Parkinson Brains gelen Çözünür ve çözünmez alfa-sinüklein Sıralı Ekstraksiyon

Bu metodolojinin genel amacı, ölüm sonrası Parkinson beyinlerinden çözünür ve çözünmez alfa-sinükleini çıkarmaktır. Bu yöntem, Parkinson hastalığının çalışmasında önemli soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, yaygın laboratuvar reaktifleri ve aletleri kullanılarak nispeten basit bir teknik olmasıdır.

Gerekli çözeltileri ve tamponları hazırladıktan sonra, 0.5 gramlık donmuş bazal gangliyon dokusu örneğini küçük bir Petri kabına yerleştirerek başlayın. Bir milimetre karelik parçalara hızlı bir şekilde kıymak için steril bir neşter bıçağı kullanın. Kıyılmış dokuyu 15 mililitrelik bir tüpe toplayın ve tüpe 10 hacim buz gibi, 1X TBS ekleyin.

Numuneleri mekanik bir homojenizatör kullanarak 20.000 rpm'de 10 saniye boyunca homojenize edin. Sonra iki dakika buz üzerinde soğutun. Homojenizasyonu üç kez tekrarlayın, her seferinde buz üzerinde soğutun.

Homojenatı 10.000 g'da dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Ham homojenat süpernatanı polikarbonat santrifüj tüplerine aktarın ve dört santigrat derecede bir saat boyunca 100.000 g'da santrifüjleyin. Süpernatanı buz üzerindeki soğutulmuş tüplere aktarın ve bunu TBS çözünür fraksiyonu olarak tutun.

Beş hacim 1X TBS tamponunda yıkayın ve dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 100.000 gs'de santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve atın. Ardından yıkamayı tekrarlayın.

Ultrasantrifüj adımları arasında peletlerin kapsamlı bir şekilde yıkanması, bu prosedürün başarısı için kritik öneme sahiptir. SDS çökelmesini önlemek için numunelerin 10 santigrat derece sıcaklığa ulaşmasına izin verdikten sonra, beş hacim 1X TBS-SDS ekleyin ve oda sıcaklığında 20 kilohertz'de 10 saniye boyunca sonikasyon yaparak son peleti yeniden askıya alın. 25 santigrat derecede 30 dakika boyunca 100.000 g'da ultrasantrifüj.

Ultrasantrifüjlemeden sonra, süpernatanı buz üzerindeki soğutulmuş tüplere aktarın ve SDS'de çözünür fraksiyon olarak tutun. Pelete beş hacim oda sıcaklığında 1X TBS-SDS tamponu ekleyin ve 25 santigrat derecede 15 dakika boyunca 100.000 g'de santrifüjleyin. Yıkama tamponunu atın ve yıkamayı tekrarlayın.

Süpernatanı attıktan sonra, 50 mikrolitre 1X TBS-SDS-Üre ekleyin ve 10 saniye boyunca 20 kilohertz'de ayarlanmış bir sonikatör kullanarak çözündürün. Bu numuneyi ürede çözünür fraksiyon olarak etiketleyin. Prosedürde çözünmeyen tüm proteinlerin ekstrakte edildiğinden emin olmak önemlidir.

Protein tahlil reaktifleri ile uyumluluğa izin vermek için TBS-SDS-Üre örneklerini 1X TBS tamponu ile bire bir seyreltin ve üreticinin protokolüne göre ticari bir protein tahlil kiti kullanarak toplam protein içeriği için her fraksiyonu test edin. Gelecekteki donma-çözülme döngülerini azaltmak için numuneleri %10 gliserol ile 20 mikrolitrelik alikotlara ayırın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. 10 mikrolitre TBS, TBS-SDS ve TBS-SDS-Üre ekstraktlarını, standart teknikler kullanarak çalışan tampon olarak MOPS ile 10 kuyucuk, yüzde dört ila 12 Bis-Tris poliakrilamid jel üzerinde bir moleküler ağırlık işaretleyicisine yükleyin.

Jeli bir saat boyunca 200 voltta veya yükleme tamponundan gelen mavi boya jelin dibine ulaşana kadar çalıştırın. Bir naylon zarı %100 metanol içinde ıslatın ve ardından %20 metanol içeren transfer tamponuna batırın. Protein tarafını ve moleküler ağırlık boyutu belirteçlerinin yönünü belirlemek için leke üzerinde tanımlayıcı bir işaret yapın.

Jeli ıslak filtre kağıdı ile birlikte zarla birlikte sandviçleyin. Aktarımı iki saat boyunca 40 voltta gerçekleştirin. Primer antikorun membrana spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için 1X PBS-T'de% 5'lik BSA çözeltisini 70 rpm'de çalkalayarak 30 dakika boyunca bloke edin.

Protein lekesini, gece boyunca dört santigrat derecede PBS-T'de bir ila 750 oranında seyreltilmiş altı mililitre alfa-sinüklein birincil antikoru Syn-1 ile inkübe ederek araştırın. Ertesi gün, membranı 1X PBS-T ile her seferinde beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Daha sonra lekeyi, 30 dakika boyunca PBS-T'de bir ila 2.000 oranında seyreltilmiş uygun HRP konjuge ikincil antikor ile inkübe edin.

Membranı daha önce olduğu gibi 1X PBS-T ile yıkayın. Lekeleri karanlık bir odada üreticinin talimatlarına göre gelişmiş kemilüminesans solüsyonuna daldırın. Lekeleri streç filmle örtün ve otoradyografi kullanarak sinyali yakalayın.

Görüntülemeden sonra, batı lekesini altı mililitre batı lekesi sıyırma tamponu ile 10 dakika boyunca inkübe edin ve alfa-sinüklein antikor sinyalinin lekesini çıkarmak için sürekli sallayın. Membranı beta-aktin primer antikoru ile bir ila 8.000 seyreltmede araştırmak için western blot prosedürünü tekrarlayın. Son görüntüyü tarayın ve bir Tiff görüntüsüne dönüştürün ve niceleme amacıyla NIH ImageJ kullanarak yoğunlukları ölçün.

Aşağıdaki görüntüler, PD'den alfa-sinüklein seviyelerinin temsili immünoblolarıdır ve insan bazal gangliyon dokusunu kontrol eder. TBS, SDS ve ürede çözünür fraksiyonlar, western immunoblot kullanılarak alfa-sinüklein varlığı açısından analiz edildi. Her şeride 10 miligram protein yüklendi.

TBS fraksiyonunda, alfa-sinüklein monomerleri her durumda mevcuttur. Yıldız işareti muhtemelen C-terminal olarak kesilmiş bir alfa-sinüklein formunu temsil eder. SDS fraksiyonunda, alfa-sinükleinin bazı oligomerleri, PD dokusundaki katı ok ucu ile gösterilen monomerlerle birlikte görülür.

Üre fraksiyonunda, monomerler, oligomerler ve agrega alfa-sinüklein, PD vakalarında değişken olarak ifade edilir ve ilgili Lewy vücut yüklerini yansıtır. Nörolojik olarak normal kontrol örnekleri sadece küçük miktarlarda monomerik alfa-sinükleinin varlığını gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protein ekstraksiyon tekniği bir iş günü içinde yapılabilir, ardından uygun şekilde yapılırsa ertesi gün western immunoblot yapılabilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, Lewy vücut biyolojisi alanındaki araştırmacıların, patolojik insan dokusunda ve in vivo hayvan modellerinde çözünmeyen ve kümelenmiş alfa-sinüklein türlerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Sabitlenmemiş insan dokusu ile çalışmanın ihtiyati tedbirler gerektirdiğini ve tüm taşıma prosedürleri için eldiven ve laboratuvar önlüğü giyilmesi gerektiğini unutmayın.