Serbest yüzen Immünofluorescence tahlil ile kutanöz periferik sinir lifleri Alfa Synuclein toplamları hedefleme

Parkinson hastalığının tanısı hala daha sonra hastalığın seyrinde ortaya çıkan motor tutulum klinik belirtileri dayanır, substantia nigra nöronların çoğu zaten kaybolur. Bu protokol, hastalığın potansiyel yeni biyobelirtecisini temsil eden deri biyopsisi ile dermal sinirlerin analizinin klinik çalışmalarda kullanılmasını sağlar. Deri biyopsisi patolojiye yatkın periferik sinir dokusunun analizini sağlayan kolay değerlendirilebilir, invaziv olmayan bir işlemdir.

Alfa sinüklein agregaları deri biyopsisi ile algılama tanı amaçlı kullanılabilir, muhtemelen erken aşamalarında, potansiyel tedavi en etkili olduğu zaman. Aynı hastada takip deri biyopsileri insan kutanöz sinir sisteminde yayılan alfa sinüklein agregabir zaman ve özel ders analizi sağlar. Bunlar hastalığın patogenezine ışık tutabilir.

Bu yordamı başlatmak için, metin protokolütablo bir özetlenen yeni bir PLP fiksatif çözüm hazırlamak. Cilt biyopsisi toplandıktan hemen sonra, fiksatif çözelti10 mililitre içeren bir tüp batırın. Bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yat.

Ertesi gün, bir duman başlık içinde, yavaşça PLP fiksatif kaldırın. Aynı tüpte, her yıkama için 0,1 molar Sorensen çözeltisi beş mililitre kullanarak, beş dakika her biyopsi üç kez yıkayın. Sorensen çözeltisini atın ve beş mililitre kriyoprotektif solüsyon ekleyin.

Bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yat. Ertesi gün, bir kriyotom ile kesim bir hafta içinde yapılacakise biyopsiyi dört santigrat derecede saklayın. İlk olarak, kriyotomu eksi 20 santigrat dereceye ayarlayın.

Bir kriyomold alın ve kriyo-gömme orta ile doldurun. Cımbız kullanarak, biyopsiyi kriyo-gömme ortamına daldırın, uzunlamasına eksen kriyomoldun altına paralel. Snap sıvı nitrojen ile örnek dondurma, doğru yönde biyopsi içeren kriyo gömme ortamın katı bir küp elde etmek için.

Örneği kriyostat'a koyun ve biyopsinin alışması için 30 dakika bekleyin. Sonra, kriyostat üzerinde örnek düzeltmek ve 50 mikrometre bölümlerhalinde kesilmiş. Küçük bir fırça kullanarak, kriyo-kesitleri her kuyuda 200 mikrolitre antifriz çözeltisi içeren 96 kuyuluk bir plakaya aktarın.

Bundan sonra, eksi 20 santigrat derece plaka saklayın. Başlamak için, 100 mikrolitre yıkama çözeltisi ile yeni 96 kuyulu bir plakanın kuyularından bazılarını doldurun. Analiz edilecek bölümleri depolama plakasından yıkama solüsyonunu içeren bölüme aktarın.

Bulaşık çözeltisindeki bölümleri oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. Daha sonra, her bölümü aynı yıkama çözeltisini içeren boş bir kuyuya aktarın ve yıkamayı tekrarlayın. Daha sonra, bölümlere yıkama çözeltisi ekleyin ve bunları 100 mikrolitre engelleme çözeltisi içeren yeni kuyulara aktarın.

En az 90 dakika ve en fazla dört saat oda sıcaklığında kuluçka. Çalışma çözeltisinde birincil antikorlar, anti-PGP9.5 ve anti-5G4 seyreltin. Bölümleri, birincil antikorların çalışma çözeltisinin 100 mikrolitresini içeren yeni kuyulara aktarın ve oda sıcaklığında gece boyunca kuluçkaya yatırın.

Ertesi gün, daha önce açıklandığı gibi yıkama solüsyonu içeren kuyularda bölümleri yıkayın. İkincil antikorları seyreltin, PGP9.5'i tespit etmek için Keçi anti-Tavşanı ve çalışma çözümünde 5G4'ü tespit etmek için Keçi anti-Faresi. Yıkanmış bölümleri ikincil antikorların çalışma çözeltisinin 100 mikrolitresini içeren yeni kuyulara aktarın.

İkincil antikorlarla konjuge florofor ağartma önlemek için alüminyum folyo ile plaka kapağı ve 90 dakika oda sıcaklığında kuluçka. Bundan sonra, daha önce açıklandığı gibi yıkama çözeltisi iki kez bölümleri yıkayın. Yıkanmış bölümleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 100 mikrolitre DAPI içeren yeni kuyulara aktarın.

Bölümleri daha önce açıklandığı gibi yıkama çözeltisinde iki kez yıkayın. Ardından, bölümleri yanlış kıvrılmaktan kaçınarak doğru konuma getirerek bir slayta monte edin. Slayta birkaç damla montaj ortamı ekleyin ve bölümü kapak fişi ile kaplayın.

Slaytlar bir gecede kurumasını bekleyin. Ertesi gün, slaytları uygun bir kutuda dört santigrat derecede saklayın ve ışığa maruz kalmaktan kaçının. Ters floresan mikroskobu veya konfokal mikroskobu kullanarak bölümleri görüntüleyin.

Görüntüleri mikroskoba bağlı bir kamera ile elde edin. Daha sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi, uzamsal dağılım ve sinyal yoğunluğu açısından bölümlerdeki pozitif sinyalleri analiz etmek için bir floresan mikroskobu veya konfokal mikroskop kullanın. Açıklanan yöntemden sonra, PH hastalarının otonom yapılarını innerve eden dermal sinir fasiküllerinde 5G4 antikor etiketli alfa sinüklein agregaları saptanmıştır.

Alfa sinüklein mevduat morfolojisi dermal sinirlerin aksonları boyunca noktalı bir sinyal olarak görünür. Bu protokolün 19 PD'li hastada ve üç anatomik bölgede cilt biyopsilerinde 17 kontrolde temsili kullanımı, sağlıklı kontrollere kıyasla 5G4'ün %81 hassasiyete ve özgüllükte %86 özgüllük gösterdiğini göstermektedir. Fosforiyal alfa sinüklein% 56 duyarlılık ve 100% 5G4 ve fosforiile alfa sinüklein pozitif mevduat bir özgüllük ter bezleri etrafında ağırlıklı olarak bulunur, ama aynı zamanda kas arrector pili bulunur, küçük damarlar, ve subepidermal ve dermal pleksus, ama asla intraepidermal sinir liflerinde.

Genellikle, ter bezleri lümen içinde, 5G4 veya fosforilted alfa sinüklein pozitifliği olarak yanlış yorumlanabilecek spesifik olmayan bir sinyal gözlemlemek mümkündür. Bu tip sinyal noktalı, küresel, ve büyük olasılıkla intraluminal otofloresan malzeme nedeniyle birincil ve ikincil antikorlar olmadan teknik kontrollerde gösterildiği gibi. PGP9.5 ile morfolojik olarak ipliksi ve uzamış sinir liflerini işaretleyen kolokalizasyon, doğru sinyalin belirlenmesine yardımcı olur.

Bu nedenle, 5G4 sinyalinin özgüllüğü aksonal belirteç ile yapılan çift immünboyama ile yüksek oranda artmaktadır. Biyopsi doğru bir fiksasyon iyi kaliteli bir immünfloresan boyama üretmek ve floresan sinyallerin güvenilir yorumu için gereklidir. Fiksatif doğru hazırlanmış değilse, ya da bir aşırı fiksasyon oluştuysa, sonuç dermal-epidermal kavşak geçen sinir liflerinin sinyalini maskeleyecek yüksek bir otofloresans olacak, ya da ana dermal yapıları innerve.

Bu işlemin en kritik adımı doku fiksasyonudur. Otofloresan ve belirli bir sinyalden kaçınmak için PLP fiksatif çözeltisinin pH'ına ve kuluçka zamanlamasına dikkat edin.