinin boyama alanları ile kolokalize olmuştur. Burada, life act RFP Ruby transgenik bir fareden alınan, SFA aktinin ve filamentli aktin için işaretlenmiş PFA ile fikse edilmiş E 12.5 embriyonik kalp gösterilmektedir. SFA aktin sinyal-gürültü oranı, şok dondurulmuş kalp kesitlerine kıyasla azalmıştır.

Üç boyutlu görüntü rekonstrüksiyonu, bir kardiyomiyosit içindeki MyFi'ların yaklaşık olarak birbirine paralel olduğunu, ancak münferit kardiyomiyositlerin birbirlerine göre farklı açılarda yönlendiğini ortaya koymuştur. Bu videoyu izledikten sonra, embriyonik kalplerin nasıl doğru şekilde yönlendirileceği ve kriyoseksiyon yapılacağı ile fare kalp gelişimi sırasında MyFi ve kardiyomiyosit olgunlaşmasını değerlendirmek için immün boyama, konfokal mikroskopi ve görüntü analizi yöntemlerinin nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Admit.