Colocalizational Analizi Reseptör Sonrası içselleştirme Ticareti Uyuşturucu kaynaklı Değişiklikleri İzleme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hedef çiftlerin uzamsal kolokalizasyonunu nicel olarak değerlendirmektir; bu durumda ilaçla indüklenen reseptör trafiği incelenmektedir. Bu işlem, hücre içi reseptör trafiğinde değişikliği indüklemek için canlı kültür hücrelerinin ilaçla muamele edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, hedef reseptörlerin ve hücre içi taşıma bölmelerinin çift immün etiketlemesi, çok kanallı konfokal mikroskopi ile hedef çiftlerin uzamsal lokalizasyonunun belirlenmesine olanak tanır.

Kantitatif kolokalizasyon analizi, hedef reseptörlerin ve kompartımanların aynı yerde bulunma eğilimini ölçmek için kullanılır. Sonuçlar, reseptörlerin ve hücre içi taşıma kompartımanlarının kolokalizasyonuna dayanarak, ilaç tedavisi sonrası reseptör taşınımındaki değişiklikleri gösterir. Bu tekniğin, üst üste bindirme kolokalizasyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kolokalizasyonun nicel ölçümlerini sağlamasıdır; bu da çok daha güçlü analizlere ve karmaşık deneysel tasarımlara olanak tanır.

Bu yöntem reseptör trafiği hakkında bilgi sağlayabilse de, kültür hücrelerindeki hemen hemen her türlü iki proteinin mekânsal kolokalizasyonundaki değişikliklere uygulanabilir. Bu prosedüre başlamak için, orijinal büyüme ortamını uzaklaştırın ve seçilen konsantrasyondaki ilgili ilaç içeren ortamla değiştirin. Ardından, hücreleri seçilen işlem süresi boyunca orijinal büyüme koşullarında inkübe edin.

İnkübasyon sonrası, hücreleri her seferinde bir mililitre yıkama tamponu ile üç kez nazikçe yıkayın. Hücreleri, 0,1 molar PBS içindeki %4 paraformaldehitin 300 mikrolitresi ile 37 °C'de 10 dakika boyunca fikse edin. Ardından hücreleri tekrar, her seferinde bir mililitre yıkama tamponu ile üç kez yıkayın.

Ardından, hücreleri 300 µL bloklama tamponu içerisinde oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. Sonrasında, hücreleri 300 µL antikor seyreltici içindeki primer antikor ile 4 °C'de 48 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra hücreleri, her seferinde 1 mL yıkama tamponu kullanarak üç kez nazikçe yıkayın.

Ardından, hücreleri 300 µL antikor dilüentle beraber, florokrom konjugasyonlu ikincil antikor ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin ve hücreleri ışıktan koruyun. Bir saat sonra, hücreleri her seferinde 1 mL yıkama tamponu ile üç kez nazikçe yıkayın. Lamine camı 24 kuyucuklu plakadan çıkarmak için plakayı 45 derecelik açıyla tutun.

Hassas bir pensetin ucunu, lamellenin kuyucuk tabanıyla birleştiği üst kenara yerleştirin. Ardından, yıkama tamponu içindeki lamellayı kuyucuk tabanından uzaklaşacak şekilde hafifçe eğin. Lamella, pensetle kolayca çıkarılabileceği kuyucuk duvarına yaslanacaktır.

Ardından, hücreler aşağı bakacak şekilde kapatma lamlarını, 100x yüksek büyütmeli bir objektif kullanarak solmayan bir monteleme medyumu ile mikroskop lamlarına sabitleyin. İlk olarak, epi-floresan yöntemiyle görüntülemek için temsili bir hücre belirleyin. Daha sonra görüntü yakalama ayarlarını yapılandırın; her bir kanalı sırasıyla görüntülemek ve final görüntüsü için dört ila altı taramanın ortalamasını almak üzere, etiketlenmiş her kanalın sekiz bitlik sıkıştırılmamış tiff görüntülerini kaydedin.

Ardından konfokal görüntüleme yoluna geçin ve hücrenin merkezinden geçen bir Z düzlemine odaklanın. Her kanal için pinhole lazer gücünü, fotomultipliyer tüp voltajını ve ofsetini optimize edin. Bu ayarları kaydedin ve belirli bir hedef çifti için işaretlenmiş tüm hücrelerin görüntülemesinde aynı ayarları kullanın.

Aynı replikatta, yüksek büyütmeli bir objektif ile görüntülenmeye çalışılan yan konumlandırıcı hücreleri belirleyin. Epi-floresans kullanarak konfokal görüntüleme yoluna geçin ve eğer mümkünse hücrenin merkezinden geçen bir Z düzlemine odaklanın. Tarama alanını ilgilenilen hücre ile sınırlandırmak için yazılımın yakınlaştırma kırpma fonksiyonunu kullanın. Ardından.

Önceden belirlenmiş ayarları kullanarak her etiketli kanal için görüntüler yakalayın ve yeterli örnek toplamayı sağlamak amacıyla, her tekrar için her koşulda 15 veya daha fazla hücreyi görüntüleyecek şekilde işlemleri tekrarlayın. Bu prosedürde, bir hücreye ait görüntü çiftini ImageJ'de açın. Bir RGB görüntü oluşturmak için "image color merge channels" komutunu kullanın.

Ardından, ilgilenilen hücrenin çevresini çizin. Seçilen hücredeki hedeflerin kolokalizasyonunu nicelleştirmek için ImageJ eklentisi olan SC colocalization'ı kullanın. İstenen kolokalizasyon ölçümünü kaydedin ve prosedürü her bir görüntü hücresi için tekrarlayın.

Ardından, her bir işaretleme koşulunun her bir tekrarındaki ortak kontrol koşullarına ait kaydedilen kolokalizasyon değerlerinin ortalamasını hesaplayın. Her bir işaretleme koşulundaki her bir tekrar için ofset değerini elde etmek amacıyla ortalamaları eksi bir ile çarpın. Daha sonra, her bir işaretleme koşulundaki her bir tekrar için hesaplanan bu ofset değerini, o tekrardaki her bir kolokalizasyon değerine ekleyin.

Bu işlem, verileri her bir etiketleme koşulunun her bir replikasındaki yaygın kontrol koşulu için ortalama kolokalizasyon ölçümü sıfır olacak şekilde normalize edecektir. Bundan sonra, her bir etiketleme koşulunun tüm replikalarından elde edilen tüm veriler, replikalar arasındaki kolokalizasyon değişikliklerinin analizine olanak sağlayacaktır. Burada, uzun süreli ve akut ilaç tedavilerine maruz bırakılmış dorsal kök ganglionu duyusal nöronlarının primer kültürleri gösterilmektedir. Hücreler daha sonra delta opioid reseptörleri ve geri dönüşüm endozomlarının bir markeri için farklı primer-sekonder antikor çiftleri ile immün olarak etiketlenmiş ve iki kanallı ardışık konfokal mikroskopi ile görüntülenmiştir.

Sonraki kantitatif kolokalizasyon ve analizlere ek olarak, bu temsilci görüntüler, burada gösterilen yalancı renkli kolokalizasyon haritaları oluşturmak için işlenmiştir. Delta opioid reseptörleri ile erken endozom, geri dönüşüm endozomları ve lizozom markörlerinin her bir kompartman ile reseptör kolokalizasyonuna ait ortalama kolokalizasyon skorları, farklı akut ilaç tedavileri alan gruplar arasında karşılaştırılmış ve ilaç kaynaklı reseptör taşınımı değişiklikleri gözlemlenmiştir. Bu prosedür uygulanırken, geçerli bir kantitatif analiz yapılabilmesi için yüksek kaliteli ve tutarlı mikrografların elde edilmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir.

Bu videoyu izledikten sonra, kantitatif kolokalizasyon analizinin nasıl yapılacağı konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.