Name: Bitki Tırnak Lipid Polyester Monomer İzolasyonu ve biçim Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Öğrenin bitki lipid polyesterlerinin monomer izolasyonu ve biyokimyasal analizini. Bu yöntem, bitki kütikül ve süberin biyosentezini incelemek için GC-MS ile güvenilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, S.J.'ye verilen Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırmaları (NSERC)-USRA hibesi ve I.M.'ye verilen NSERC-Keşif Hibesi ile desteklenmiştir. Teknik yardım için Richard Bourgault, Meghan Rains ve Amanda Fluke'a teşekkür ederiz. Att1-1 ve att1-2 mutantlarının tohumları, Pekin, Çin'deki Genetik ve Gelişim Biyolojisi Enstitüsü'nden Dr. Jian-Min Zhou tarafından nazikçe sağlandı.

Not: Bu protokol Bonaventure ve ark uyarlanmıştır. (2004), Molina ve ark. (2006), Li ve diğ. (2013) 7,10,11. Adım 1-5, Şekil 1 &#39;de özetlenmiştir. 1. Doku delipidasyon Not: Her zaman, kloroform ile tüm cam ve kapaklarını durulayın kullanmadan önce, davlumbaz altında kuru icar. DİKKAT: Doku homojenizasyon ve davlumbaz altında bütün solvent transferi adımları uygulayın; Her zaman kimyasallarla direkt temastan kaçınmak ve kirlenmeye örnekleri korumak için laboratuvar önlüğü, eldiven ve sıçrama koruyucu gözlük kullanın. <ol><li> Ön ısıtma su banyosu aldı ve 85 ° C&#39;ye kadar ısıtma bloğu. </li><li> Politetrafloroetilen (PTFE) -faced Vidalı kapakları olan önceden tartılmış 20 mm x 125 mm ebadındaki bir cam test tüpleri içine her yaprak numunenin yaklaşık olarak 0.5 g tartılır. Numune başına dört çoğaltır ekleyin. </li><li> Bir Erlenmeyer şişesine (yaklaşık 125 ml 2-propanol yerleştirin; samp gramı başına 25 mlle). % 0.01&#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar (aynı zamanda butile hidroksitolüen, BHT olarak da bilinir), 2,6-di-tert-bütil-4-metilfenol ekleme (ağırlık / hacim). Not: Metanol içinde stok çözeltisi (ağ / hac) bir% 5 ila BHT ekleyin (BHT doymamış yağlı asitlerin oksidasyonunu en aza indirir). </li><li> Su banyosu içinde 85 ° C&#39;ye kadar ön ısıtma 2-propanol çözeltisi. </li><li> Isıtma bloğu, 85 ° C&#39;de 15 dakika boyunca, her numune tüpü ve ısıya 12 ml sıcak 2-propanol çözücü ekleyin. Bu adım, kesintiye hücrelerden serbest bırakılabilir lipazlar inaktive eder. </li><li> Tüpler oda sıcaklığında kadar soğutulur ve homojen bir süspansiyon elde edilene kadar homojenize ile iyice doku öğütmek olsun. </li><li> Orbital çalkalayıcı numuneler ve 100 rpm ve oda sıcaklığında 1-2 saat çalkalanmıştır. </li><li> 800 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj ve supernatant atın. </li><li> 2-propanol eşit hacimde ilave edilir ve oda sıcaklığında 12 saat boyunca çalkalanır. </li><li> 800 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj ve supernatant atın. </li><li> 12 ml CH eklemeCı 3: CH3OH (2: 1, h / h) (numunenin gramı başına 25 mi) ila kalıntısı 100 rpm&#39;de ve oda sıcaklığında gece boyunca sallamak. </li><li> 800 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj ve supernatant atın. </li><li> 12 ml CHCl3 ekleyin: CH3 OH (1: 2, h / h) ila kalıntısı 100 rpm&#39;de ve oda sıcaklığında gece boyunca sallamak. </li><li> 800 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj ve ayrılması için kullanılabilir. </li><li> Numuneler oda sıcaklığında bir gece boyunca davlumbaz altında kurumasına izin verin. </li><li> Tortu hava-kurutun ve daha sonra susuz CaCI2 veya sabit ağırlık (3-5 gün) ulaşılana kadar CaSO 4 üzerinde bir vakum kurutucu içinde yer. </li></ol> 2. depolimerizasyonu: sodyum metoksit ile metanoliziyle (Şekil 2) UYARI: - 2.4, 2.7 - 2.8, 2.10 - 2.3 adımları uygulayın 2.15 ve 2.17 - - 2.11, 2.13 davlumbaz altında 2.18; Her zaman laboratuvar önlüğü, eldiven ve sıçrama koruyucu gözlük kullanın. <ol><li> 60 ° C&#39;ye kadar ısıtın ısı bloğu. </li><li> (Diğer hesaplamalar için önemli), kuru bir tortu ihtiva eden test tüpleri tartılır. </li><li> Her bir tüp, iç standartlar ekleyin: 25 ωL metil heptadecanoate (1 mg / ml stok) ve 25 ul ω-pentadecalactone (1 mg / ml stok). </li><li> Her tüpe 0.9 ml metil asetat, 1,5 ml sodyum metoksit ve 3.6 ml metanol eklenir ve bunları kap. Alternatif olarak, bu üç reaktifler ile, bir reaksiyon karışımı hazırlamak ve her bir örnek için 6 ml&#39;lik alikotları ekleyin. </li><li> 2 60 ° C de saat ve periyodik olarak 15 dakika aralıklarla girdap için ısı örnekleri. </li><li> Numuneler oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. </li><li> Yağlı asit metil esterlerinin elde etmek için metilen diklorid (CH2C! 2) ve buzlu asetik asit 1.5 ml 10 ml ekleyin. </li><li> Her bir tüp ve kap doldurmak için tuzlu su çözeltisi (0.5 M NaCI) ekleyin. </li><li> 800 x g&#39;de 10 dakika boyunca 1 dakika santrifüj vorteksleyin örnekleri. </li><li> Poli orta boy tüpleri temizlemek için (alt) Organik fazı aktarın (16 x 125 mm cam test tüpleri(PTFE) -faced vidalı kapak). </li><li> Her bir tüp ve kap doldurmak için tuzlu su çözeltisi (0.5 M NaCI) ekleyin. </li><li> 800 x g&#39;de 10 dakika boyunca 1 dakika santrifüj vorteksleyin örnekleri. </li><li> Sulu (üst) fazı çıkarın ve tekrar 2.11-2.12 adımları. </li><li> Tüm sulu (üst) fazı çıkarın. </li><li> 1 dakika için tüpler, ve vorteks kap, bir çözücü susuz sodyum sülfat (Na SO 2 4) ilave et; Numuneler artık şu güne kadar bırakılabilir. Bu noktada örnekleri davlumbaz altında bir gecede terk edilebilir At. </li><li> Alt Na 2 SO 4 tuzu sıkıştırmak için 800 xg&#39;de 2 dakika süreyle santrifüj. </li><li> Küçük bir cam tek boru (politetrafloroetilen ile 13 x 100 mm ebadındaki bir cam test tüpleri (PTFE) -faced vidalı kapak) organik fazın aktarın. </li><li> Nitrojen altında kuruyana kadar buharlaştırılır ve bir türetme aşamasına geçin. Hemen işleme değilse, -20 ° C&#39;de saklayın Örnekleri buharlaştınldı (örnekleri olabilir,LSO) buharlaştırma basamağından önce saklandı. </li></ol> Gaz Kromatografi için 3. Türev hazırlanması DİKKAT: adımlar 3.1.2 ve 3.1.5 gerçekleştirin - davlumbaz altında 3.1.8; Her zaman laboratuvar önlüğü, eldiven ve sıçrama koruyucu gözlük kullanın. <ol><li> Trimetilsilil türevleri <ol><li> 100 ° C&#39;ye kadar ısıtın ısı bloğu. </li><li> Her tüpe 100 ul piridin ve BSTFA (N, O-Bis trimetilsilil-trifloroasetamid) 100 ul ilave edin ve bunları kap. </li><li> 10 dakika boyunca 100 ° C&#39;de ısı örnekleri. </li><li> Numuneler oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında nitrojen altında örnekleri buharlaştınn. Numunelerin ısı uygulamaktan kaçının, monomerler bu aşamada son derece uçucu bulunmaktadır. </li><li> 1 (h / h) heptan: toluen 1 500 ul ekle. </li><li> 800 x g&#39;de 2 dakika süre ile 1 dakika santrifüj vorteksleyin örnekleri. </li><li> GC şişeleri örnekleri ekleyin ve GC / MS analizi geçin. </li></ol></li><li> Asetiltürevleri Not: asetilasyondan için adımları değiştirmeniz 3.1.1-3.1.3 yukarıdaki (video gösterilmemiştir) aşağıdaki gibi; 3.1.4-3.1.8 aynı adım: <ol><li> 60 ° C&#39;ye kadar ısıtın ısı bloğu. </li><li> Piridin 100 ul ve tüpler asetik anhidrid 100 ul (O Ac 2) eklenir. </li><li> Isı örnekleri 60 ° C &#39;de 1 saat. </li></ol></li></ol> 4. GC / MS analizi <ol><li> HP-5 kılcal kolon (30 mx 0.25 mm x 0.25 mm film kalınlığı) veya eşdeğeri (yani.,% 5 difenil,% 95 dimetil polisiloksan) kullanınız. Program 3 ° C / dakikada 300 ° C&#39;ye kadar 150 ile programlanan helyum taşıyıcı gaz, 1.5 ml / dak olarak belirlenmiştir akış ve fırın sıcaklığı GC. </li><li> 40-600 amu (elektron darbe iyonizasyon) üzerinden tarama moduna bölünmüş enjeksiyon (split oranı 1:10) ve set kütle spektrometresi kullanın. </li><li> Solvent (boş), WT ve mutant çoğaltır, her kullanılarak belirtilen kütin analiz yöntemi de dahil olmak üzere bir dizi tablo oluşturun. </li><li> Yük çözücüve carrousel örnek şişeleri, gerekirse otomatik numune şırınga durulama şişeleri hekzan ekleyin ve sırasını başlatın. Sekansı tamamlandıktan sonra, toplam iyon kromatogram izleri tüm örnekler için kullanılabilir. </li></ol> 5. Veri Analizi <ol><li> Yayınlanan kütle spektrumları her zirvenin kütle spektrumu karşılaştırarak veya varsa ticari bir kütüphane arayarak lipit polyester monomerleri tanımlayın. </li><li> Toplam iyon akımı kromatogramdaki Belirlenen her tepe için, GC / MS yazılımı (Ek Şekil 1) den entegrasyonu sonuçları masaya alanları bulmak için kendi tutma kez kullanabilirsiniz. </li><li> Her monomer (sütunlar AB) için, bir monomer Excel tablosu (Ek Dosya 2, sütunlar CF), numune çoğaltmak her için ilgili sütuna entegrasyon tablosu (İletişim Şekil 1, sütun D) bulunan alan değerleri eklemek Bir elektronik tablo Arabidopsis ölçmek içinkütin TMSI türevleridir. Asetillenmiş türevler yerine hazırlanır eğer Ltd. Dosya 3 kullanın. </li><li> BS sütunları (HK) iç standartları (IS) alanlarını ekleyin. Monomer tabloda miktar (mor gölgeli hücreleri için olduğu gibi 0 FAME (IS1) Tamamlayıcı: O, yani yağ asidi metil esterleri türetilmiş olmayan monomerler (FAME) ve dikarboksilik asit dimetil ester (DCA DMEs) için, 17 kullanımı Dosyaları 2/3). Primer alkoller, ferulik asit ve ω-hidroksi asitler de dahil olmak üzere hidroksillenmiş monomerlerin, 15 kullanın: Bileşik ölçümü için tercih IS 0 15-hidroksi FAME (IS2) (monomer tablosunda yeşil-shadded hücreler; 2/3 Yan Files) . </li><li> Her kuru yaprak ağırlığı ekle sütunları çoğaltmak AX-BA (Ek Dosya 2) ya da AQ-AT (Ek Dosya 3); alternatif birimi başına monomer yükleri ifade yüzey alanları hesaplamak ve monomer tabloya alan değerlerini eklemek için yaprakları taramayüzey alanı. </li></ol>

<ol><li>Kolattukudy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopolyester+membranes+of+plants%3A+cutin+and+suberin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biopolyester membranes of plants: cutin and suberin.</a> Science. 208 (4447), 990-1000 (1980).</li>
<li>Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyesters+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+Biot%22%5BJournal%5D)">Polyesters in higher plants.</a> Adv. Biochem. Eng. Biot. 71, 1-49 (2001).</li>
<li>Yeats, T. H., Rose, J. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+and+function+of+plant+cuticles%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The formation and function of plant cuticles.</a> Plant Physiol. 163 (1), 5-20 (2013).</li>
<li>Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+lipid+barriers%3A+biosynthesis+of+cutin+and+suberin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin.</a> Trends Plant Sci. 13 (5), 236-246 (2008).</li>
<li>Beisson, F., Li-Beisson, Y., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solving+the+puzzles+of+cutin+and+suberin+polymer+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Solving the puzzles of cutin and suberin polymer biosynthesis.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 15 (3), 329-337 (2012).</li>
<li>Heredia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+and+biochemical+characteristics+of+cutin%2C+a+plant+barrier+biopolymer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Biophysical and biochemical characteristics of cutin, a plant barrier biopolymer.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1620 (1-3), 1-7 (2003).</li>
<li>Bonaventure, G., Beisson, F., Ohlrogge, J., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+aliphatic+monomer+composition+of+polyesters+associated+with+Arabidopsis+epidermis%3A+occurrence+of+octadeca-cis-6%2C+cis-9-diene-1%2C+18-dioate+as+the+major+component%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of the aliphatic monomer composition of polyesters associated with Arabidopsis epidermis: occurrence of octadeca-cis-6, cis-9-diene-1, 18-dioate as the major component.</a> Plant J. 40 (6), 920-930 (2004).</li>
<li>Franke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoplastic+polyesters+in+Arabidopsis+surface+tissues+-+A+typical+suberin+and+a+particular+cutin%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Apoplastic polyesters in Arabidopsis surface tissues - A typical suberin and a particular cutin.</a> Phytochemistry. 66 (22), 2643-2658 (2005).</li>
<li>Vogg, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+fruit+cuticular+waxes+and+their+effects+on+transpiration+barrier+properties%3A+functional+characterization+of+a+mutant+deficient+in+a+very-long-chain+fatty+acid+-ketoacyl-CoA+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid -ketoacyl-CoA synthase.</a> J. Exp. Bot. 55 (401), 1401-1410 (2004).</li>
<li>Molina, I., Bonaventure, G., Ohlrogge, J., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+polyester+composition+of+Arabidopsis+thaliana+and+Brassica+napus+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">The lipid polyester composition of Arabidopsis thaliana and Brassica napus seeds.</a> Phytochemistry. 67 (23), 2597-2610 (2006).</li>
<li>Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi-Beisson%2C+Y+%22The+Arabidopsis+Book%22">The Arabidopsis Book</a>. 11, e0161(2013).</li>
<li>Christie, W. W. Mass Spectrometry of Fatty Acid Derivatives. , LipidHome. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.lipidhome.co.uk/ms/masspec.html">http://www.lipidhome.co.uk/ms/masspec.html</a> (2015).</li>
<li>Molina, I., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deposition+and+localization+of+lipid+polyester+in+developing+seeds+of+Brassica+napus+and+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Deposition and localization of lipid polyester in developing seeds of Brassica napus and Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 53 (3), 437-449 (2008).</li>
<li>Xiao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+CYP86A2+represses+Pseudomonas+syringae+type+III+genes+and+is+required+for+cuticle+development%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis CYP86A2 represses Pseudomonas syringae type III genes and is required for cuticle development.</a> EMBO J. 23 (14), 2903-2913 (2004).</li>
<li>Christie, W. W., Han, X. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChristie%2C+WW+%22Lipid+Analysis+-+Isolation%2C+Separation%2C+Identification+and+Lipidomic+Analysis%22">Lipid Analysis - Isolation, Separation, Identification and Lipidomic Analysis</a>. , 4th edition, Oily Press. Bridgwater, U.K. 446(2010).</li>
<li>Walton, T. J., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+structures+of+cutin+monomers+by+a+novel+depolymerization+procedure+and+combined+gas+chromatography+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of the structures of cutin monomers by a novel depolymerization procedure and combined gas chromatography and mass spectrometry.</a> Biochemistry. 11 (10), 1885-1896 (1972).</li>
<li>Matzke, K., Riederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+into+the+chemical+constitution+of+cutins+and+suberins+from+Picea+abies+%28L.%29+Karst.%2C+Quercus+robur+L.%2C+and+Fagus+sylvatica+L%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">A comparative study into the chemical constitution of cutins and suberins from Picea abies (L.) Karst., Quercus robur L., and Fagus sylvatica L.</a> Planta. 185 (2), 233-245 (1991).</li>
<li>Riederer, M., Schönherr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+gas+chromatographic+analysis+of+methyl+esters+of+hydroxy+fatty+acids+derived+from+plant+cutin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Quantitative gas chromatographic analysis of methyl esters of hydroxy fatty acids derived from plant cutin.</a> J. Chromatogr. 360, 151-161 (1986).</li>
<li>Moire, L., Schmutz, A., Buchala, A., Yan, B., Stark, R., Ryser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycerol+Is+a+Suberin+Monomer.+New+Experimental+Evidence+for+an+Old+Hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glycerol Is a Suberin Monomer. New Experimental Evidence for an Old Hypothesis.</a> Plant Physiol. 119 (3), 1137-1146 (1999).</li>
<li>Graça, J., Schreiber, L., Rodrigues, J., Pereira, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycerol+and+glyceryl+esters+of+omega-hydroxyacids+in+cutins%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Glycerol and glyceryl esters of omega-hydroxyacids in cutins.</a> Phytochemistry. 61 (2), 205-215 (2002).</li>
<li>Eglinton, G., Hunneman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+chromatographic-mass+spectrometric+studies+of+long+chain+hydroxy+acids-I%3A+The+constituent+cutin+acids+of+apple+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Gas chromatographic-mass spectrometric studies of long chain hydroxy acids-I: The constituent cutin acids of apple cuticle.</a> Phytochemistry. 7 (2), 313-322 (1968).</li>
<li>Espelie, K. E., Köller, W., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((9%2C16-dihydroxy-10-oxo-hexadecanoic+acid%2C+a+novel+component+in+citrus+cutin%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">9,16-dihydroxy-10-oxo-hexadecanoic acid, a novel component in citrus cutin.</a> Chem. Phys. Lipids. 32 (1), 13-26 (1983).</li>
<li>Holloway, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracuticular+lipids+of+spinach+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Intracuticular lipids of spinach leaves.</a> Phytochemistry. 13 (10), 2201-2207 (1974).</li>
<li>Holloway, P. J., Deas, A. H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epoxyoctadecanoic+acids+in+plant+cutins+and+suberins%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Epoxyoctadecanoic acids in plant cutins and suberins.</a> Phytochemistry. 12 (7), 1721-1735 (1973).</li>
<li>Holloway, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolloway%2C+PJ+%22The+chemical+constitution+of+plant+cutins%22">The chemical constitution of plant cutins</a>. Cutler, D. F., Alvin, K. L., Price, C. E. , Academic Press. London. 45-85 (1982).</li>
<li>Croteau, R., Fagerson, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+constituent+cutin+acids+of+cranberry+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">The constituent cutin acids of cranberry cuticle.</a> Phytochemistry. 11 (1), 353-363 (1972).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

DNA ve proteinler gibi diğer biyopolimerler farklı olarak, bitki lipid polyesterler bir şablondan yapılmamıştır. Bunun yerine, bu bileşimler, hücre dışı polimerlerin hazırlanması dokularda mevcut enzimlerin özgünlüğünün bağlıdır. Böyle, kimyasal bileşen analizleri gibi bileşenleri lipit polyester bileşimi anlamak için kritik öneme sahiptir. Ester bağları parçalama kimyasal yöntemler sabunlaşma, hidrojenoliz, asit katalizli metillenmenin ve baz ile katalize edilen metillenmenin 2 içerir. Bunların her biri avantajları ve dezavantajları vardır. Sabunlaşma ikincil reaksiyonlara tabi olabilir serbest yağ asitlerini üretir hidroksi. Lityum alüminyum hidrid ile Hidrojenoliz (LiAIH4) 16 kütin analizi 7 kullanılmaktadır. Hidrojenoliz alkollere işlevselleştirilmiş karbona azaltır ve orijinal yapılar lityum alüminyum deuteride (LiAlD 4) ile deuteriolysis anlaşılabilir olması gerekir.Bu yaklaşımın dezavantajı kendi yapılarının atamalarını yapmak için elde edilen yağ poliollerin deuteriation derecesini karşılaştırmak için yüksek çözünürlüklü GC / MS gerekliliktir. Metanolik boron trifluorid (BF 3) ile asit katalizörlü transesterifikasyon genellikle kütin ve suberin depolymerizations 8,17,18 kullanılmıştır, fakat ayıraç sınırlı bir raf ömrü vardır ve tepkilerini 15 yan nedeniyle eserler katabilmektedir. Metanolik sülfürik asit de diğer yöntemlerle 10 ile karşılaştırıldığında, monomerlerin ancak muhtemelen doğru lipid polyester bileşenleri olmayan 2-hidroksi yağ asitlerinin daha yüksek oranlarda, metil esterler elde edilir. Bu protokolde belirtilen NaOMe ile katalize edilen transesterifikasyon yöntemi tanımlanması için karakteristik kütle spektrumu sağlayan, hidroksil grupları sililasyonu türetilmiş olan yağlı asit metil esterlerinin üretimi veya asetilasyonu ile fo hidroksil gruplarının daha kararlı türevleri sağlamaktırr ölçümü. Bu tekniğin bir dezavantajı, su reaksiyonda mevcut olduğunda hidroliz transesterifikasyon ile rekabet olmasıdır. Su NaOMe (katalizörü) ile reaksiyona girer ve bu da serbest asitlerin (Şekil 2B) elde etmek için yağlı asit metil esterleri hidrolize eden NaOH üretir. Bu şekilde analiz komplike bir metil ester ve bir TMSI ester türevi: iki tepe her yağlı asit mevcut olacaktır, bu arzu edilmeyen bir yan reaksiyondur. Susuz reaktifler kullanılarak ve sabunlaştırma ile rekabet etmek için, bir ko-çözücü olarak metil asetat eklenerek hidroliz (Şekil 2B) engellemek için ve böylece önemli adımlardır. Kütin ve suberin 1 ve% 26 gliserol 4 arasında içerirler. Bununla birlikte, bu monomer bu protokolde belirtilen deney şartları ile tespit edilmez. Gliserol yağ asidi metil ester monomerlerin farklı olarak, sulu bir çözücü yıkama adımları sırasında elimine edilecektir, yüksek oranda hidrofilik ve. Bu sınırlama, aynı zamanda birDiğer kütin depolimerizasyon yöntemleri ancak gliserol NN = normal sıfır, bir enzimatik yöntem kullanılarak, transesterleştirme sonrasında elde edilen sulu tabaka içinde belirlenebilir. Seçenek olarak ise, daha hafif koşullar kullanılarak ölçülebilir (örn., 0.05 M NaOMe) daha fazla su çıkarma olmaksızın tüm monomerler tespit etmek için, gliserol ölçümü amacıyla vardır.Her ne kadar yararlı gliserol 19,20 dahil olmak üzere yumuşak koşullar genellikle kütin eksik depolimerizasyonunu verip süberin. Bir alev iyonizasyon detektörü (FID) bağlı bir GC mevcut ise temsili bir numunenin tepe GC / MS yolu ile teşhis edildikten sonra, tüm çoğaltır nicel amacıyla bu alet olarak analiz edilebilir. , Tutma endeksleri bilinmektedir Alternatif olarak, GC / FID izleri monomerler, tespit edilebilir. Alev iyonizasyon dedektörü büyük ve küçük numune bileşenlerinin miktarının tayini için önemlidir, özellikle yüksek hassasiyet ve orantılılık, geniş bir yelpazede yer alırTek çalıştırır. Buna ek olarak, bu sağlam ve korumak ve 15 işletmek kolaydır. Açıklanan protokol, bir ya da daha fazla lipit poliester monomer bileşimin farklı mutantların kimyasal özelliklerini sağlayan bitki lipid poliester monomer, güvenilir ve tekrarlanabilir izolasyonu, tanınması ve miktar tayini için izin verir. Prosedür kolayca kökler, tohumlar, yapraklar, saplar ve çiçekler dahil olmak üzere çeşitli bitki malzemeleri, küçük ve dökme hem de miktarını işlemek için adapte edilebilir, ölçeklenebilir. Birçok türün lipid polyester monomerlerin kütle spektral verileri, 21-26. Örneğin yayınlanan ve diğer dokuların ve / veya türlerin bu protokolü adapte zaman bilinmeyen monomerleri tanımlamak için değerli kaynakları teşkil edilmiştir. Bu yöntem, yüksek bitki lipid poliesterlerin sentezi, düzenleme ve dağıtım araştırmalar için de geçerlidir.

Vasküler bitkiler, bitki dokuları ve dış ortam arasında su geçirmez bariyerler olarak işlev dışı katmanları güveniyor. Bu lipofilik hücre duvarı ile ilişkili yapıları, patojenik enfeksiyonun kısıtlama içinde ve bitki dokularında 1 üzerinden gaz, su ve çözünmüş maddelerin pasif taşıma düzenler. Bu tür engeller bitki manikür, bitkiler 2, ve farklı süberin içeren difüzyon bariyerleri özgü bir synapomorphic yapı vardır. Kütikül hücre duvarının 3-5 hücre dışı tarafında pektinli tabakası yoluyla epidermal hücreleri tarafından sentezlenen ve bunlara bağlı olan bir oleofilik bir katmandır. Bu bitki dokularında ve çevre arasındaki hayati bir arayüz olarak işlev, yüksek bitkilerin birincil hava organlarını encases. Kütin, manikür yapısal matris ve süberin solvent ekstrakte mumlar 2,4 ile bağlantılı iki çözünmez gliserolipid polyesterlerdir. Bu polimerik lipids doymuş ve doymamış yağlı asit türevleri oluşur ve her iki yapısal ve fonksiyonel olarak benzer. Bununla birlikte, kimyasal bileşimi ve yerleştirme siteleri karakteristik farklılıklardan ayırt edilebilir. Suberin ikincil duvar oluşturan, belirli dahili ve harici dokuların hücre duvarları içinde yer alan bir alifatik polyester. Suberize olmuş dokular köklerinin periderms, yumrular ve ağaç kabuğu, kök endodermis, çiğit katmanları ve iyileşmiş yaralar 2 bulunur. Kütin farklı olarak, suberin poliester genellikle alkoller, doymuş ve mono-doymamış dikarboksilik asitler ve çok uzun zincirli monomerler büyük bir kısmı (C≥20) içerir. Kütin damarlı bitkilerin 6 içinde en bol lipid polyester ve gliserol ve hidroksi ve hidroksi-epoksi ikameli yağlı asitler 4 olarak C16-C18 yağlı asit ara esterleşmiş türevleri oluşur. Kütin polimerlerin bileşimi iken0, 18-hidroksi-9,10-epoksi 18: 0 ve 18 9,10,18-trihidroksi: 0 yağ asitleri tracheophyte türler arasında değişiklik gösterir, en baskın ana monomerler, 16, 16-dihidroksi, 10 vardır. 2 dikarboksilik asit 7,8: İlginç bir şekilde, Arabidopsis yaprağı ve kütin kök esas olarak 18 oluşmaktadır. Bitki cuticles da birkaç mikrometre 9 birkaç nanometre arasında değişen kalınlıkta bir önemli ölçüde değişkenlik mevcut. Manikür izolasyonu özellikle bu tür Arabidopsis thaliana&#39;nın 8 gibi çok ince yaprak cuticles için zahmetli ve zaman alıcı bir adım, olduğundan manikür izolasyonu bypass yöntemleri geliştirilmiş ve 7,8 doğrulanmıştır. Burada, sodyum metoksit (NaOMe) katalize depolimerizasyon ve daha sonra gaz kromatografisi / kütle spektrometrisi (GC / MS) analizi ile, Arabidopsis thaliana yapraklarda kütin monomer bileşiminin incelemek için ayrıntılı bir protokol açıklar. Bu protokol co tahlil için sağlam bir yöntem sunmaktadırBütün delipide dokularda bitki lipid poliesterlerin bir kompozisyon, ve daha önce bildirilen protokoller 7,10,11 adapte edilmiştir. Tüm doku örnekleri vardır homojenize ilk ve etraflıca cuticular ve epikütikülar mumlar, membran lipitleri ve triaçilgliseroller dahil solvent ekstrakte lipidlerin kaldırarak, delipide. Hücre duvarı zenginleştirilmiş kalıntıları daha sonra sodyum metoksit ile katalize metanoliz ile kendi kurucu metil ester monomerlere depolimerize edilmektedir. Yağ asidi metil esterleri asitleştirme üzerine ekstre edilebilmekte ve bunların karşılık gelen trimetilsilil veya asetildir türevlerini elde etmek üzere derivatize edilir. Türetilmiş kalıntısı uçucudur ve GC / MS analizi sırasında yapısal konformasyonunun değiştirmeden makul bir sıcaklıkta bir gaz kromatografisi sütunundan elute edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Kimyasallar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BPA451-4</td><td>Delipidasyon için çözücü</td></tr><tr><td>Susuz sodyum sülfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S421500</td><td></td></tr><tr><td>Asetik anhidrit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320102</td><td>Türevlendirme ajanı</td></tr><tr><td>BSTFA (N, O-bis (trimetilsilil) -trifloroasetamid)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>15222</td><td>Türevlendirme ajanı</td></tr><tr><td>Bütillenmiş hidroksitoluen (BHT)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>101162</td><td>Antioksidan</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür, susuz</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-3</td><td>Kurutma ajanı</td></tr><tr><td>Kalsiyum suflat, susuz (DRIERITE- 8 MESH göstergeli)</td> <td>Acros Organics</td><td>219090020</td><td>Kurutma ajanı</td></tr><tr><td>Kloroform (Triklorometan)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>C6074</td><td>Organik çözücü</td></tr><tr><td>Buzlu asetik asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2401212</td><td>Asitleştirme maddesi</td></tr><tr><td>Helyum taşıyıcı gaz, basınçlı</td><td>Hava Sıvı</td><td>ALPHAGAZ1-UN1046</td><td>Taşıyıcı gaz, GC / MS</td></tr><tr><td>Heptan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3501</td><td>Organik çözücü</td></tr><tr><td>Hekzanlar</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3024</td><td>Organik çözücü</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4124</td><td>Organik çözücü, transmetilasyon reaktif</td></tr><tr><td>Metil asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296996</td><td>Organik çözücü</td></tr><tr><td>Metil heptadekanoat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4515</td><td>Dahili standart (1mg/mL stok)</td></tr><tr><td>Metilen diklorür (Diklorometan)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D374</td><td>Organik çözücü</td></tr><tr><td>Azot, sıkıştırılmış</td><td>Air Liquide</td><td>ALPHAGAZ1-UN1044</td><td>Taşıyıcı gaz, GC-FID</td></tr><tr><td>Pentadekanolakton</td><td>Fluka</td><td>76530</td><td>Dahili standart (1 mg / ml stok)</td></tr> <tr><td>Piridin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td>Türevlendirme için yardımcı çözücü</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358212</td><td>Tuzlu su çözeltisi</td></tr><tr><td>Sodyum metoksit (ağırlıkça %25)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156256</td><td>Nükleofil</td></tr><tr><td>Toluen</td><td>FIsher Scientific</td><td>T2904</td><td>Organik çözücü</td></tr><tr><td>Bitki Büyüme Malzemeleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pro-Mix PGX</td><td>Premier Tech Bahçe Bitkileri Ltd</td><td></td><td>Pro-Mix PGX'in Arabidopsis bitkileri yetiştirmesi önerilir (Eddy, R. ve Hahn, DT, 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) Arabidopsis Büyümesi için Purdue Yöntemleri.&nbsp;</td></tr><tr><td>PermaNest Nem Kubbesi&nbsp;</td><td>Yetiştiricinin Çözümü, LLC, Cookeville, TN&nbsp;</td><td>GD2211-24</td><td></td></tr><tr><td>Perma-Nest Bitki Tepsileri (22x11in)</td><td>Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN&nbsp;</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Kare sera saksıları, 3.5 inç &</td><td>Yetiştiricinin Çözümü, LLC, Cookeville, TN&nbsp;</td><td>P86</td><td></td></tr><tr><td>Genel Amaçlı Bitki Gübresi, Plant-Prod 20-20-20</td><td>Premier Tech Ev ve Bahçe In., Brantford, ON</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Züccaciye</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13 x 100 mm Teflon yüzlü vidalı kapaklı cam test tüpü</td><td>Kimble Chase Yaşam Bilimleri ve Araştırma Ürünleri LLC</td><td>45066A-13100</td><td></td></tr><tr><td>Teflon yüzlü vidalı kapaklı 16 x 125 mm cam test tüpü</td><td>Kimble Chase Yaşam Bilimleri ve Araştırma Ürünleri LLC</td><td>45066A-16125</td><td></td></tr><tr><td>Teflon yüzlü vidalı kapaklı 20 x 125 mm cam test tüpleri</td><td>Kimble Chase Yaşam Bilimleri ve Araştırma Ürünleri LLC</td><td>45066A-20125</td><td></td></tr><tr><td>GC şişe kapakları</td><td>Ulusal Bilimsel</td><td>C400051A</td> GC şişesi mikro uçları Ulusal Bilimsel C4011631 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC şişeleri</td><td>Ulusal Bilimsel</td><td>C40001</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık pastör pipetleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820B</td><td></td></tr><tr><td>Şişeler</td><td>Fisher Bilimsel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X15R santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analitik denge</td><td>Fisher Bilimsel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dansöz</td><td></td><td></td><td>Oryantal Dansçı mevcut değilse bu amaç için bir çalkalayıcı kullanılabilir</td></tr><tr><td>DB-5 Kılcal GC sütunu</td><td>J& W Bilimsel, CA, ABD; &nbsp;</td><td></td><td>30 m x 0,25 mm x 0,25 &mu; m film kalınlığı</td></tr><tr><td>Kurutucu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 202 su banyosu</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISQ LT tek dört kutuplu kütle spektrometresi</td><td>Termo Bilimsel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isı bloğu</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azot buharlaştırıcı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron homojenizatör</td><td>Birkmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trace 1300 gaz kromatografı</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İki aşamalı regülatör</td><td>Air Liquide</td><td>Q1-318B-580</td><td></td></tr><tr><td>Vakumlu kurutucu</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bitki tırnak lipid polyester monomer İzolasyonu ve biçim analizi

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Karasal bitkiler, belirli dokuların hücre duvarlarını değiştiren hücre dışı alifatik biyopolyesterler üretir. Epidermal hücreler, hava bitki yüzeylerini kaplayan kütikülün çerçevesini oluşturan bir gliserol polyesteri ve modifiye edilmiş yağ asitleri olan kütin'i sentezler. Suberin, kök endodermisi ve yumru köklerin, ağaç kabuğunun ve köklerin peridermi dahil olmak üzere belirli dokuların hücre duvarlarında biriken ilgili bir lipit polyesterdir. Bu lipid polimerleri, bitki türleri arasında bileşim bakımından oldukça değişkendir ve genellikle tek bir tür içindeki dokular arasında farklılık gösterir. Burada, sodyum metoksit (NaOMe) katalizli depolimerizasyon, türevlendirme ve müteakip gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC/MS) analizi ile Arabidopsis thaliana yapraklarındaki cutinin monomer bileşimini incelemek için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu yöntem, kütin veya suberin içeren bütün delipide edilmiş bitki dokularından izole edilen çözünmeyen polyesterlerin monomerlerini araştırmak için kullanılabilir. Yöntem, sadece daha önce analiz edilmemiş türlerdeki lipid polimerlerinin bileşimini karakterize etmek için değil, aynı zamanda aday gen fonksiyonunu değerlendirmek için ileri ve geri genetik yaklaşımlarda analitik bir araç olarak da uygulanabilir.

. Bu yazıda anlatılan protokol Şekil 1 olmayan kütin lipidlerin 10 katkılarını en aza indirerek, (., Kütin veya süberin yani) lipit polyester monomerleri belirlemek için kurulan toplam 8 arasında sürer tahlil, genel bir bakış sunuyor edilir - 10 gün (GC verilerinin elde edilmesi için ilk dokusu hasat), kurumaya bırakılır ne kadar süre örnekler bağlı olarak değişir. Seçilen baz katalizörlü metanolizi (Şekil 2) polyesterleri depolimerize yöntemi daha önce kütin ve mantarözü her ikisini de içerir Arabidopsis tohumu için doğrulanmıştır. Dokular ilk homojenize ve etraflıca solvent ekstrakte lipidlerin kaldırmak için delipide edilmiştir. Ekstraksiyondan sonra tortu, verimi, başlangıç ​​taze ağırlığının yüzdesi olarak, A. genellikle% 6 thaliana Col-0 bırakır. Hücre duvarı zenginleştirilmiş tortular bir vakum kurutucu içinde kurutuldu ve daha sonra kendi oluşturucu metil ester monomerlere depolimerize edilirBaz katalizli metillenmenin. İki saatlik inkübasyon uygun depolimerizasyon ve lipid polyester bileşenlerinin geri kazanımı için gerekli kritik süre olarak seçildi. Daha uzun inkübasyon süreleri 2-hidroksi asitler artış ile sonuçlanmıştır; Bu potansiyel membran sfingolipidler 10 kaynaklanmaktadır. O -TMSi eter türevleri (Şekil 3A) ve O-asetil türevleri (Şekil 3B) Arabidopsis yabani tip yaprak kütin, Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir, eğer tipik bir kromatogramı. Her bir en yüksek literatürde 7,8 ve 12 .our video protokol TMSI türevleri hazırlamak için gösterilmiştir genel veritabanı kütle spektrumları ile karşılaştırılarak tespit edildi, fakat örnekler alternatif hidroksil grubu türetmek için asetile edilebilir. Onlar teşhis kitle spektrumları vermek için Silillenmiş türevleri tanımlama amacıyla iyidir. Fakat asetillenmiş türevleri daha kararlı olan ve bir alternatif sililasyonu içinBir kez monomerler, 10 tespit edilmiştir. Sadece GC alev iyonizasyon detektörü (FID) bağlanır olan laboratuarlarda bu protokolü uygulamaya yardımcı olmak için, GC / FID WT yaprak kütin monomer ve yağ asidi metil ester, standartların bir homolog dizi asetillenmiş türevlerden tekabül de gösterilir izleri (Ek Şekil 4). Bu yöntem nitel ve nicel örnekler arasında farklılıklar mutant analizi için dolayısıyla değerini tespit eder. Bireysel monomer miktarları örnekler arasındaki monomer bolluğu karşılaştırmalar sağlayan ölçümü iç standart yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. Pik boyutu (toplam iyon sayısı) polyester monomerlerin mol oranlarını yansıtmıyor olabilir, ancak, açıklığa kavuşturulmalıdır. Bu yağlı asit metil esterleri ve TMSI türevleri (Ek İçerik 1) ya da as olarak Arabidopsis yaprağı kütin monomer miktarlarını hesaplayabilecektir monomerlerin düzenlenebilir tablolar dahil<html> alkollerin asetil türevleri (İletişim Dosyası 2). Bu tablolar, numuneler farklı organ ve bitki türlerinden ekstrakte durumunda adapte edilmesi gerekebilir. Bir örnek olarak, analiz edilen adres Arabidopsis thalia na Columbia (Col-0), vahşi tip yaprak ve CYP86A2 / ATT1 geni att1-1 (m-1) ve att1-2 iki, daha önce karakterize boş mutant aleli (m-2 ) 13,14. CYP86A alt ailesinin sitokrom P450 monooksijenazlar varsayılan ω-oksidazlar kodlamak ve suberin ve kütin monomer biyosentezi katılmak. Bizim sonuçlarımız (Şekil 4) WT yaprakları ile karşılaştırıldığında mutant yapraklarda üç büyük lipid monomer yükleri önemli azalmalar göstermektedir. 0, 18: 2 ve 18: enzimin tahmin fonksiyonu 16 ile uyumlu olarak 1 dikarboksilatlar, özellikle att1 mutant etkilendi. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 53386 / 53386fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil lipit polyester analizi 1. Genel Bakış. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53386/53386fig2.jpg" /> Şekil NaOMe katalizörlü metillenmenin reaksiyon 2. mekanizması. Nükleofilik metoksit anyonları kolaylıkla yağlı asit metil esterlerinin ve alkoksit anyonlar (B) ayrışırlar kararsız bir tetrahedral ara (A) oluşturmak için lipid polyesterlerin karboml karbon saldırır. Bu alkoksitler konjuge bazlar ve bu suretle de ilave depolimerizasyon reaksiyonları (C) sürdürülmesi, katalitik olarak aktif metoksit anyonları rejenere metanol ile reaksiyona girmektedirler. Su içinde mevcut değilseSistem, sodyum hidroksit, geri dönüşü olmayan istenmeyen serbest yağlı asitlerin üretilmesi için esterleri hidrolize eden güçlü bir baz oluşturmak üzere sodyum metoksit ile reaksiyona girer. Metil asetat. Sisteminde (D) içindeki sodyum hidroksit küçük miktarlarda kaldırmak için bir ko-çözücü 15 olarak <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig2large.jpg" target="_blank">eklenir, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53386/53386fig3.jpg" /> Şekil 3. Yabani tip Arabidopsis thaliana yaprağı kütin monomerlerin Temsilcisi toplam iyon kromatogramı. (A) O -trimethylsilyl (TMSI) eter ve (B) asetat hidroksil türevleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> </a&gt; <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53386/53386fig4.jpg" /> Şekil, Arabidopsis thaliana WT 4. Kütin monomer bileşimi ve CYP86A2 geninin iki boş mutant aleli. (Mutant-1 = att1-1 mutant-2 = att1-2) Hata çubukları (n = 4), ortalamanın standart sapmasını temsil eder . © Blackwell Publishing (2007) izni ile, 13 uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig1.jpg" /> GC / MS yazılım yazmak Şekil 1. Tepe entegrasyon sonuçları tablosu. Belirlenen monomer ve iç standartlarına uygun Peaks kendi retenti ile tanımlanır<html> zaman (sütun C) ve alan değerleri sütununda tablolanmıştır D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_1.tif" target="_blank">bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig2.jpg" /> Arabidopsis kütin monomerlerin (hidroksi yağ asidi metil esterlerinin trimetilsilil eter türevleri) İletişim File 2. Tablo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_File_2_Cutin_template_TMSi.xls" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig3.jpg" /> Arabidopsis kütin monomer (hidroksi yağ asidi metil esterlerinin O-asetil türevleri) Company Dosya 3. Tablo.com / files / ftp_upload / 53386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig4.jpg" /> Ek Şekil 4. GC / FID izleri (AB) yağlı asit metil ester (FAME) alıkoyma göstergesi standartları (tepe değeri, her doymuş FAME zincir uzunluğu ile etiketlenmiştir); ve (C) A. asetilatlı thaliana yaprağı WT kütin monomerler. 16: 0, FAME (1), ferulat (2), 18: 3 FAME (3), 18: 1/18: 2 kareleri (4), 18 (5), sinapate 0 FAME (6 tepe numaralarına karşılık gelen ), 16: 0 DCA (7), 16-OH, 16: 0 FAME (8), 18: 2 DCA (9), 18: 1 DCA (10) 18: 0 DCA (11), 18-OH, 18: 2 FAME (12), 18-OH, 18: 1 FAME (13), 20: 0 FAME (14), 10,16-DIOH 16: 0 FAME (15), 24: 0 FAME (16). DCA: dikarboksilik asit dimetil ester; FAME: yağlı asit metil ester; IS1: iç standart 1, 17: 0 FAME; IS2: İç standard 2, 15-OH 15: 0 FAME. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_4.tif" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Lipid poliesterler, bitki kütikülü ve suberin içeren difüzyon bariyerleri olmak üzere iki hücre duvarı modifikasyonunun yapısal bileşenlerini oluşturur. Bu videoda, bütün delipide edilmiş yapraklardan kütini depolimerize etmek için bir yöntem açıklıyoruz. Yöntem, kütin veya suberin biyosentezinde tehlikeye giren mutantların araştırılmasına uygulanabilir.

Bitki Tırnak Lipid Polyester Monomer İzolasyonu ve biçim Analizi

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

Damarlı bitkiler, bitki dokuları ile dış ortam arasında su geçirmez bariyerler görevi gören hücre dışı tabakalara dayanır. Lipofilik hücreler ve bunlarla ilişkili yapılar, patojenik enfeksiyonları kısıtlar ve bitki dokularına giren veya dokulardan çıkan gazların, suyun ve çözünmüş maddelerin pasif transportunu düzenler. Önemli bariyerlerden biri, bitkilere özgü karmaşık bir yapı olan bitki kütikülüdür.Kütin, kütikulanın yapısal matrisini oluşturan ve çözücü ile ekstrakte edilebilen mumlarla ilişkili, çözünmeyen bir gliserol lipid polyesteridir. Burada, lipid polyesterlerin kompozisyonunu analiz etmek ve lipid içeren bitki dokularını incelemek için güvenilir bir teknik sunuyoruz. Bu protokolde, bütün doku örnekleri hasat edilir, homojenize edilir ve kütikular ve epikütikular mumlar dahil olmak üzere çözücüde çözünebilen lipidleri uzaklaştırmak amacıyla bir dizi çözücü ekstraksiyonu ile kapsamlı bir şekilde arındırılır.Membran lipidlerindeki trigliserol. Örnekler daha sonra sodyum metoksit katalizli metil lizis ile bileşen lipid monomerlerine depolimerize edilir. Hidroksil gruplarını, gaz kromatografik analize uygun karşılık gelen trimetilselle türevlerine transmetilleyebilmek için simülasyon reaktifleri eklenir.Türev kalıntılar daha sonra GC şişelerine aktarılır ve analiz için A-G-C-M-S cihazına yüklenerek, biyopolyesterlerin monomerik bileşimini karakterize eden bir kromatogram oluşturulur. Ekstrakte edilen örneklerde mevcuttur. Burada, olgun arabidopsis ANA bitkilerinin yaban tipi ve iki mutantından bütün yaprak örnekleri topluyoruz.Ekstraksiyon ve analiz için, kloroform ile önceden durulanmış temiz cam tüplere 0,5 gram doku ekleyin. Bir balona 100 mililitre izopropanol koyun ve %0,01 konsantrasyonda bütillendirilmiş hidroksi toluen ekleyin. BHT, solvent ekstraksiyonları sırasında çift bağları ve yağ asitlerini oksidasyondan korumak için eklenen bir antioksidandır. Solventi bir su banyosunda yaklaşık 85 dereceye kadar ön ısıtmaya tabi tutun.Bitki dokusunun gramı başına 25 mililitre ısıtılmış izopropanol ekleyin ve örnekleri ısıtmalı LOC'da 85 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. Tüplerin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve kulak ile göz koruması kullanın. Son olarak, homojen bir dağılım elde etmek için örnekleri bir homojenizatör ile öğütün, tüpleri vidalı kapaklarla kapatın ve 100 RPM'de bir ila iki dakika çalkalayın; ardından örnekleri 800 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Organik fazı, pellet şeklinde sıkışmış daha yüksek yoğunluklu materyallerden ayırmak için, süpernatan sıvıyı bir Pasteur pipeti veya propent kullanarak alın ve atın. Pelletin bozulmamasına dikkat edin. Oda sıcaklığında eşit hacimde isopropanol ekleyin ve örnekleri gece boyunca çalkalayın.Örnekleri 100 RPM'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Doku gramı başına 2:1 oranında kloroform ve metanol çözeltisinden 25 mililitre ekleyin, örnekleri gece boyunca çalkalayın, santrifüjleyin ve organik fazı atın. Ardından bu işlemi 1:2 oranında kloroform ve metanol çözeltisi kullanarak tekrarlayın.Pelleti gece boyunca kurutun ve örnekleri en az üç gün boyunca veya sabit kütle elde edilene kadar susuz kalsiyum sülfat içeren bir vakum desikatöründeydehidre etmek için tüpleri çeker ocaktan vakum desikatörüne aktarın. Tamamen kurutulduktan sonra örnekler, sodyum metoksit katalizli metaliz ile deflorasyon için hazır hale gelir. Cam şırınga kullanarak, önce 25 µL metil HETO dekanoat ve ardından 25 µL omega pentek ve lakton olmak üzere, kuru dokuları içeren tüplere iki iç standart çözeltisi ekleyin.Derin polimerizasyonu başlatmak için, numunelere 0,9 mililitre metil asetat, ardından 1,5 mililitre sodyum metoksit katalizörü ve 3,6 mililitre metanol ekleyin. Numuneleri reaksiyon sisteminde periyodik vorteksleme yaparak iki saat boyunca 60 derece'de inkübe edin; lipid polyesterler, kararsız tetrahedral ara ürünler oluşturmak için nükleofilik metoksit anyonlarıyla reaksiyona girer ve bunlar kolayca yağ asidine, metil esterlere ve oksit anyonlarına ayrışır. Bu oksitler konjuge bazlardır ve katalitik olarak aktif metoksit anyonlarını yeniden üreterek metanol ile reaksiyona girer, böylece ek derin polimerizasyon reaksiyonlarının devamlılığını sağlarlar.Sistemde su mevcutsa, sodyum metoksit ile reaksiyona girerek sodyum hidroksit oluşturacaktır. Bu güçlü baz, poliesterleri geri dönüşümsüz olarak istenmeyen serbest yağ asitlerine dönüştürür. Hidrolizi önlemek için, sistemdeki sodyum hidroksiti uzaklaştırmak amacıyla metil asetat eklenir.Tüplerin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. İnkübasyonun ardından, her tüpe 10 mililitre metilen diklorür ekleyerek monomerleri ekstrakte edin. Ardından, numuneleri asitleştirmek için 1,5 mililitre glasik asetik asit ekleyin.Tüpleri 0.5 molar sodyum klorür çözeltisi ile doldurun, iyice vorteksleyin ve dakikalarca santrifüjleyin. Çeker ocak altında, alt organik fazı pipet yardımıyla dikkatlice temiz, önceden durulanmış, orta boy tüplere aktarın.Numuneleri tekrar salin çözeltisi ile yıkayın, vorteksleyin ve 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Üstteki sulu fazı uzaklaştırın, ardından çözeltide kalan eser miktardaki suyu gidermek için numunelere kurutucu ajan olarak susuz sodyum sülfat ekleyin, numuneleri vorteksleyin, santrifüjleyin ve çözücüyü önceden durulanmış temiz küçük boyutlu tüplere aktarın; çözücüyü uçurmak ve monomerlerin kuru kalıntılarını elde etmek için tüpleri bir nitrojen evaporatörüne yerleştirin. Hidroksil gruplarını uçucu trimetil sel türevlerine dönüştürmek için bir cam şırınga kullanarak 100 µL purin ve 100 µL B-S-T-F-A ekleyin.Numuneleri 100 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Tüplerin soğumasını sağlayın ve nitrojen gazı altında evaporate edin. Kalıntıları yeniden çözmek için 500 µL bire bir HEPTAN toluen çözeltisi ekleyin ve ardından kısa bir süre santrifüjleyin.Türevlendirilmiş örnekleri, 400 µL insert içeren GC viallarına aktarın. Vialları kapatıp örnekleri, analizi gerçekleştirmek üzere örnekleri bir kapiler kolona enjekte eden bir gaz kromatografına yükleyin; elüatlar daha sonra kuadrupul kütle spektrometresi ile tespit edilir. GC-MS analizi ile elde edilen ham veriler işlenir ve her örnek için bir kromatogram olarak sunulur.Farklı kromatografik piklere karşılık gelen münferit monomerler, kendilerine özgü kütle spektrumları ile tanımlanır. GC alıkonma sürelerinde, münferit monomer miktarları, örnekler arasında monomer bolluğu ve kompozisyonunun karşılaştırılmasına olanak tanıyan iç standart miktar belirleme yöntemi kullanılarak belirlenir. Burada, bir P450 monoooksijenaz enzimini kodlayan bir genin yabanıl tipine ve iki mutant aleline karşılık gelen tavşan apsesi yaprak dokusundan salınan monomerlerin, belirgin monomerik profiller sergileyen temsili analizlerinden elde edilen üst üste bindirilmiş kromatogramlar gösterilmektedir.Sonuçlarımız, üç ana kutin monomerinin bolluğu açısından yabanıl tip ve mutant arabidopsis bitkileri arasında önemli farklılıklar olduğunu göstermektedir. Bu protokol, kurucu monomerlerinin izolasyonu, tanımlanması ve miktar tayini yoluyla bitki lipid poliesterlerinin bileşimini analiz etmek için sağlam bir yöntemdir. Prosedür ölçeklenebilir olup; kökler, tohumlar, yapraklar ve diğer bütün dokular dahil olmak üzere çeşitli bitki materyallerinin büyük miktarlarda işlenmesine kolayca uyarlanabilir.Bu teknik, yüksekten bitkilerde kütin ve suberinin biyosentez düzenlemesini ve dağılımını inceleyen çalışmalarda uygulanabilir.

isolation-compositional-analysis-plant-cuticle-lipid-polyester

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bitki manikür, suyun korunması birincil bir rol vardır ancak bitkiler üzerindeki patojen mikroorganizma girişine karşı önemli bir bariyer bir balmumu dış kaplama. Bu video, ileri ve geri genetik yaklaşımlar tarafından belirlenen bitki manikür mutant analizi göstermektedir.

Bitki Tırnak biyosentezi keşfedin Arabidopsis eceriferum Mutants

Bitki biyokütle, biyoyakıt üretimi için kullanılan olabilir önemli bir karbon-nötr yenilenebilir bir kaynaktır. Bitki biyokütle esas hücre duvarları, lignocellulosics olarak adlandırılan bir kompleks yapılara sahip kompozit malzemeden oluşmaktadır. Burada içerik ve polifenolik lignin bileşimi kapsamlı bir analiz için bir protokol açıklar.

Bitki Hücre Duvarları kapsamlı Kompozisyonel Analizi (Lignocellulosic biyokütle) Bölüm I: Lignin

Bitki biyokütle, biyoyakıt üretimi için kullanılan olabilir önemli bir karbon-nötr yenilenebilir bir kaynaktır. Bitki biyokütle esas hücre duvarları, lignocellulosics olarak adlandırılan bir kompleks yapılara sahip kompozit malzemeden oluşmaktadır. Burada içerik ve duvar türetilen karbonhidrat bileşimi kapsamlı bir analiz için bir protokol.

Bitki Hücre Duvarları Kapsamlı Kompozisyonel Analiz (Lignocellulosic biyokütle) Bölüm II: Karbonhidratlar

Polar lipid özler bireysel glycerolipids Kompozisyon ve yağ asidi kompozisyonu basit ve sağlam bir lipid profil deneyde belirlenir. Bu amaçla, glycerolipids ince tabaka kromatografisi ile izole edilir ve onların açil grupları transmethylation tabi. Yağ açil methylesters gaz-sıvı kromatografisi ile sayısallaştırılmış.

İnce Tabaka Kromatografisi (TLC) tarafından Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profil Gaz-Sıvı Kromatografi (GLC) ile birleştiğinde

Hava bitki organlarının kütikül, bir supramoleküler biopolyester-balmumu meclisi tarafından korunmaktadır. Biz katı hal NMR ve atomik kuvvet mikroskobu ile moleküler ve mikro ölçeklerde domates meyve tırnak etlerini gelen seçici olarak çıkarılmasına epi-ve intracuticular mumlar, sırasıyla izlemek ve mühendislik cuticular biopolyesters çapraz-bağlantı kapasitesi değerlendirmek için protokolleri sunuyoruz.

İzolasyon ve Meyve cuticles biyofiziksel Çalışması

Gram-negatif bakterilerin lipopolisakarit (LPS) lipid A alanı izolasyonu ve karakterize edilmesi, hücre yüzeyi antibiyotik direnç mekanizmaları göre, bakterinin yaşamda kalması ve spor ve nasıl kimyasal olarak çeşitli lipit A moleküler türün farklı olarak ana doğal immün yanıtları modüle fikir verir.

Gram-negatif bakterilerin izolasyonu ve Lipid A kimyasal karakterizasyonu

Bakteri hücre duvarı peptidoglikan, peptitler tarafından çaprazlanmış şeker iplikçiklerinden oluşan bir makromoleküler ağdır. Ultra Performanslı Sıvı Kromatografi, peptidoglikan kompozisyonunun yeni keşifleri için yüksek çözünürlük ve verim sağlar. Hücre duvarlarının izolasyonu (sakculi) ve daha sonra UPLC aracılığıyla analize hazırlanmaları için bir prosedür sunuyoruz.

Ultra Performanslı Sıvı Kromatografisi ile Bileşimsel Analiz için Bakteriyel Hücre Duvarlarının İzolasyonu ve Hazırlanması

Burada, çeşitli biyokütle kaynaklardan lignin ve etanol ayıklama gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Lignin verim ve β-O-4 içeriği ayıklama koşullardan etkisi sunulmaktadır. Seçici bozulumu yüksek aromatik monomer ürünler elde etmek için elde edilen lignins üzerinde gerçekleştirilir.

Yüksek β-O-4 içeriği ile Lignin çıkarımı hafif etanol ayıklama ve bozulumu verim üzerindeki etkisi

Sürüngenler, cilt lipidler conspecifics üzerinden cinsel, istilacı türlerin yönetimi potansiyel kullanımı ile sinyal için büyük önem taşımaktadır. Burada, biz döken deri ya da tüm hayvanların, deri lipidler ayıklamak için protokolleri açıklamak belirleme ve toplam lipid kütle analiz ve ayırma ile sütun Kromatografi kullanarak lipidler ayıran.

Kimyasal yalıtım, miktar ve sürüngenler cilt lipidler, ayrılık

Çeşitli fotosentetik organizmalarla ilişkili plastoglobül lipid damlacıklarının izolasyonu için hızlı ve etkili bir protokol sunulmaktadır. İzole plastoglobüllerin başarılı bir şekilde hazırlanması, proteomik ve lipidomik analizler gibi ayrıntılı moleküler araştırmalardan önce gelen çok önemli bir ilk adımdır.

Plastoglobül Lipid Damlacığı İzolasyonu Bitki Yaprağı Dokusu ve Siyanobakterilerden

Öğrenin bitki lipid polyesterlerinin monomer izolasyonu ve biyokimyasal analizini. Bu yöntem, bitki kütikül ve süberin biyosentezini incelemek için GC-MS ile güvenilir sonuçlar sağlar.

Bitki Tırnak Lipid Polyester Monomer İzolasyonu ve biçim Analizi

Daha fazla video keşfet