Colocalizational Analizi Reseptör Sonrası içselleştirme Ticareti Uyuşturucu kaynaklı Değişiklikleri İzleme
3 Temmuz 2015
Reseptör ticareti ligandlarına sinyal ve hücre yanıt modüle ve kendisi ligand bağlı sinyal dahil olmak üzere hücre koşulları, yanıt verici olmaktadır. Burada, biz kantitatif immün ve colocalizational analizi kullanılarak ilaca bağlı reseptör ticaretini değerlendirmek için güçlü ve esnek bir teknik açıklar.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, hedef çiftlerin mekansal kolokalizasyonunu nicel olarak değerlendirmek, bu durumda ilaca bağlı reseptör kaçakçılığını incelemektir. Bu, değiştirilmiş reseptör kaçakçılığını indüklemek için canlı kültürlenmiş hücrelerin ilaçla muamele edilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, hedef reseptörlerin ve hücre içi kaçakçılık kompartmanlarının çift immün etiketlemesi, hedef çiftlerin çok kanallı konfokal mikroskopi ile uzamsal lokalizasyonuna izin verir.
Kantitatif kolokalizasyon analizi, hedef reseptörlerin ve kompartmanların aynı yerde bulunma eğilimini ölçmek için kullanılır. Sonuçlar, reseptörlerin ve hücre içi kaçakçılık kompartmanlarının kolokalizasyonuna dayalı olarak ilaç tedavisini takiben reseptör kaçakçılığındaki değişiklikleri göstermektedir. Bu tekniğin bindirme kolokalizasyonu gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, daha sonra çok daha güçlü analizlere ve karmaşık deneysel tasarımlara izin veren niceliksel kolokalizasyon ölçümleri sağlamasıdır.
Bu yöntem reseptör trafiği hakkında bilgi sağlayabilse de, kültürlenmiş hücrelerdeki hemen hemen her iki proteinin uzamsal kolokalizasyonundaki değişikliklere de uygulanabilir. Bu prosedüre başlamak için, orijinal büyüme ortamını çıkarın ve seçilen konsantrasyonda ilgilenilen ilacı içeren ortamla değiştirin. Daha sonra, seçilen tedavi süresi boyunca hücreleri orijinal büyüme koşullarında inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, hücreleri her seferinde üç kez bir mililitre yıkama tamponu ile nazikçe yıkayın. Hücreleri 300 mikrolitre %4 para formaldehit ile 0.1 molar PBS'de 37 santigrat derecede 10 dakika sabitleyin. Daha sonra hücreleri her seferinde üç kez bir mililitre yıkama tamponu ile tekrar yıkayın.
Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında iki saat boyunca 300 mikrolitre bloke edici tampon içinde inkübe edin. Daha sonra, hücreleri birincil antikor ile 300 mikrolitre antikor seyreltici içinde dört santigrat derecede 48 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra hücreleri her seferinde üç kez bir mililitre yıkama tamponu ile nazikçe yıkayın.
Daha sonra, hücreleri bir saatlik oda sıcaklığında 300 mikrolitre antikor seyreltici içinde Fluor'a konjuge edilmiş ikincil antikor ile inkübe edin ve hücreleri ışıktan koruyun. Bir saat sonra, hücreleri her seferinde üç kez bir mililitre yıkama tamponu ile nazikçe yıkayın. Kapak kızağını 24 oyuklu plakadan çıkarmak için, plakayı 45 derecelik tutun.
Bir çift ince forsepsin ucunu, kapak kaymasının üst kenarına, kuyu zeminiyle birleştiği yere yerleştirin. Ardından, yıkama tamponundaki kapak kızağını kuyu tabanından uzağa yavaşça eğin. Kapak kayması, forseps ile kolayca çıkarılabileceği kuyu duvarına dayanacaktır.
Ardından, 100 x yüksek büyütme objektifi kullanarak solma önleyici montaj ortamına sahip mikroskop slaytlarına hücreler aşağı bakacak şekilde kapak fişlerini monte edin. İlk olarak, epi floresan kullanılarak görüntülenecek temsili bir hücre bulun. Ardından, görüntü yakalama ayarlarını yapılandırın: Her kanalı sırayla görüntülemek ve son görüntü için ortalama dört ila altı tarama yapmak için etiketli her kanalın sekiz bit sıkıştırılmamış tiff görüntülerini kaydedin.
Ardından konfokal görüntüleme yoluna geçin ve hücrenin merkezinden geçen bir Z düzlemine odaklanın. Her kanal için iğne deliği lazer gücünü ve fotoğraf çarpanı tüp voltajını ve ofsetini optimize edin. Bu ayarları kaydedin ve herhangi bir hedef çift için etiketlenmiş tüm hücreleri görüntülemek için aynı ayarları kullanın.
Aynı şekilde, yüksek büyütme objektifi ile görüntülenecek sonraki konum belirleyici hücreleri çoğaltın. Epi floresan kullanarak, konfokal görüntüleme yoluna geçin ve varsa hücrenin merkezinden geçen bir Z düzlemine odaklanın. Tarama alanını ilgilenilen hücreyle sınırlamak için yazılım yakınlaştırma kırpma işlevini kullanın. Sonra.
Daha önce oluşturulan ayarları kullanarak etiketli her kanal için görüntü yakalayın ve çoğaltma başına koşul başına 15 veya daha fazla hücre görüntülemek için yordamları tekrarlayın. Yeterli numune toplanmasını sağlamak. Bu yordamda, J görüntüsündeki bir hücrenin görüntü çiftini açın.RGB görüntüsü oluşturmak için görüntü renk birleştirme kanalları komutunu kullanın.
Sonra ilgilendiğiniz hücrenin etrafını çizin. Seçilen hücredeki hedeflerin birlikte yerelleştirilmesini ölçmek için SC yerelleştirmesini j eklentisi olarak kullanın. İstenen yerelleştirme ölçüsünü kaydedin ve her görüntü hücresi için prosedürü tekrarlayın.
Ardından, her bir etiketleme koşulunun her bir kopyasının ortak kontrol koşullarının kaydedilen kolokalizasyon değerlerinin ortalamasını hesaplayın. Her etiketleme koşulundaki her çoğaltma için ofseti elde etmek için ortalamaları eksi bir ile çarpın. Ardından, her etiketleme koşulundaki her çoğaltma için uzaklığı, bu çoğaltmadaki her bir yerelleştirme değerine ekleyin.
Bu, verileri, ortak kontrol koşulu için ortalama kolokalizasyon ölçüsü, her etiketleme koşulunun her bir kopyasının her birinde sıfır olacak şekilde normalleştirecektir. Bundan sonra, her bir etiketleme koşulunun tüm kopyalarından elde edilen tüm veriler, kopyalar arasında kolokalizasyondaki değişikliklerin analizine izin verecektir Burada, uzun süreli ve akut ilaç tedavilerine maruz kalan dorsal kök ganglion duyusal nöronlarının birincil kültürleri gösterilmektedir. Hücreler daha sonra delta opioid reseptörleri ve farklı primer ikincil antikor çiftlerine sahip endozomların geri dönüştürülmesinin bir belirteci için immün olarak etiketlendi ve iki kanallı ardışık konfokal mikroskopi ile görüntülendi.
Müteakip kantitatif kolokalizasyon ve analize ek olarak, bu temsili görüntüler, burada gösterilen yanlış renk kolokalizasyon haritaları oluşturmak için işlendi. Delta opioid reseptörleri ve erken endozom geri dönüşüm endozomları ve lizozom reseptör kolokalizasyonu belirteçleri için ortalama kolokalizasyon skorları, farklı akut ilaç tedavileri alan gruplar arasında karşılaştırıldı ve reseptör kaçakçılığında ilaca bağlı değişiklikler gözlendi. Bu prosedürü denerken, geçerli kantitatif analize izin vermek için yüksek kaliteli tutarlı mikrograflar edinmeyi unutmamak önemlidir.
Bu videoyu izledikten sonra, kantitatif kolokalizasyon analizinin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, immünolabelleme ve kolokalizasyon analizi yoluyla ilaç kaynaklı reseptör trafiğini kantitatif olarak değerlendirmek için bir teknik sunar. İlaçlarla tedavi edilmiş canlı kültür hücrelerini inceleyerek, hedef reseptörlerin ve trafik bölümlerinin mekansal lokalizasyonu, çok kanallı konfokal mikroskopi kullanılarak analiz edilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Farmakoloji
Arka Plan
- Reseptör trafiği, hücrelerin ligandlara tepkisini etkiler.
- Hücre koşulları, reseptör trafiğini etkileyebilir.
- Mevcut kolokalizasyon analizi yöntemleri kantitatif ölçümlerden yoksun olabilir.
- Kantitatif kolokalizasyon analizi, deneysel tasarımı geliştirebilir.
Çalışmanın Amacı
- Reseptörlerin ve trafik bölümlerinin mekansal kolokalizasyonunu değerlendirmek.
- İlaç tedavisi sonrası reseptör trafiğindeki değişiklikleri değerlendirmek.
- Geleneksel örtüşme kolokalizasyonuna kıyasla daha güçlü bir analiz yöntemi sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Reseptör trafiği değişikliklerini indüklemek için canlı kültür hücrelerini ilaçlarla tedavi etmek.
- Hedef reseptörlerin ve trafik bölümlerinin çift immünolabellemesi.
- Mekansal lokalizasyon için çok kanallı konfokal mikroskopi kullanmak.
- Reseptör ve bölüm yakınlığını ölçmek için kantitatif kolokalizasyon analizi uygulamak.
Ana Sonuçlar
- İlaç tedavisi sonrası reseptör trafiğindeki değişiklikler gösterildi.
- Kolokalizasyonun kantitatif ölçümleri elde edildi.
- Reseptörler ve trafik bölümleri önemli mekansal kolokalizasyon gösterdi.
- Teknik, karmaşık deneysel tasarım ve analizlere olanak tanır.
Sonuçlar
- Teknik, reseptör trafiğini incelemek için sağlam bir yöntem sunar.
- Kantitatif analiz, reseptörlerin ilaçlara tepkisindeki davranışı anlamayı geliştirir.
- Bu yaklaşım, sinirbilim ve farmakolojideki çeşitli deneysel bağlamlara uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative colocalizational analysis of drug-induced receptor trafficking provides biopharma R&D teams with a robust, reproducible approach to interrogate receptor dynamics at the cellular level. This method enhances predictive confidence in target validation by enabling precise measurement of receptor localization changes in response to pharmacological interventions. Integrating these quantitative insights supports risk-adjusted decision-making at key discovery and preclinical inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of receptor trafficking mechanisms following drug exposure.
- Supports functional target validation by measuring spatial colocalization with intracellular compartments.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct visualization and quantification of receptor-compartment interactions.
- Provides normalized, statistically analyzable data for robust hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cellular systems for downstream compound screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible colocalization metrics for assay development.
- Enables high-content, quantitative readouts suitable for comparative analysis across conditions.
- Supports scalability and platform reuse by applying the protocol to diverse receptor-compartment pairs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns receptor trafficking data with disease-relevant cellular models when applicable.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by providing quantitative endpoints.
- Reduces translational risk by linking drug-induced trafficking changes to functional cellular outcomes.
- Supports biomarker strategy development through spatial quantification of receptor localization.
Pipeline & Workflow Integration
This quantitative colocalizational analysis method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with downstream translational research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven testing of drug effects on receptor trafficking and compartmentalization.
- Screening: Provides reproducible, quantitative colocalization outputs for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Generates normalized colocalization scores for robust statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment of cellular trafficking data with disease models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, broadly applicable workflow for diverse receptor and protein localization studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable quantitative outputs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust data for portfolio triage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative image analysis.
- Demands access to high-quality imaging instrumentation and analytical software (e.g., ImageJ with colocalization plugins).
- Necessitates rigorous cross-team standardization of imaging and analysis parameters.
- Adaptable to various cell types and receptor-compartment pairs with protocol optimization.
- Dependent on acquisition of high-quality, consistent micrographs for valid quantitative analysis.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:25
Drug Treatment of Cultured Cells and Immunocytochemistry
3:26
Microscope Settings and Imaging
4:57
Colocalization Analysis and Data Normalization
6:17
Results: Representative Photomicrographs of Receptor and Compartment-marker Labeling with False-color Colocalization Maps
7:18
Conclusion
