Colocalizational Analizi Reseptör Sonrası içselleştirme Ticareti Uyuşturucu kaynaklı Değişiklikleri İzleme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hedef çiftlerin mekansal kolokalizasyonunu nicel olarak değerlendirmek, bu durumda ilaca bağlı reseptör kaçakçılığını incelemektir. Bu, değiştirilmiş reseptör kaçakçılığını indüklemek için canlı kültürlenmiş hücrelerin ilaçla muamele edilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, hedef reseptörlerin ve hücre içi kaçakçılık kompartmanlarının çift immün etiketlemesi, hedef çiftlerin çok kanallı konfokal mikroskopi ile uzamsal lokalizasyonuna izin verir.

Kantitatif kolokalizasyon analizi, hedef reseptörlerin ve kompartmanların aynı yerde bulunma eğilimini ölçmek için kullanılır. Sonuçlar, reseptörlerin ve hücre içi kaçakçılık kompartmanlarının kolokalizasyonuna dayalı olarak ilaç tedavisini takiben reseptör kaçakçılığındaki değişiklikleri göstermektedir. Bu tekniğin bindirme kolokalizasyonu gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, daha sonra çok daha güçlü analizlere ve karmaşık deneysel tasarımlara izin veren niceliksel kolokalizasyon ölçümleri sağlamasıdır.

Bu yöntem reseptör trafiği hakkında bilgi sağlayabilse de, kültürlenmiş hücrelerdeki hemen hemen her iki proteinin uzamsal kolokalizasyonundaki değişikliklere de uygulanabilir. Bu prosedüre başlamak için, orijinal büyüme ortamını çıkarın ve seçilen konsantrasyonda ilgilenilen ilacı içeren ortamla değiştirin. Daha sonra, seçilen tedavi süresi boyunca hücreleri orijinal büyüme koşullarında inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, hücreleri her seferinde üç kez bir mililitre yıkama tamponu ile nazikçe yıkayın. Hücreleri 300 mikrolitre %4 para formaldehit ile 0.1 molar PBS'de 37 santigrat derecede 10 dakika sabitleyin. Daha sonra hücreleri her seferinde üç kez bir mililitre yıkama tamponu ile tekrar yıkayın.

Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında iki saat boyunca 300 mikrolitre bloke edici tampon içinde inkübe edin. Daha sonra, hücreleri birincil antikor ile 300 mikrolitre antikor seyreltici içinde dört santigrat derecede 48 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra hücreleri her seferinde üç kez bir mililitre yıkama tamponu ile nazikçe yıkayın.

Daha sonra, hücreleri bir saatlik oda sıcaklığında 300 mikrolitre antikor seyreltici içinde Fluor'a konjuge edilmiş ikincil antikor ile inkübe edin ve hücreleri ışıktan koruyun. Bir saat sonra, hücreleri her seferinde üç kez bir mililitre yıkama tamponu ile nazikçe yıkayın. Kapak kızağını 24 oyuklu plakadan çıkarmak için, plakayı 45 derecelik tutun.

Bir çift ince forsepsin ucunu, kapak kaymasının üst kenarına, kuyu zeminiyle birleştiği yere yerleştirin. Ardından, yıkama tamponundaki kapak kızağını kuyu tabanından uzağa yavaşça eğin. Kapak kayması, forseps ile kolayca çıkarılabileceği kuyu duvarına dayanacaktır.

Ardından, 100 x yüksek büyütme objektifi kullanarak solma önleyici montaj ortamına sahip mikroskop slaytlarına hücreler aşağı bakacak şekilde kapak fişlerini monte edin. İlk olarak, epi floresan kullanılarak görüntülenecek temsili bir hücre bulun. Ardından, görüntü yakalama ayarlarını yapılandırın: Her kanalı sırayla görüntülemek ve son görüntü için ortalama dört ila altı tarama yapmak için etiketli her kanalın sekiz bit sıkıştırılmamış tiff görüntülerini kaydedin.

Ardından konfokal görüntüleme yoluna geçin ve hücrenin merkezinden geçen bir Z düzlemine odaklanın. Her kanal için iğne deliği lazer gücünü ve fotoğraf çarpanı tüp voltajını ve ofsetini optimize edin. Bu ayarları kaydedin ve herhangi bir hedef çift için etiketlenmiş tüm hücreleri görüntülemek için aynı ayarları kullanın.

Aynı şekilde, yüksek büyütme objektifi ile görüntülenecek sonraki konum belirleyici hücreleri çoğaltın. Epi floresan kullanarak, konfokal görüntüleme yoluna geçin ve varsa hücrenin merkezinden geçen bir Z düzlemine odaklanın. Tarama alanını ilgilenilen hücreyle sınırlamak için yazılım yakınlaştırma kırpma işlevini kullanın. Sonra.

Daha önce oluşturulan ayarları kullanarak etiketli her kanal için görüntü yakalayın ve çoğaltma başına koşul başına 15 veya daha fazla hücre görüntülemek için yordamları tekrarlayın. Yeterli numune toplanmasını sağlamak. Bu yordamda, J görüntüsündeki bir hücrenin görüntü çiftini açın.RGB görüntüsü oluşturmak için görüntü renk birleştirme kanalları komutunu kullanın.

Sonra ilgilendiğiniz hücrenin etrafını çizin. Seçilen hücredeki hedeflerin birlikte yerelleştirilmesini ölçmek için SC yerelleştirmesini j eklentisi olarak kullanın. İstenen yerelleştirme ölçüsünü kaydedin ve her görüntü hücresi için prosedürü tekrarlayın.

Ardından, her bir etiketleme koşulunun her bir kopyasının ortak kontrol koşullarının kaydedilen kolokalizasyon değerlerinin ortalamasını hesaplayın. Her etiketleme koşulundaki her çoğaltma için ofseti elde etmek için ortalamaları eksi bir ile çarpın. Ardından, her etiketleme koşulundaki her çoğaltma için uzaklığı, bu çoğaltmadaki her bir yerelleştirme değerine ekleyin.

Bu, verileri, ortak kontrol koşulu için ortalama kolokalizasyon ölçüsü, her etiketleme koşulunun her bir kopyasının her birinde sıfır olacak şekilde normalleştirecektir. Bundan sonra, her bir etiketleme koşulunun tüm kopyalarından elde edilen tüm veriler, kopyalar arasında kolokalizasyondaki değişikliklerin analizine izin verecektir Burada, uzun süreli ve akut ilaç tedavilerine maruz kalan dorsal kök ganglion duyusal nöronlarının birincil kültürleri gösterilmektedir. Hücreler daha sonra delta opioid reseptörleri ve farklı primer ikincil antikor çiftlerine sahip endozomların geri dönüştürülmesinin bir belirteci için immün olarak etiketlendi ve iki kanallı ardışık konfokal mikroskopi ile görüntülendi.

Müteakip kantitatif kolokalizasyon ve analize ek olarak, bu temsili görüntüler, burada gösterilen yanlış renk kolokalizasyon haritaları oluşturmak için işlendi. Delta opioid reseptörleri ve erken endozom geri dönüşüm endozomları ve lizozom reseptör kolokalizasyonu belirteçleri için ortalama kolokalizasyon skorları, farklı akut ilaç tedavileri alan gruplar arasında karşılaştırıldı ve reseptör kaçakçılığında ilaca bağlı değişiklikler gözlendi. Bu prosedürü denerken, geçerli kantitatif analize izin vermek için yüksek kaliteli tutarlı mikrograflar edinmeyi unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, kantitatif kolokalizasyon analizinin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız.