Doğum sonrası kardiyomiyositlerde Hücre Döngüsü Varyasyonları görselleştirme ve Çekirdeklenme Belirlenmesi

Bu prosedürün genel amacı, postnatal kardiyomiyositlerde hücre döngüsü aktivitesini görselleştirmek ve nükleerite durumlarını belirlemektir. Bu yöntem, kardiyak rejenerasyon alanındaki "bir kardiyomiyosit gerçekten bölünür mü, yoksa sadece ploidisini mi artırır veya çok çekirdekli mi hale gelir?" gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, hücre döngüsünün M fazının yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükte görselleştirilebilmesi ve kardiyomiyosit çekirdeklerinin floresan yöntemiyle tanımlanabilmesidir.

Prosedürü laboratuvarımızdan teknisyen Patricia Freitag uygulamalı olarak gösterecek. Homozigot olmayan çiftleşme çiftleri kullanılıyorsa, öncelikle EGFP analin ve H2B-mCherry ekspresyonlarını kontrol etmek için transgenik kalpler floresan mikroskopi aracılığıyla belirlenmelidir. EGFP analin nükleer sinyalleri, doku katmanları boyunca odaklanarak atriyumların kenarlarında en kolay şekilde tespit edilebilir.

Kardiyomiyositleri izole etmek için, uygun sayıda kalbi, neonatal kalp disosiasyon kitinden alınan bir mililitre enzim karışımı içeren 1,5 mililitrelik reaksiyon tüplerine yerleştirin ve kalpleri makasla küçük parçalara bölün. Ardından, çözeltiyi 15 mililitrelik reaksiyon tüplerine aktarın. Tüpü 37 °C'de yaklaşık 15 dakika boyunca neredeyse yatay bir konumda tutun ve inkübasyonun sonunda dokuyu beş mililitrelik bir pipetle beş ila 10 kez karıştırın.

Üçüncü sindirimin sonunda, reaksiyonu 7.5 milliliters ortam iki ile durdurun ve hücre süspansiyonunu 70 micron hücre süzgecinden süzün. Hücre süzgecini üç milliliters ortam iki ile yıkayın, yıkama sıvısını toplanan hücrelerle birleştirin ve hücreleri santrifüj ile toplayın. Sayım için pelletini 500 microliters ortam bir içerisinde yeniden süspande edin.

Ardından, 96 kuyucuklu düz tabanlı bir plakadaki her kuyucuğa 120 µL medium one içerisinde 1x10⁴ hücre ekleyin ve hücreleri bir hücre kültürü inkübatöründe gece boyunca kültüre etmeden önce santrifüjleyin. Ertesi gün, kardiyomiyositlerin çoğu atmaya başlamış olmalıdır. Transfeksiyona başlamadan önce, herhangi bir RNazı uzaklaştırmak için tezgahı ve tüm transfeksiyon malzemelerini RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile silin.

Tüm malzemeler hazır olduğunda, her kuyucuğa taze hazırlanmış siRNA karışımından 20 µL ekleyin ve hücreleri 48 saat boyunca inkübatöre geri koyun. İki gün sonra, her kuyucuktaki süpernatantı 120 µL medium one ile değiştirin ve hücreleri en az 24 saat daha inkübatöre geri koyun. İnkübasyonun sonunda, hücreleri bir kez PBS ile yıkayın ve ardından %4'lük formaldehit çözeltisinde 20 dakika boyunca fiksasyon işlemini gerçekleştirin.

Hücreleri konfokal video mikroskopisi ile analiz etmek için plakayı konfokal mikroskop tablasına yerleştirin ve görüntüleme yazılımını başlatın. A1plus ayarlarını açın ve bir, iki, üç ve dört numaralı kanal kutucuklarını işaretleyin. Açılır menüden kanal bir'i DAPI, kanal iki'yi eGFP, kanal üç'ü RFP ve kanal dört'ü Cy5 olarak ayarlayın.

Kanal voltajına tıklayın ve her kanal için voltajı 80'e ayarlamak için kaydırma çubuklarını kullanın. Ofseti sıfıra ayarlamak için kaydırma çubuklarını kullanın ve pinhole'u başlangıç konumuna getirmek için ana sayfa düğmesine tıklayın. Açılır menüden tarama boyutunu 1024 by 1024 piksel olarak ayarlayın.

XYZ boyut kurulum penceresini açmak için optimize'ye tıklayın ve önerilen adım Z altındaki mükemmel voksel kutucuğunu işaretleyin. 20x objektifini seçin ve görüntü ne eksik ne de fazla pozlanmış olana kadar lazer yoğunluklarını ayarlayın. Tüm parametreler ayarlandığında, acquire menüsünü açın. scan large image seçeneğini belirleyin, ardından alan altından current position is at top left corner seçeneğini seçin.

Ardından, X ve Y eksenlerindeki alan sayısını üç çarpı üç olarak ayarlayın ve tarama (scan) düğmesine tıklayın. Kardiyomiyosit çekirdeklerinin sayısını belirlemek için ölçüm (measure), manuel ölçüm (manual measurement) ve sayımlar (counts) seçeneklerine tıklayın. H2B-mCherry sinyallerine sahip çekirdekleri seçerek onları işaretleyin ve sayın.

Ardından, kardiyomiyosit sayısını belirlemek için alfa-aktinin pozitif hücreleri seçin. Nükleer EGFP analin sinyallerine sahip G1, S, G2 fazındaki kardiyomiyositleri saymak için ölçüm (measure), manuel ölçüm (manual measurement) ve sayımlar (counts) seçeneklerini belirleyin. EGFP analin ve H2B-mCherry eksprese eden çekirdekleri tıklayarak işaretleyin ve kontraktil halkalar ile orta gövdeler gibi mitoz spesifik EGFP analin sinyallerine sahip kardiyomiyositleri manuel olarak sayın.

Ardından, ölçüm, manuel ölçüm ve sayımlar seçeneklerine tıklayın ve mitoz spesifik EGFP analin sinyalleri, sitoplazmik sinyaller, kontraktil halkalar ve mid-body yapıları içeren kardiyomiyositleri tıklayarak seçin. Negatif kontrollerle karşılaştırıldığında, miRNA ve siRNA transfekte edilmiş kardiyomiyositler, hücre döngüsü aktivitesinde bir indüksiyon göstermektedir. Endoreduplikasyon gerçekleştiren kardiyomiyositler yalnızca nükleer EGFP analin ekspresyonu sergilerken, hücre bölünmesi geçiren kardiyomiyositler, EGFP analin ekspresyonunu M evresine özgü tipik lokalizasyonlarda göstermektedir.

Langendorff aparatındaki kalp dokusunun enzimatik sindiriminden sonra, atriyumlar ve ventriküller mekanik olarak ayrılabilir ve bağımsız olarak analiz edilebilir; bu sayede, yüksek sayıda H2B-mCherry pozitif bi-nükleat kardiyomiyosit içeren H2B-mCherry transgenik ventriküler kardiyomiyositlerin görüntülenmesi mümkün olur. Buna karşılık, atriyal kardiyomiyositlerin çoğunluğu mono-nükleattır. Enzimatik sindirim %100 tek hücreli bir popülasyonla sonuçlanmaz; ancak alfa-aktinin boyaması ile ortaya çıkan enine çizgili örüntü, bi-nükleat kardiyomiyositlerin sürekli bir enine çizgili örüntü olarak hücre dubletlerinden ayırt edilmesini daha da kolaylaştırır.

Kalın kesitlerdeki kardiyomiyositlerin bi-nükleasyon indeksini analiz etmek için, çekirdeklerin mutlaka tek bir Z-düzleminde yer almaması nedeniyle yığının manuel olarak kaydırılması gerekir; bu süreçte hücre sınırlarının tespitine buğday germi aglutinin boyaması olanak tanır. Erişkin transgenik fare kalplerinin fikse edilmiş kesitlerinin 3D rekonstrüksiyonları, doku içerisindeki fizyolojik koşullarda bulunan kardiyomiyosit çekirdeklerinin oranını belirlemek amacıyla kancalı, boyanmış ve H2B-mCherry pozitif çekirdeklerin tespitine ve otomatik sayımına imkan verir. Uzmanlaşıldığında, kalp disosiyasyonu doğru şekilde gerçekleştirilirse iki ila üç saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü uygularken, deney boyunca hücrelerin canlılığını korumak için kesintisiz çalışmaya özen göstermek önemlidir. Bu prosedürün ardından, mikroRNA'ların veya diğer küçük maddelerin postnatal kardiyomiyositlerdeki proliferasyon indükleyici etkileri taranabilir.