Name: Doğum sonrası kardiyomiyositlerde Hücre Döngüsü Varyasyonları görselleştirme ve Çekirdeklenme Belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Keşfedin, transgenik fare hatları kullanarak kardiyomiyositlerde hücre döngüsü aktivitesini görselleştirme ve çekirdeklenme belirleme yöntemlerini. Bu teknik, kardiyak rejenerasyon araştırmalarında hücre bölünmesi ile ploidi değişikliklerini ayırt etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teknik yardımları için S. Grünberg (Bonn, Almanya) ve P. Freitag'a (Bonn, Almanya) teşekkür ederiz.

<ol><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324 (5923), 98-102 (2009).</li>
<li>Raulf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+systems+for+unequivocal+identification+of+cardiac+myocyte+nuclei+and+analysis+of+cardiomyocyte+cell+cycle+status%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res.Cardiol%22%5BJournal%5D)">Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status.</a> Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33(2015).</li>
<li>Field, C. M., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin%2C+a+contractile+ring+protein+that+cycles+from+the+nucleus+to+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex.</a> J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).</li>
<li>Hesse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+cell+division+using+high-resolution+imaging+of+M-phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Commun%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle.</a> Nat.Commun. 3, 1076(2012).</li>
<li>Eulalio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+identifies+miRNAs+inducing+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration.</a> Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).</li>
<li>Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors+induces+cardiomyocyte+re-entry+in+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle.</a> J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).</li>
<li>Hosoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonality+of+mouse+and+human+cardiomyogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).</li>
<li>Soonpaa, M. H., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cardiomyocyte+DNA+synthesis+in+normal+and+injured+adult+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts.</a> Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).</li>
<li>Ang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).</li>
<li>Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16889791">Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation.</a> J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Cell+Generation+and+Turnover+in+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart.</a> Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

kardiyomiyositlerde hücre döngüsünü tekrar girin ve yaralanma sonrası ve doku homeostazında sırasında bölmek mümkün olmadığı üzerinde bir tartışma vardır. Kardiyomiyositlerinin temel ciro değerleri% 1 1 ve% 80 7 aralığında verilmiştir. % 40 - 7 da kardiyak lezyon sonrası, hücre döngüsü aktivitesinin indüksiyonu ve yeni kardiyomiyositlerde üretimi 0.0083,% 8 ve 25 arasında değerler ile, sınır bölgesinde bildirilmiştir. Bu uyum...

kardiyomiyosit çekirdekleri ve hücre döngüsü durumu doğru tespiti kalp kası ciro ve yenilenme belirlenmesi için büyük önem taşımaktadır. Bu hücre siklusunu tanımlamak için bu tür pHH3, Ki-67, ya da Timidin analogları gibi, nükleer belirteçleri, kullanımı için de geçerlidir. Erişkin memeli kardiyomiyositlerinin proliferatif kapasitesi 1, bir çoğalma tahlilinde sonucu önemli bir fark olabilir bir kardiyomyosit çekirdeğin proliferasyon belirteci için pozitif bir çekirdeğin bir sahte kimlik, çok küçük olduğu için. Ayrıca, kardiyomiyositlerde poliploid ve çok çekirdekli hücrelerde yerine hücre bölünmesi sonucu bu endoreduplication ve acytokinetic mitoz hücre döngüsünde varyasyonları, yatkındır. Bu amaçla, genel hücre döngüsü belirteçleri karşı antikor boyama yorumlanması her durumda kesin değildir. Burada, biz düz forwa için yöntemler mevcut<html> rd fare kardiyomiyositlerinin tanınması ve bunların çekirdeklerin kesin tanımlanması ile doğum sonrası ve yetişkin aşamalarında yerli izole hücreler ve kalın doku kesitlerinde onların nuclearity. Bu amaçla, Myh6 promoteri (Myh6-H2B-MCH) kontrolü altında insan histon H2B ve mCherry oluşan bir füzyon proteininin kardiyomiyosit spesifik ifadesi ile bir transgenik fare hattı 2 kullanıldı. Bir EGFP-anillin füzyon proteinin ekspresyonu, bir CMV artırıcı ile yerde tavuk aktin promoterinin kontrolü altında olduğu bir transgenik proliferasyon göstergesi fare hattı ile fare hattı, çapraz yetiştirme (CAG-EGFP-anillin) sağlar hücre döngüsü durumunun belirlenmesi. Iskeleler proteini anillin özel olarak etkin olan hücreler 3 hücre döngüsü olarak ifade edilir ve hücre döngüsü sırasında ayırıcı hücre içi lokalizasyonu M faz yüksek çözünürlüğe sahip canlı izleme hücre döngüsü ilerlemesi sağlarEF &quot;&gt; 4. Bu nedenle, çift transgenik fareler çoğalan kardiyomiyositlerde ve hücre döngüsü şekilde değişikliklere uğrar olanlar arasında ayrım yapmak için kullanılabilir. Bu, in vitro proliferasyon uyaran maddelerin taranmasında özellikle faydalı olduğu ortaya çıkmaktadır.

<table><tbody><tr><td>10 cm Petri kabı</td><td>Sarstedt 821472</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 & m hücreli süzgeç</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Bütandion monoksit (BDM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>G20x1 &frac12; enjeksiyon kanülü, Sterican</td><td>Braun, Melsungen</td><td>4657519</td><td></td></tr><tr><td>20 gauge iğne</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>301300</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu plakalar</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>2-Metil-bütan</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>%37 formaldehit çözeltisi</td><td>AppliChem GmbH&nbsp;</td><td>A0936,1000</td><td></td></tr><tr><td>3 musluk</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>16494C</td><td></td></tr><tr><td>50 mL şırınga</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>8728810F</td><td></td></tr><tr><td>% 70 etanol</td><td>Otto Fischar GmbH</td><td>27669</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor konjuge ikincil antikor</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-605-205</td><td></td></tr><tr><td>Alfa-aktinin EA-53, Fare IgG</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Mikroplakası, 96 Kuyu, Yarım Alan</td><td>Greiner bio-one</td><td>675986</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz B</td><td>Roche</td><td>11088815001</td><td></td></tr><tr><td>konfokal mikroskop Eclipse Ti-E</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kriyostat CM 3050S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>eşek serumu</td><td>Jackson İmmüno Araştırma, Suffolk, GB</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>fetal buzağı serumu</td><td>PromoCell, Heidelberg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit çözeltisi (%4)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3697</td><td></td></tr><tr><td>Domuz derisinden elde edilen jelatin, Tip A</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>cam lameller</td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Heidelberger uzatma tüpü</td><td>IMPROMEDIFORM GmbH</td><td>MF 1833</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natrium</td><td>Ratiopharm</td><td>5394.02.00</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HistoBond mikroskop slaytları</td><td>Marienfeld</td><td>0810000</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (1&nbsp; mg/mL)</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin şırıngası</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>300334</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s DeğiştirildiDulbecco' s Medium (IMDM)</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Corning</td><td>354221</td><td></td></tr><tr><td>Lazer Tarama Mikroskobu Eclipse Ti</td><td>Nikoninstruments, D&uuml; sseldorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>13778075</td><td></td></tr><tr><td>Fare IgG Cy5 (eşek)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-175-151</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>mikrosantrifüj tüpü</td><td>Sarstedt</td><td>72690</td><td></td></tr><tr><td>Mini çalkalayıcı</td><td>VWR</td><td>12620-940</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA taklitçisi, has-miR199a-3p</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4464066</td><td></td></tr><tr><td>Biyopsi Kalıbı</td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>M-slayt 8 kuyulu ibiTreat</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck Millipore</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>negatif kontrol (şifreli RNA)</td> <td>Ambion / Thermo Fischer Scientific</td><td>AM4611</td><td></td></tr><tr><td>Yenidoğan Kalp Ayrışma Kiti</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach</td><td>130-098-373</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elemanları AR 4.12.01-4.30.02-64bit</td><td>Nikoninstruments, D&uuml; sseldorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asitler, NEAA</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstad</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM, İndirgenmiş Serum Ortamı</td><td>Gibco</td><td>51985-026</td><td></td></tr><tr><td>P21-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>P27-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>DABCO&reg;, solma önleyici</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10981</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>1007885</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>AM9780 ile polivinil alkol montaj ortamı</td><td></td></tr><tr><td>numune kapları</td><td>Vitlab</td><td>80731</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipet</td><td>Greiner</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>yazılımı NIS Elemanları</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT Bileşik</td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>ToPro3 iyodür (642/661)</td><td>Moleküler problar/ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>Buğday tohumu aglütininin (WGA) Floresein etiketli</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>VEC-FL-1021-5</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-aktinin antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

doğum sonrası kardiyomiyositlerde hücre döngüsü varyasyonları görselleştirme ve Çekirdeklenme belirlenmesi

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Kardiyomiyositler, endoredupulite (karyokinez ve sitokinez olmadan devam eden DNA sentezi turları) ve asitokinetik mitoz (karyokinez ancak sitokinez yok) gibi hücre döngüsünün varyasyonlarına eğilimlidir. Bu tür atipik hücre döngüsü varyasyonları, hücre bölünmesinden ziyade poliploid ve çok çekirdekli hücrelerle sonuçlanır. Bu nedenle, kardiyak döngü ve rejenerasyonu belirlemek için kardiyomiyosit çekirdeklerini, hücre başına düşen çekirdek sayısını ve hücre döngüsü durumlarını doğru bir şekilde tanımlamak çok önemlidir. Bu, özellikle timidin analogları Ki-67, PCNA veya pHH3 gibi hücre döngüsü aktivitesini tanımlamak için nükleer belirteçlerin kullanımı için geçerlidir. Burada, kardiyomiyositleri ve nükleerliklerini tanımak ve hücre döngüsü aktivitelerini belirlemek için yöntemler sunuyoruz. Yayınlanmış iki transgenik sistem kullanıyoruz: kardiyomiyosit çekirdeklerinin kesin olarak tanımlanması için Myh6-H2B-mCh transgenik fare hattı ve hücre bölünmesini hücre döngüsü varyasyonlarından ayırt etmek için CAG-eGFP-anilin fare hattı. Bir araya getirildiğinde, bu iki sistem kardiyak rejenerasyon ve plastisite çalışmasını kolaylaştırır.

In vitro doğum sonrası kardiyomiyositlerinin çift transgenik Myh6-H2B-AÇS / CAG-eGFP-anillin farelerin kardiyomiyositlerinin hücre döngüsü aktivitesi üzerine siRNA&#39;lar / miRNA&#39;ların etkilerini analiz etmek için doğum sonrası 3. günde (P3) üzerine izole edildi ve transfekte hücre döngüsü aktivitesi indükleyici miR199 5, siRNA p27&#39;yi ve siRNA Fzr1. Negatif kontrol (Şekil 1A) ile karşılaştırıldığında, miR199- (Şekil 1 b)<...

Kardiyomiyositlerde hücre bölünmesini hücre döngüsü varyasyonlarından ayırt etmek için, iki transgenik fare hattı kullanarak protokoller sunuyoruz: kardiyomiyosit çekirdeklerinin kesin olarak tanımlanması için Myh6-H2B-mCh transgenik fareler ve hücre bölünmesini hücre döngüsü varyasyonlarından ayırt etmek için CAG-eGFP-anilin fareleri.

Doğum sonrası kardiyomiyositlerde Hücre Döngüsü Varyasyonları görselleştirme ve Çekirdeklenme Belirlenmesi

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Bu prosedürün genel amacı, postnatal kardiyomiyositlerde hücre döngüsü aktivitesini görselleştirmek ve nükleerite durumlarını belirlemektir. Bu yöntem, kardiyak rejenerasyon alanındaki "bir kardiyomiyosit gerçekten bölünür mü, yoksa sadece ploidisini mi artırır veya çok çekirdekli mi hale gelir?" gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, hücre döngüsünün M fazının yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükte görselleştirilebilmesi ve kardiyomiyosit çekirdeklerinin floresan yöntemiyle tanımlanabilmesidir.Prosedürü laboratuvarımızdan teknisyen Patricia Freitag uygulamalı olarak gösterecek. Homozigot olmayan çiftleşme çiftleri kullanılıyorsa, öncelikle EGFP analin ve H2B-mCherry ekspresyonlarını kontrol etmek için transgenik kalpler floresan mikroskopi aracılığıyla belirlenmelidir. EGFP analin nükleer sinyalleri, doku katmanları boyunca odaklanarak atriyumların kenarlarında en kolay şekilde tespit edilebilir.Kardiyomiyositleri izole etmek için, uygun sayıda kalbi, neonatal kalp disosiasyon kitinden alınan bir mililitre enzim karışımı içeren 1,5 mililitrelik reaksiyon tüplerine yerleştirin ve kalpleri makasla küçük parçalara bölün. Ardından, çözeltiyi 15 mililitrelik reaksiyon tüplerine aktarın. Tüpü 37 °C'de yaklaşık 15 dakika boyunca neredeyse yatay bir konumda tutun ve inkübasyonun sonunda dokuyu beş mililitrelik bir pipetle beş ila 10 kez karıştırın.Üçüncü sindirimin sonunda, reaksiyonu 7.5 milliliters ortam iki ile durdurun ve hücre süspansiyonunu 70 micron hücre süzgecinden süzün. Hücre süzgecini üç milliliters ortam iki ile yıkayın, yıkama sıvısını toplanan hücrelerle birleştirin ve hücreleri santrifüj ile toplayın. Sayım için pelletini 500 microliters ortam bir içerisinde yeniden süspande edin.Ardından, 96 kuyucuklu düz tabanlı bir plakadaki her kuyucuğa 120 µL medium one içerisinde 1x10⁴ hücre ekleyin ve hücreleri bir hücre kültürü inkübatöründe gece boyunca kültüre etmeden önce santrifüjleyin. Ertesi gün, kardiyomiyositlerin çoğu atmaya başlamış olmalıdır. Transfeksiyona başlamadan önce, herhangi bir RNazı uzaklaştırmak için tezgahı ve tüm transfeksiyon malzemelerini RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile silin.Tüm malzemeler hazır olduğunda, her kuyucuğa taze hazırlanmış siRNA karışımından 20 µL ekleyin ve hücreleri 48 saat boyunca inkübatöre geri koyun. İki gün sonra, her kuyucuktaki süpernatantı 120 µL medium one ile değiştirin ve hücreleri en az 24 saat daha inkübatöre geri koyun. İnkübasyonun sonunda, hücreleri bir kez PBS ile yıkayın ve ardından %4'lük formaldehit çözeltisinde 20 dakika boyunca fiksasyon işlemini gerçekleştirin.Hücreleri konfokal video mikroskopisi ile analiz etmek için plakayı konfokal mikroskop tablasına yerleştirin ve görüntüleme yazılımını başlatın. A1plus ayarlarını açın ve bir, iki, üç ve dört numaralı kanal kutucuklarını işaretleyin. Açılır menüden kanal bir'i DAPI, kanal iki'yi eGFP, kanal üç'ü RFP ve kanal dört'ü Cy5 olarak ayarlayın.Kanal voltajına tıklayın ve her kanal için voltajı 80'e ayarlamak için kaydırma çubuklarını kullanın. Ofseti sıfıra ayarlamak için kaydırma çubuklarını kullanın ve pinhole'u başlangıç konumuna getirmek için ana sayfa düğmesine tıklayın. Açılır menüden tarama boyutunu 1024 by 1024 piksel olarak ayarlayın.XYZ boyut kurulum penceresini açmak için optimize'ye tıklayın ve önerilen adım Z altındaki mükemmel voksel kutucuğunu işaretleyin. 20x objektifini seçin ve görüntü ne eksik ne de fazla pozlanmış olana kadar lazer yoğunluklarını ayarlayın. Tüm parametreler ayarlandığında, acquire menüsünü açın. scan large image seçeneğini belirleyin, ardından alan altından current position is at top left corner seçeneğini seçin.Ardından, X ve Y eksenlerindeki alan sayısını üç çarpı üç olarak ayarlayın ve tarama (scan) düğmesine tıklayın. Kardiyomiyosit çekirdeklerinin sayısını belirlemek için ölçüm (measure), manuel ölçüm (manual measurement) ve sayımlar (counts) seçeneklerine tıklayın. H2B-mCherry sinyallerine sahip çekirdekleri seçerek onları işaretleyin ve sayın.Ardından, kardiyomiyosit sayısını belirlemek için alfa-aktinin pozitif hücreleri seçin. Nükleer EGFP analin sinyallerine sahip G1, S, G2 fazındaki kardiyomiyositleri saymak için ölçüm (measure), manuel ölçüm (manual measurement) ve sayımlar (counts) seçeneklerini belirleyin. EGFP analin ve H2B-mCherry eksprese eden çekirdekleri tıklayarak işaretleyin ve kontraktil halkalar ile orta gövdeler gibi mitoz spesifik EGFP analin sinyallerine sahip kardiyomiyositleri manuel olarak sayın.Ardından, ölçüm, manuel ölçüm ve sayımlar seçeneklerine tıklayın ve mitoz spesifik EGFP analin sinyalleri, sitoplazmik sinyaller, kontraktil halkalar ve mid-body yapıları içeren kardiyomiyositleri tıklayarak seçin. Negatif kontrollerle karşılaştırıldığında, miRNA ve siRNA transfekte edilmiş kardiyomiyositler, hücre döngüsü aktivitesinde bir indüksiyon göstermektedir. Endoreduplikasyon gerçekleştiren kardiyomiyositler yalnızca nükleer EGFP analin ekspresyonu sergilerken, hücre bölünmesi geçiren kardiyomiyositler, EGFP analin ekspresyonunu M evresine özgü tipik lokalizasyonlarda göstermektedir.Langendorff aparatındaki kalp dokusunun enzimatik sindiriminden sonra, atriyumlar ve ventriküller mekanik olarak ayrılabilir ve bağımsız olarak analiz edilebilir; bu sayede, yüksek sayıda H2B-mCherry pozitif bi-nükleat kardiyomiyosit içeren H2B-mCherry transgenik ventriküler kardiyomiyositlerin görüntülenmesi mümkün olur. Buna karşılık, atriyal kardiyomiyositlerin çoğunluğu mono-nükleattır. Enzimatik sindirim %100 tek hücreli bir popülasyonla sonuçlanmaz; ancak alfa-aktinin boyaması ile ortaya çıkan enine çizgili örüntü, bi-nükleat kardiyomiyositlerin sürekli bir enine çizgili örüntü olarak hücre dubletlerinden ayırt edilmesini daha da kolaylaştırır.Kalın kesitlerdeki kardiyomiyositlerin bi-nükleasyon indeksini analiz etmek için, çekirdeklerin mutlaka tek bir Z-düzleminde yer almaması nedeniyle yığının manuel olarak kaydırılması gerekir; bu süreçte hücre sınırlarının tespitine buğday germi aglutinin boyaması olanak tanır. Erişkin transgenik fare kalplerinin fikse edilmiş kesitlerinin 3D rekonstrüksiyonları, doku içerisindeki fizyolojik koşullarda bulunan kardiyomiyosit çekirdeklerinin oranını belirlemek amacıyla kancalı, boyanmış ve H2B-mCherry pozitif çekirdeklerin tespitine ve otomatik sayımına imkan verir. Uzmanlaşıldığında, kalp disosiyasyonu doğru şekilde gerçekleştirilirse iki ila üç saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken, deney boyunca hücrelerin canlılığını korumak için kesintisiz çalışmaya özen göstermek önemlidir. Bu prosedürün ardından, mikroRNA'ların veya diğer küçük maddelerin postnatal kardiyomiyositlerdeki proliferasyon indükleyici etkileri taranabilir.

visualization-cell-cycle-variations-determination-nucleation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz büyük bir tedarik kardiyovasküler onarım için insan kalp atalarıdır ve fonksiyonel kardiyomiyositlerde türetilmesi sağlayan küçük moleküller ile tanımlanmış koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan cardioblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

Kardiyak çekirdeklerin yoğunluğu sedimentasyon ile izole edilmiş ve akım sitometri kardiyomiyosit çekirdeklerinin belirlemek ve sıralamak için pericentriolar malzeme 1 (PCM-1) karşı antikorlar ile immunolabeled edilir.

Post-mortem Doku gelen kardiyomiyosit Çekirdeklerin İzolasyonu

Pluripotent kök hücreler, embriyonik veya uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri ya, kardiyomiyositler dahil olmak üzere insan farklılaşmış hücrelerin, değerli bir kaynak oluşturmaktadır. Burada, bir embriyoid organları tabanlı protokol ile fonksiyonel insan kardiyomiyositlerin elde etmek için bunları nasıl kullanacağınızı gösteren, iPS hücrelerin kalp indüksiyon üzerinde durulacak.

İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü

Makale verimli seçici referans belirteçlerinin analizi nüfusun homojenliği ve kimliğini değerlendirmek için flow sitometri ile takip Wnt yolu, modüle göre kardiyomiyositlere insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmek için ayrıntılı yöntem anlatılmaktadır.

Sitometrisi ile Yüksek Verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin Farklılaşma ve Karakterizasyonu

Konjenital kalp kusurlarına yol açan mutasyonlar, gelişim sırasında kardiyak yapının in vivo araştırılmasından yararlanır, ancak fare embriyonik kalbindeki yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmalar teknik olarak zordur. Burada, gelişmekte olan fare kalbindeki kardiyomiyosite özgü yapıları değerlendirmek için sağlam bir immünofloresan ve görüntü analizi yöntemi sunuyoruz.

Embriyonik Fare Heart Immunofluorescence kullanarak kardiyomiyosit Geliştirme Analizi

Kardiyomiyosit döngüsünün ölçülmesi zordur. Burada açıklanan protokol, neo-kardiyomiyosit çekirdek oluşumu ve çekirdek ploidisinin doğru ve hassas bir şekilde ölçülmesini sağlayarak bu zorluğa önemli bir katkı sağlar.

Kardiyomiyosit DNA Sentezi ve ploidinin Eşzamanlı Değerlendirme: Bir Yöntem kardiyomiyosit Yenilenme ve ciro miktarının belirlenmesi Yrd

Bozulmamış embriyonik ve doğum sonrası kalplerin derinliklerindeki floresan protein etiketli hücreleri hacimsel olarak görüntülemek için bir protokol tanımlıyoruz. Tüm montaj boyama ile birlikte doku temizleme yöntemlerini kullanarak, embriyonik veya doğum sonrası bir kalbin içindeki tek floresan protein etiketli hücreler net ve doğru bir şekilde görüntülenebilir.

Görüntüleme Tek hücreli Çözünürlük embriyonik ve Postnatal Kalpleri Temizlendi

Geleneksel yöntemler, insan pluripotent süspansiyon toplam bazlı kalp farklılaşma hücreleri (hPSCs) agrega boyutu ve şekli açısından kültür heterojenite ile rahatsız edilir kaynaklanıyor başlatmak için. Burada, boyut kontrollü hPSC kalp teşvik koşullar altında kültüre agrega üretmek için mikro istihdam kalp farklılaşma için sağlam bir yöntem açıklanmaktadır.

İnsan pluripotent kök hücrelerin Süspansiyon tabanlı Kardiyak Farklılaşma için mikro Agrega boyutu Optimizasyon

Bu el yazması, Gata4, Hand2, Mef2c ve Tbx5'in retrovirüs aracılı bir iletimini kullanarak çeşitli yeniden programlanmış kardiyak alt tiplerin oluşturulması ve ölçülmesi için adım adım bir protokolü açıklar.

Fare embriyonik fibroblastlar transkripsiyon faktör aracılı yeniden programlanması sonra kardiyomiyosit alt tiplerini değerlendirilmesi

Bu çalışmanın amacı, kardiyomiyositleri yetişkin kalpten tekrarlıca izole etmek ve DNA içeriğini ve nükleasyonu ölçmek için bir yöntem geliştirmektir.

İmmünsitokimya ve Ploidi Analizi için Sabit Kalplerden Kardiyomiyositlerin İzolasyon

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), klinik öncesi kardiyotoksisite taraması için hayvanların kullanılmasına bir alternatif sunar. Preklinik toksisite taramasında hiPSC-CM'lerin yaygın olarak benimsenmesinin bir sınırlaması, hücrelerin olgunlaşmamış, fetal benzeri fenotipidir. Burada hiPSC-CM'lerin sağlam ve hızlı olgunlaşması için protokoller sunulmaktadır.

Olgun İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyosit Monokatmanları Kullanılarak Yüksek Verimli Kardiyotoksisite Taraması

Keşfedin, transgenik fare hatları kullanarak kardiyomiyositlerde hücre döngüsü aktivitesini görselleştirme ve çekirdeklenme belirleme yöntemlerini. Bu teknik, kardiyak rejenerasyon araştırmalarında hücre bölünmesi ile ploidi değişikliklerini ayırt etmeyi sağlar.

Doğum sonrası kardiyomiyositlerde Hücre Döngüsü Varyasyonları görselleştirme ve Çekirdeklenme Belirlenmesi

Daha fazla video keşfet