Doğum sonrası kardiyomiyositlerde Hücre Döngüsü Varyasyonları görselleştirme ve Çekirdeklenme Belirlenmesi

Bu prosedürün genel amacı, doğum sonrası kardiyomiyositlerde hücre döngüsü aktivitesini görselleştirmek ve nükleerliklerini belirlemektir. Bu yöntem, bir kardiyomiyosit gerçekten bölünüyor mu yoksa sadece ploidisini mi artırıyor yoksa çok çekirdekli mi hale geliyor? Bu tekniğin temel avantajları, hücre döngüsünün M fazının yüksek uzay-zamansal çözünürlükte görselleştirilebilmesi ve kardiyomiyosit çekirdeklerinin floresan ile tanımlanabilmesidir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Patricia Freitag olacaktır. Homozigot olmayan üreme çiftleri kullanılıyorsa, EGFP analin ve H2B-mCherry ekspresyonlarını kontrol etmek için önce transgenik kalpleri floresan mikroskobu ile tanımlayın. EGFP analiti nükleer sinyalleri, doku katmanlarına odaklanarak kulakçıkların kenarlarında en kolay şekilde tespit edilebilir.

Kardiyomiyositleri izole etmek için, bir yenidoğan kalp ayrışma kitinden bir mililitre enzim karışımı içeren 1,5 mililitrelik reaksiyon tüplerine uygun sayıda kalp yerleştirin ve kalpleri makasla küçük parçalara ayırın. Daha sonra çözeltiyi 15 mililitrelik reaksiyon tüplerine aktarın. Tüpü 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede neredeyse yatay bir konuma yerleştirin ve inkübasyonun sonunda dokuyu beş mililitrelik bir pipetle beş ila 10 kez karıştırın.

Üçüncü sindirimin sonunda, 7.5 mililitre ikinci ortam ile reaksiyonu durdurun ve hücre süspansiyonunu 70 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün. Hücre süzgecini üç mililitre orta iki ile durulayın, yıkamayı toplanan hücrelerle bir araya getirin ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Saymak için peleti 500 mikrolitre orta boyda tekrar askıya alın.

Daha sonra, 96 oyuklu düz tabanlı bir plakada 120 mikrolitre ortamda, bir kere on ila dördüncü hücreyi tohumlayın ve hücreleri, bir hücre kültürü inkübatöründe gece boyunca kültürlerinden önce santrifüjleyin. Ertesi gün, kardiyomiyositlerin çoğu atıyor olmalıdır. Transfeksiyona başlamadan önce, herhangi bir RNAse'ı çıkarmak için tezgahı ve tüm transfeksiyon malzemelerini RNAse dekontaminasyon solüsyonu ile silin.

Tüm malzemeler hazır olduğunda, her bir oyuğa 20 mikrolitre taze hazırlanmış siRNA karışımı ekleyin ve hücreleri 48 saat boyunca inkübatöre geri koyun. İki gün sonra, her bir oyuktaki süpernatanı 120 mikrolitre orta boy ile değiştirin ve hücreleri en az 24 saat daha inkübatöre geri koyun. İnkübasyonun sonunda, hücreleri bir kez PBS ile yıkayın, ardından 20 dakika boyunca% 4 formaldehit çözeltisinde fiksasyon yapın.

Hücreleri konfokal video mikroskobu ile analiz etmek için plakayı konfokal mikroskop aşamasına aktarın ve görüntüleme yazılımını başlatın. A1plus ayarlarını açın ve kanal bir, iki, üç ve dört kutularını işaretleyin. Açılır menüde, birinci kanalı DAPI'ye, ikinci kanalı eGFP'ye, üçüncü kanalı RFP'ye ve dördüncü kanalı Cy5'e ayarlayın.

Kanal voltajına tıklayın ve her kanal için voltajı 80'e ayarlamak için kaydırma çubuklarını kullanın. Ofseti sıfıra ayarlamak için kaydırma çubuklarını kullanın ve iğne deliğini ana konuma ayarlamak için ana sayfa düğmesine tıklayın. Açılır menüde tarama boyutunu 1024 x 1024 piksel olarak ayarlayın.

XYZ boyutu kurulum penceresini açmak için optimize et'e tıklayın ve önerilen adım Z'nin altındaki mükemmel voksel kutusunu işaretleyin. 20x objektifi seçin ve resim ne az ne de fazla pozlanana kadar lazer yoğunluklarını ayarlayın. Tüm parametreler ayarlandığında, edinme menüsünü açın. Büyük görüntüyü tara'yı seçin, ardından alanın altında sol üst köşede geçerli konumu seçin.

Ardından X ve Y'deki alan sayısını üçe üç olarak ayarlayın ve tara'yı tıklayın. Kardiyomiyosit çekirdeğinin sayısını tanımlamak için ölçüm, manuel ölçüm ve sayımlar'a tıklayın. H2B-mCherry sinyalleriyle çekirdekleri seçin, böylece işaretleyin ve sayın.

Ardından, kardiyomiyositlerin sayısını belirlemek için alfa-aktinin pozitif hücreleri seçin. Nükleer EGFP analin sinyallerine sahip G1, S, G2 faz kardiyomiyositlerini saymak için ölçüm, manuel ölçüm ve sayımları seçin. EGFP analin ve H2B-mCherry eksprese eden çekirdekleri tıklama ile işaretleyin ve kasılma halkaları ve orta gövdeler gibi mitoza özgü EGFP analin sinyalleri ile kardiyomiyositleri manuel olarak sayın.

Ardından, ölçüm, manuel ölçüm ve sayımlara tıklayın ve mitoza özgü EGFP analin sinyalleri, sitoplazmatik sinyaller, kasılma halkaları ve orta gövdelere sahip kardiyomiyositlere tıklayın. Negatif kontrollerle karşılaştırıldığında, miRNA ve siRNA transfekte edilmiş kardiyomiyositler, hücre döngüsü aktivitesinin indüksiyonunu gösterir. Endoreduplicatiasyon yapan kardiyomiyositler sadece nükleer EGFP analin ekspresyonu sergilerken, hücre bölünmesi geçiren kardiyomiyositler M fazı tipik lokalizasyonlarında EGFP analin ekspresyonu gösterirler.

Langendorff cihazında kalp dokusunun enzimatik sindiriminden sonra, atriyumlar ve ventriküller mekanik olarak ayrılabilir ve bağımsız olarak analiz edilebilir, bu da yüksek sayıda H2B-mCherry pozitif bi-çekirdekli kardiyomiyosit içeren H2B-mCherry transgenik ventriküler kardiyomiyositlerin görselleştirilmesine izin verir. Buna karşılık, atriyal kardiyomiyositlerin çoğu tek çekirdeklidir. Enzimatik sindirim, alfa-aktinin boyaması ile bir çapraz çizgilenme paterni ortaya çıkaran %100 tek hücreli bir popülasyonla sonuçlanmaz, bu da sürekli bir çapraz çizgilenme ve hücre çiftleri modeli olarak iki çekirdekli kardiyomiyositler arasındaki ayrımı daha da kolaylaştırır.

Kalın dilimler halinde kardiyomiyositlerin bi-çekirdeklenme indeksini analiz etmek için, çekirdeklerin mutlaka bir Z-düzlemi içinde yer alması gerekmediğinden, yığını manuel olarak kaydırmak gerekir, buğday tohumu aglütininin boyanması hücrenin tespitine izin verir borders. 3D yetişkin transgenik fare kalplerinin sabit dilimlerinin rekonstrüksiyonları, kancaların algılanmasına ve otomatik olarak sayılmasına izin verir, dokudaki fizyolojik koşullar altında kardiyomiyosit çekirdeklerinin oranını belirlemek için boyanmış ve H2B-mCherry pozitif çekirdekler. Bir kez ustalaştıktan sonra, uygun şekilde yapılırsa kalp ayrışması iki ila üç saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü denerken, deney boyunca hücrelerin canlılığını korumak için sürekli çalışmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, mikroRNA'ları veya diğer küçük maddeleri doğum sonrası kardiyomiyositlerde proliferasyona neden olan etkileri açısından taramak mümkündür.