Bitki Tırnak Lipid Polyester Monomer İzolasyonu ve biçim Analizi

Vasküler bitkiler, bitki dokuları ile dış çevre arasında su geçirmez bariyerler olarak işlev gören hücre dışı katmanlara güvenir. Bu lipofilik hücreler, ilişkili yapılar iken, patojenik enfeksiyonu kısıtlar ve gazların, suyun ve çözünmüş maddelerin bitki dokularının içine ve dışına pasif taşınmasını düzenler. Önemli bir engel, bitkilere özgü karmaşık bir yapı olan bitki kütikülüdür.

Kütin, kütikülün yapısal matrisini oluşturan ve çözücü ile ekstrakte edilebilen mumlarla ilişkili çözünmeyen bir gliserol lipid polyesterdir. Burada, lipid polyesterlerin bileşimini analiz etmek ve lipid bitki dokularını tutmak için güvenilir bir teknik sunuyoruz. Bu protokolde, tüm doku örnekleri toplanır, homojenize edilir ve kütiküler ve epi özel mumlar dahil olmak üzere çözücüde çözünür lipitleri uzaklaştırmak için bir dizi çözücü ekstraksiyonu ile kapsamlı bir şekilde harap edilir.

Membran lipitlerinde trigliserol. Numuneler daha sonra sodyum meth oksit katalizli metil lizizi ile bileşen lipid monomerlerine depolimerize edilir. Simülasyon reaktifleri, trans metilat hidroksil gruplarına, gaz kromatografik analizi için uygun olan karşılık gelen trimetil hücre türevlerine eklenir.

Türev kalıntılar daha sonra GC şişelerine aktarılır ve analiz için AGCMS'ye yüklenir, biyo polyesterlerin monomerik bileşimini karakterize eden bir kromatogram oluşturur. Ekstrakte edilen numunelerde bulunur. Burada yabani tip ve olgun arabidopsis ANA bitkilerinin iki mutantından tam yaprak örnekleri topluyoruz.

Ekstraksiyon ve analiz için, kloroform ile önceden durulanmış cam tüpleri temizlemek için 0.5 gram doku ekleyin. Bir şişeye 100 mililitre izopropanol koyun ve% 0.01 Konsantrasyona bütillenmiş hidroksi toluen ekleyin BHT, çözücü ekstraksiyonları sırasında çift bağları ve yağ asitlerini oksidasyondan korumak için eklenen bir antioksidandır. Çözücüyü bir su banyosunda yaklaşık 85 dereceye kadar önceden ısıtın.

Bitki dokusunun gramı başına 25 mililitre ısıtılmış izopropanol ekleyin ve numuneleri 15 dakika boyunca 85 derecede ısı LOC'de inkübe edin. Tüplerin oda sıcaklığına ve kulak ve göz koruması ile soğumasını bekleyin. Son olarak, homojen bir dispersiyon elde etmek için numuneleri bir homojenizatör ile öğütün, vidalı kapaklı tüpler ve bir ila iki santrifüj numunesi için 100 RPM'de 800 G'de 10 dakika boyunca çalkalayın.

Organik fazı pelet içine sıkıştırılmış daha yüksek yoğunluklu malzemelerden ayırmak için, bir Pasteur veya propent kullanarak süpernatanı çıkarın ve atın. Peleti rahatsız etmemeye dikkat edin. Oda sıcaklığında eşit hacimde izopropanol ekleyin ve numuneleri gece boyunca çalkalayın.

100 RPM'de numuneleri santrifüjleyin ve süpernatanı atın. 25 mililitre iki ila bir kloroform, metanol, doku pergramı çözeltisi ekliyorum ve numuneleri gece boyunca santrifüjleyip organik fazı atıyorum. Daha sonra bu işlemi bir ila iki kloroform metanol çözeltisi kullanarak tekrarlayın.

Peletleri gece boyunca kurutun ve numuneleri en az üç günlük bir süre boyunca veya sabit kütle elde edilene kadar kurutmak için tüpleri davlumbazdan susuz kalsiyum sülfat içeren bir vakumlu kurutucuya aktarın. İyice kurutulduktan sonra numuneler, sodyum metamfetamin oksit katalizli metaliz ile kızarıklıktan arındırılmaya hazırdır. 25 mikrolitre metil HETO dekanoat ve 25 mikrolitre omega pentec ve lakton ile başlayarak bir cam şırınga kullanarak kuru doku içeren tüplere iki iç standart çözeltisi ekleyin.

Derin polimerizasyonu başlatmak için, numunelere 0,9 mililitre metil asetat ekleyin, ardından 1,5 mililitre sodyum meth oksit katalizörü ve 3,6 mililitre metanol ekleyin. Numuneleri iki saat boyunca 60 derecede inkübe edin Reaksiyon sistemi içinde periyodik girdap ile, lipid polyesterler, nükleofilik metamfetamin oksit anyonları ile reaksiyona girerek yağ asidi, metil esterler ve bir oksit anyonlarına kolayca ayrışan kararsız tetrahedral ara ürünler oluşturur. Bu a oksitler eşlenik bazlardır ve katali aktif metamfetamin IDE anyonlarını rejenere eden metanol ile reaksiyona girer, böylece ek derin polimerizasyon reaksiyonlarını sürdürür.

Sistemde su varsa, sodyum hidroksit oluşturmak için sodyum meth oksit ile reaksiyona girecektir. Polyesterleri geri dönüşü olmayan bir şekilde istenmeyen serbest yağ asitlerine dönüştüren güçlü bir bazdır. Hidrolizi önlemek için FAS yerine, sistem içindeki herhangi bir sodyum hidroksiti uzaklaştırmak için metil asetat eklenir.

Tüplerin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. İnkübasyonun ardından, her tüpe 10 mililitre metilen diklorür ekleyerek monomerleri çıkarın. Daha sonra numuneleri asitleştirmek için 1,5 mililitre buzlu asidik asit ekleyin.

Tüpleri 0.5 molar sodyum klorür çözeltisi ile doldurun, iyice girdap yapın ve dakikalarca santrifüjleyin. Çeker ocak altında. Alt organik fazı pipet ile temiz, önceden durulanmış, orta büyüklükte tüplere dikkatlice aktarın.

Numuneleri tekrar tuzlu su çözeltisi girdabı ile yıkayın ve 10 dakika santrifüjleyin. Üst sulu fazı çıkarın, daha sonra çözelti girdaplı numune santrifüjünde kalan eser miktarda suyu uzaklaştırmak için bir kurutma maddesi olarak numunelere susuz sodyum sülfat ekleyin ve çözücüyü önceden durulanmış küçük boyutlu tüpleri temizlemek için aktarın, çözücüyü buharlaştırmak ve kuru monomer kalıntıları elde etmek için tüpleri bir nitrojen buharlaştırıcıya yükleyin. Bir cam şırınga kullanarak, hidroksil gruplarını uçucu trimetil hücre türevlerine dönüştürmek için 100 mikrolitre pürin ve 100 mikrolitre B-S-T-F-A ekleyin.

Numuneleri 100 derecede 10 dakika inkübe edin. Tüplerin nitrojen gazı altında soğumasına ve buharlaşmasına izin verin. Kırmızı çözünmüş kalıntılara 500 mikrolitre bire bir HEPTAN toluen çözeltisi ekleyin, bunlar daha sonra kısa bir süre santrifüjlenir.

Türev numunelerini 400 mikrolitrelik kesici uçlar içeren GC şişelerine aktarın. Şişeleri, numuneleri analiz için bir kılcal kolona enjekte eden bir gaz kromatografına yerleştirin, elüat daha sonra dörtlü kütle spektrometresi ile tespit edilir. GCMS analizi ile elde edilen ham veriler işlenir ve her numune için bir kromatogram olarak sunulur.

Farklı kromatografik piklere karşılık gelen bireysel monomerler, spesifik kütle spektrumları ile tanımlanır. GC alıkonma sürelerinde, tek tek monomerlerin miktarları, dahili standart miktar belirleme yöntemi kullanılarak belirlenir ve bu da numuneler arasında monomer bolluğu ve bileşiminin karşılaştırılmasını sağlar. Burada, vahşi tipe karşılık gelen bir tavşan apsesi yaprak dokusundan salınan monomerlerin temsili analizlerinden elde edilen kaplama kromatogramları ve farklı monomerik profiller gösteren bir P dört 50 mono oksijenaz enzimini kodlayan bir genin iki mutant aleli gösterilmektedir.

Sonuçlarımız, üç ana kütin, monomer ve yabani tip ve mutant arabidopsis bitkisinin bolluğu gibi önemli farklılıklar göstermektedir. Bu protokol, bileşen monomerlerinin izolasyonu, tanımlanması ve miktarının belirlenmesi yoluyla bitki lipid polyesterlerinin bileşiminin tahlil edilmesi için sağlam bir yöntemdir. Prosedür ölçeklenebilir ve kökler, tohumlar, yapraklar ve diğer bütün dokular dahil olmak üzere çeşitli bitki materyallerinin toplu miktarlarını işlemek için kolayca uyarlanabilir.

Bu teknik, daha yüksek bitkilerde cutin ve suberinin biyosentezini, düzenlenmesini ve dağılımını araştıran çalışmalara uygulanabilir.