Bitki Tırnak Lipid Polyester Monomer İzolasyonu ve biçim Analizi

Damarlı bitkiler, bitki dokuları ile dış ortam arasında su geçirmez bariyerler görevi gören hücre dışı tabakalara dayanır. Lipofilik hücreler ve bunlarla ilişkili yapılar, patojenik enfeksiyonları kısıtlar ve bitki dokularına giren veya dokulardan çıkan gazların, suyun ve çözünmüş maddelerin pasif transportunu düzenler. Önemli bariyerlerden biri, bitkilere özgü karmaşık bir yapı olan bitki kütikülüdür.

Kütin, kütikulanın yapısal matrisini oluşturan ve çözücü ile ekstrakte edilebilen mumlarla ilişkili, çözünmeyen bir gliserol lipid polyesteridir. Burada, lipid polyesterlerin kompozisyonunu analiz etmek ve lipid içeren bitki dokularını incelemek için güvenilir bir teknik sunuyoruz. Bu protokolde, bütün doku örnekleri hasat edilir, homojenize edilir ve kütikular ve epikütikular mumlar dahil olmak üzere çözücüde çözünebilen lipidleri uzaklaştırmak amacıyla bir dizi çözücü ekstraksiyonu ile kapsamlı bir şekilde arındırılır.

Membran lipidlerindeki trigliserol. Örnekler daha sonra sodyum metoksit katalizli metil lizis ile bileşen lipid monomerlerine depolimerize edilir. Hidroksil gruplarını, gaz kromatografik analize uygun karşılık gelen trimetilselle türevlerine transmetilleyebilmek için simülasyon reaktifleri eklenir.

Türev kalıntılar daha sonra GC şişelerine aktarılır ve analiz için A-G-C-M-S cihazına yüklenerek, biyopolyesterlerin monomerik bileşimini karakterize eden bir kromatogram oluşturulur. Ekstrakte edilen örneklerde mevcuttur. Burada, olgun arabidopsis ANA bitkilerinin yaban tipi ve iki mutantından bütün yaprak örnekleri topluyoruz.

Ekstraksiyon ve analiz için, kloroform ile önceden durulanmış temiz cam tüplere 0,5 gram doku ekleyin. Bir balona 100 mililitre izopropanol koyun ve %0,01 konsantrasyonda bütillendirilmiş hidroksi toluen ekleyin. BHT, solvent ekstraksiyonları sırasında çift bağları ve yağ asitlerini oksidasyondan korumak için eklenen bir antioksidandır. Solventi bir su banyosunda yaklaşık 85 dereceye kadar ön ısıtmaya tabi tutun.

Bitki dokusunun gramı başına 25 mililitre ısıtılmış izopropanol ekleyin ve örnekleri ısıtmalı LOC'da 85 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. Tüplerin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve kulak ile göz koruması kullanın. Son olarak, homojen bir dağılım elde etmek için örnekleri bir homojenizatör ile öğütün, tüpleri vidalı kapaklarla kapatın ve 100 RPM'de bir ila iki dakika çalkalayın; ardından örnekleri 800 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Organik fazı, pellet şeklinde sıkışmış daha yüksek yoğunluklu materyallerden ayırmak için, süpernatan sıvıyı bir Pasteur pipeti veya propent kullanarak alın ve atın. Pelletin bozulmamasına dikkat edin. Oda sıcaklığında eşit hacimde isopropanol ekleyin ve örnekleri gece boyunca çalkalayın.

Örnekleri 100 RPM'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Doku gramı başına 2:1 oranında kloroform ve metanol çözeltisinden 25 mililitre ekleyin, örnekleri gece boyunca çalkalayın, santrifüjleyin ve organik fazı atın. Ardından bu işlemi 1:2 oranında kloroform ve metanol çözeltisi kullanarak tekrarlayın.

Pelleti gece boyunca kurutun ve örnekleri en az üç gün boyunca veya sabit kütle elde edilene kadar susuz kalsiyum sülfat içeren bir vakum desikatöründeydehidre etmek için tüpleri çeker ocaktan vakum desikatörüne aktarın. Tamamen kurutulduktan sonra örnekler, sodyum metoksit katalizli metaliz ile deflorasyon için hazır hale gelir. Cam şırınga kullanarak, önce 25 µL metil HETO dekanoat ve ardından 25 µL omega pentek ve lakton olmak üzere, kuru dokuları içeren tüplere iki iç standart çözeltisi ekleyin.

Derin polimerizasyonu başlatmak için, numunelere 0,9 mililitre metil asetat, ardından 1,5 mililitre sodyum metoksit katalizörü ve 3,6 mililitre metanol ekleyin. Numuneleri reaksiyon sisteminde periyodik vorteksleme yaparak iki saat boyunca 60 derece'de inkübe edin; lipid polyesterler, kararsız tetrahedral ara ürünler oluşturmak için nükleofilik metoksit anyonlarıyla reaksiyona girer ve bunlar kolayca yağ asidine, metil esterlere ve oksit anyonlarına ayrışır. Bu oksitler konjuge bazlardır ve katalitik olarak aktif metoksit anyonlarını yeniden üreterek metanol ile reaksiyona girer, böylece ek derin polimerizasyon reaksiyonlarının devamlılığını sağlarlar.

Sistemde su mevcutsa, sodyum metoksit ile reaksiyona girerek sodyum hidroksit oluşturacaktır. Bu güçlü baz, poliesterleri geri dönüşümsüz olarak istenmeyen serbest yağ asitlerine dönüştürür. Hidrolizi önlemek için, sistemdeki sodyum hidroksiti uzaklaştırmak amacıyla metil asetat eklenir.

Tüplerin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. İnkübasyonun ardından, her tüpe 10 mililitre metilen diklorür ekleyerek monomerleri ekstrakte edin. Ardından, numuneleri asitleştirmek için 1,5 mililitre glasik asetik asit ekleyin.

Tüpleri 0.5 molar sodyum klorür çözeltisi ile doldurun, iyice vorteksleyin ve dakikalarca santrifüjleyin. Çeker ocak altında, alt organik fazı pipet yardımıyla dikkatlice temiz, önceden durulanmış, orta boy tüplere aktarın.

Numuneleri tekrar salin çözeltisi ile yıkayın, vorteksleyin ve 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Üstteki sulu fazı uzaklaştırın, ardından çözeltide kalan eser miktardaki suyu gidermek için numunelere kurutucu ajan olarak susuz sodyum sülfat ekleyin, numuneleri vorteksleyin, santrifüjleyin ve çözücüyü önceden durulanmış temiz küçük boyutlu tüplere aktarın; çözücüyü uçurmak ve monomerlerin kuru kalıntılarını elde etmek için tüpleri bir nitrojen evaporatörüne yerleştirin. Hidroksil gruplarını uçucu trimetil sel türevlerine dönüştürmek için bir cam şırınga kullanarak 100 µL purin ve 100 µL B-S-T-F-A ekleyin.

Numuneleri 100 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Tüplerin soğumasını sağlayın ve nitrojen gazı altında evaporate edin. Kalıntıları yeniden çözmek için 500 µL bire bir HEPTAN toluen çözeltisi ekleyin ve ardından kısa bir süre santrifüjleyin.

Türevlendirilmiş örnekleri, 400 µL insert içeren GC viallarına aktarın. Vialları kapatıp örnekleri, analizi gerçekleştirmek üzere örnekleri bir kapiler kolona enjekte eden bir gaz kromatografına yükleyin; elüatlar daha sonra kuadrupul kütle spektrometresi ile tespit edilir. GC-MS analizi ile elde edilen ham veriler işlenir ve her örnek için bir kromatogram olarak sunulur.

Farklı kromatografik piklere karşılık gelen münferit monomerler, kendilerine özgü kütle spektrumları ile tanımlanır. GC alıkonma sürelerinde, münferit monomer miktarları, örnekler arasında monomer bolluğu ve kompozisyonunun karşılaştırılmasına olanak tanıyan iç standart miktar belirleme yöntemi kullanılarak belirlenir. Burada, bir P450 monoooksijenaz enzimini kodlayan bir genin yabanıl tipine ve iki mutant aleline karşılık gelen tavşan apsesi yaprak dokusundan salınan monomerlerin, belirgin monomerik profiller sergileyen temsili analizlerinden elde edilen üst üste bindirilmiş kromatogramlar gösterilmektedir.

Sonuçlarımız, üç ana kutin monomerinin bolluğu açısından yabanıl tip ve mutant arabidopsis bitkileri arasında önemli farklılıklar olduğunu göstermektedir. Bu protokol, kurucu monomerlerinin izolasyonu, tanımlanması ve miktar tayini yoluyla bitki lipid poliesterlerinin bileşimini analiz etmek için sağlam bir yöntemdir. Prosedür ölçeklenebilir olup; kökler, tohumlar, yapraklar ve diğer bütün dokular dahil olmak üzere çeşitli bitki materyallerinin büyük miktarlarda işlenmesine kolayca uyarlanabilir.

Bu teknik, yüksekten bitkilerde kütin ve suberinin biyosentez düzenlemesini ve dağılımını inceleyen çalışmalarda uygulanabilir.