Paralel Segment Akış Sütun Tuning ve Multipleks Algılama etkinleştirme

Bu HPLC prosedürünün genel amacı, çoklu tespiti mümkün kılmak için paralel segmentli akış kolonunu optimize etmektir. Bu yöntem; sağlık ve refah, çevre bilimleri, adli tıp ve biyokeşif gibi karmaşık örneklerin analizini gerektiren tüm alanlardaki temel sorulara yanıt vermektedir. Bu teknik, kapsamlı örnek analizine olanak tanırken aynı zamanda karmaşık karışımlardaki maddelerin kimyasal ve biyoaktif doğaları hakkında bilgi sağlamaktadır.

Çoklu tespit protokolleri aynı zamanda hızlı analiz imkanı da sunar. Bu yöntem; kahve ve şarap gibi karmaşık karışımların kimyasal parmak izini belirlemeye yönelik stratejilerin geliştirilmesine olanak tanıyarak, üreticilerin kendi ürünleri ile ucuz taklit çeşitleri arasındaki farkı ayırt etmelerini sağlar. Başlangıçta, doğru bir analiz için numunenin tamamını tek bir dedektöre göndermemek alışılmadık gelebilir.

Buna karşın, her bir akış hattındaki analit konsantrasyonu, konvansiyonel bir kolonun toplam akış hattından daha yüksektir. Başlamak için, HPLC cihazını sırasıyla A ve B mobil fazlar için %100 UE su ve saf metanol ile hazırlayın. Eğer bir MS dedektörü kullanılacaksa, her iki mobil faza %0,1 formik asit ekleyin ve ardından HPLC pompalarını üreticinin talimatlarına göre temizleyin.

MS UV VS ve DPPH detektörlerini üretici talimatlarına uygun olarak birleştirin. Detektör hatlarındaki ölü hacmin minimum düzeyde olması için bileşenlerin uygun şekilde düzenlendiğinden emin olun.

Ardından UV VISTA dedektör dalga boyunu, buradaki örneğe özgü dalga boyuna ayarlayın. MS dedektörü için 280 nanometre. Toplam iyon sayımı veya TIC analizi için tam tarama tespit yöntemiyle pozitif modu kullanın.

MS detektörünün sıcaklık ve gaz akışını şu değerlere getirin. Buharlaştırıcı sıcaklığı 500 °C, kapiler sıcaklığı 350 °C, yardımcı gaz akışı 40 birim, süpürme gazı akışı beş birim, kılıf gazı hızı 60 birim ve sprey voltajı 3,5 kV. DPPH radikal reaktifi hazırlamak için 25 mg DPPH radikalini bir balon jojede 250 mL metanol içinde çözerek başlayın.

Çözeltiye 250 µL formik asit ekleyin ve çözeltiyi 10 dakika boyunca sonikasyon işlemine tabi tutun. Ardından, ışığa maruz kalmasını önlemek için balonu ve folyoyu kapatın. Son olarak, DPPH radikal sistemini kurmak için üreticinin önerdiği şekilde pompayı DPPH radikal çözeltisiyle temizleyin.

Pompa hattının bir T parçanın girişine sabitlendiğinden emin olun ve ardından 100 µL reaksiyon bobinini T parçanın çıkışına bağlayın. Detektörü reaksiyon bobini ENC kasasının diğer ucuna, reaksiyon bobinine ve bir kolon ısıtıcıya bağlayın. Son olarak, DPPH radikal UV detektörünü 520 nm'ye ayarlayın.

Paralel segmentli akış veya PSF kolonu oluşturmak için önce kolon girişini HPLC cihazına bağlayın. Ardından, merkezi portu MS dedektörüne bağlamak için bir boru parçası kullanın. Bir çevre kolon portunu UV VS dedektörüne, bir diğerini ise DPPH radikal tespit sisteminin T parçasına bağlamak için aynı boyutlardaki boruları kullanın.

Kullanılmayan tüm çevre portlarını kolon tıpalarıyla kapatın. 4,6 mm iç çaplı ve 250 mm uzunluğundaki bir kolon için HPLC akış hızını, %100 mobil faz B ile dakikada bir mililitreye ayarlayın. 20 dakika boyunca dengeleyin.

PSF sistemini ayarlamaya başlamak için önce boş toplama kaplarını hazırlayın. UV VS. ve DPPH radikal portlarından mobil fazı ayrı ayrı toplamak için bu flakonları kullanın. Toplama süresini not edin ve her bir kapta en az 500 miligram çözücü toplayın.

Ardından, mobil fazın kütlesini belirlemek için toplama kaplarını tartın ve her bir porttan toplanan mobil faz hacmini hesaplamak için kütleyi metanolün yoğunluğuna bölün. Son olarak, MS dedektörüne giden akış hızını belirleyin ve metin protokolünde belirtildiği gibi, tüm dedektörlerin akış oranlarını toplam akışın yüzdesi olarak hesaplayın. Akış oranları ideal değerlerden önemli ölçüde saparsa, geri basıncı ayarlamak için gerektiğinde ek borular ekleyin ve toplama ile hesaplama işlemini tekrarlayın.

Son olarak, DPPH radikal reaktif pompasının akış hızını, detektöre bağlı çıkış portunun akış hızıyla eşleşecek şekilde ayarlayın. Bir kahve örneği üzerinde çoklu HPLC analizi gerçekleştirilmiştir. DPPH radikal UV ve MS kromatogramlarının eş zamanlı olarak kaydedilebilme yeteneği, örnekteki DPPH radikaline pozitif yanıt veren bileşiklerin UV kromatogramıyla kolayca eşleştirilmesini sağlar.

Retansiyon süresi hizalamasına dayalı MS yanıtlarında, MSS TIC detektöründen pozitif bir yanıt alındığında piklerin moleküler kütlesi kaydedilmiştir. Farklı deteksiyon süreçleri arasındaki piklerin kolayca eşleştirilebilmesi, kahve gibi kompleks bir örnek için hızlı ve daha verimli bir tarama ve karakterizasyon imkanı sağlar. Bu prosedür takip edildiğinde, teknik bir kez kavrandıktan sonra yaklaşık bir saat içinde kurulabilir ve örnek analizine hazır hale getirilebilir. Ek örnek bilgileri elde etmek için kırılma indisi floresansı gibi diğer detektörler ve kemilüminesans gibi kimya tabanlı deteksiyon yöntemleri kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, karmaşık bir örneği daha iyi anlamak için çoklu tespit süreçlerinin önemini kavramış olmalısınız. Ayrıca, paralel bölmeli akış kolonları kullanılarak yapılan çoklu tespit, biyolojik keşif gerçekleştirmek için son derece verimli bir yöntemdir.