Mesaj Sütun Türevlendirme Reaksiyon Akış Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi sütunlar kullanma
April 26th, 2016
Post kolon türevlendirmesi (PCD) kullanan yöntemler için reaksiyon akışlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi kolonlarının kullanımına yönelik bir protokol sunulmuştur.
Bu yöntemin genel amacı, bir reaksiyon akış kolonu kullanarak yüksek performanslı sıvı kromatografisinin kolon türevlendirme sonrası veya PCD yönteminin verimliliğini ve hassasiyetini iyileştirmektir. Bu yöntem, HPLC dedektörlerine düşük yanıt veren bileşiklerin analiz edildiği farmasötik, biyomedikal ve çevre bilimleri gibi alanlardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, reaksiyon bobinlerine ihtiyaç duyulmamasıdır.
Kolon atık suyunun karıştırılması ve reaktifin türetilmesi geleneksel yöntemlerden daha verimli bir şekilde gerçekleşir. Bu yöntem, antioksidanlar, amino asitler ve fenoller hakkında bilgi sağlamak için kullanılmıştır. Ayrıca tiyoller, metaller, antibiyotikler ve toksinler gibi diğer sınıf bileşiklere de uygulanabilir.
Numunenin tamamı türetilmese de, alt bant genişlemesi nedeniyle, atık akış akışı içindeki analit konsantrasyonu, geleneksel kolon sonrası türevlendirme analizinden daha yüksektir. Bu prosedüre başlamak için, HPLC cihazını mobil faz olarak Hat A'da %100 su ve Hat B'de %100 metanol ile hazırlayın ve pompaları üreticinin gereksinimlerine göre boşaltın. HPLC enstrümantal bileşenlerini ve ek türevlendirme pompasını kurun.
Bunu takiben, UV/VIS dedektörünü 520 nanometre dalga boyunda analiz edecek şekilde ayarlayın. Reaksiyon akışının girişini veya RF sütununu HPLC cihazına bağlayın. 15 santimetre uzunluğunda 0.13 milimetre iç çaplı boru kullanarak UV/VIS dedektörüne bir çıkış çevresel bağlantı noktası bağlayın.
Ardından, DPPH pompa hattını RF kolonunun çıkışındaki çevresel bir bağlantı noktasına bağlayın. Bir sütun durdurucu kullanarak RF sütununun çıkışındaki kullanılmayan çevresel bağlantı noktasını engelleyin. 15 santimetre uzunluğunda 0.13 milimetre iç çaplı bir boruyu RF kolonunun çıkış merkezi bağlantı noktasına bağlayın.
HPLC pompasının akış hızını %100 metanolde dakikada bir milimetreye getirin. Ardından sütunu 10 dakika boyunca% 100 metanol ile dengeleyin. Bu noktada, mililitre başına 0.1 miligramlık bir DPPH ve metanol çözeltisi hazırlayın.
DPPH reaktifini içeren şişeyi 10 dakika boyunca sonikleştirin. DPPH pompasını üreticinin gereksinimlerine göre hazırlanan DPPH reaktifi ile boşaltın. Bunu takiben, iki kuru ve temiz kap alın ve birini merkezi olarak etiketleyin ve diğerini çevre birimi olarak etiketleyin "İki kabı doğru bir şekilde tartın.
Merkezi limandan çıkan atık suyu bir dakika boyunca "merkezi" etiketli gemiye toplayın. Merkezi liman gemisini yeniden tarttıktan sonra, merkezi limandan gelen akışın ağırlığını hesaplayın. RF sütununun çevresel bağlantı noktasına bağlı UV/VIS'den çıkan atık su için önceki adımları tekrarlayın.
Çevresel liman kabının ağırlığını hesaplayın. Ardından, merkezi ve çevresel bağlantı noktalarından gelen akışın yüzdesini hesaplayın. Akış oranı doğru olana kadar önceki adımları tekrarlayın, ardından DPPH pompasının akış hızını dakikada 0.5 mililitre olarak ayarlayın.
Çalışma bittiğinde, türevlendirme reaktif pompası akışını durdurun. DPPH reaktif pompa hattını çevresel bağlantı noktasından çıkarın ve bağlantı noktasını durdurun. Kolonu depolanacağı mobil faz ile dengeleyin ve mobil fazın kolondan 10 dakika boyunca dakikada bir milimetre hızla geçmesine izin verin.
Ardından, HPLC cihazındaki kabarcık faz pompasının akışını durdurun. Son olarak, DPPH reaktifini metanol ile değiştirin ve ek pompayı boşaltın. Hem konvansiyonel PCD hem de RF-PCD enstrümantasyonu kullanılarak bir DPPH radikali ile türetilen bir ristretto kahve numunesinin iki kromatogramı burada gösterilmektedir.
Hem RF-PCD hem de konvansiyonel PCD modlarında analiz edilen amino asitlerin her biri için hesaplanan miktar tayini ve tespit limitleri burada listelenmiştir. Konvansiyonel PCD yöntemi, RF-PCD yöntemi ve RF-PCD yönteminden türetilmemiş akış kullanılarak analiz edilen dört amino asidin bir kromatogramı burada gösterilmektedir. Hem konvansiyonel PCD hem de RF-PCD yöntemleri kullanılarak glisin ve lösine bağlı pikler için elde edilen sinyallerin bir karşılaştırması burada gösterilmektedir.
Konvansiyonel PCD yöntemi, RF-PCD yöntemi ve RF-PCD yönteminden türetilmemiş akış kullanılarak analiz yapılırken triptofan zirvesinin tepe genişliğinin bir karşılaştırması burada gösterilmektedir. Türevlendirme şemasına yanıt gösteren bazı bileşenleri içeren ve bazılarını içermeyen 21 bileşenli bir test numunesi ayrıldı, türetildi ve tespit edildi. Aynı karışım da ayrıldı ve karşılaştırma için türetilmemiş olarak tespit edildi.
Hem RF-PCD sütunu kullanılarak türetilmiş hem de türetilmemiş olan para-Kresolün tepe şeklinin bir karşılaştırması burada gösterilmektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik geleneksel kolon sonrası türevlendirme analizi ile aynı anda kurulabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, öngörülen akış oranlarına mümkün olduğunca yakın olmayı unutmamak önemlidir.
Bu prosedürü takiben, diğer bileşikleri analiz etmek için OPA, ninhidrin veya halojenler gibi diğer kolon sonrası türevlendirme reaktifleri kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir reaksiyon akış sütununun nasıl kurulacağı ve ayarlanacağı konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, reaksiyon akış sütunlarını kullanarak yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) sütun sonrası türevlendirme (PCD) verimliliğini ve hassasiyetini artırmak için bir protokol sunmaktadır. Bu yöntem, çeşitli bilim alanlarında HPLC dedektörlerine karşı düşük yanıt veren bileşiklerin analizinde özellikle yararlıdır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Eczacilik Bilimleri
- Biyomedikal Bilimler
- Çevre Bilimleri
Arka Plan
- Yüksek performanslı sıvı kromatografisi, bileşik analizinde yaygın olarak kullanılır.
- Sütun sonrası türevlendirme, algılama hassasiyetini artırır.
- Geleneksel yöntemler genellikle reaksiyon bobinleri gerektirir, bu yöntem bu gerekliliği ortadan kaldırır.
- Sütun akışı ve reaktiflerin verimli karıştırılması sağlanır.
Çalışmanın Amacı
- HPLC PCD yöntemlerinin verimliliğini artırmak.
- Düşük dedektör yanıtlarına sahip bileşikleri analiz etmek.
- Çeşitli bileşik sınıfları hakkında bilgiler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Reaksiyon akış yüksek performanslı sıvı kromatografisi sütunlarının kullanımı.
- Sütun sonrası türevlendirme teknikleri.
- Antioksidanlar, amino asitler ve fenollerin analizi.
- Tiyollar, metaller, antibiyotikler ve toksinler için uygulama.
Ana Sonuçlar
- Bileşik algılamadaki verimlilik ve hassasiyette artış.
- Reaksiyon bobinlerinin ortadan kaldırılması yöntemi performansını iyileştirir.
- Birden fazla bileşik sınıfında başarılı uygulama.
- Karmaşık biyokimyasal etkileşimlere dair kazanılmış bilgiler.
Sonuçlar
- Reaksiyon akış sütun yöntemi, HPLC PCD'yi önemli ölçüde iyileştirir.
- Bu teknik, çeşitli bilimsel uygulamalar için esnektir.
- Gelecek çalışmaları, diğer analitik alanlarda kullanımını genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Post column derivatization (PCD) enhances detection sensitivity for low-response analytes in pharmaceutical and biomedical research, but conventional methods suffer from band broadening due to large reaction coils. Reaction flow PCD (RF-PCD) eliminates this limitation by enabling efficient mixing within the column, improving separation efficiency and signal-to-noise ratio. This advancement supports reliable quantification of compounds such as amino acids, antioxidants, and phenols, directly impacting assay sensitivity in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables detection of underivatized analytes from the central port, allowing parallel monitoring of native and modified species for mechanistic insight.
- Operational Value: Eliminates reaction coils, reducing system dead volume and minimizing band broadening to preserve chromatographic resolution.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Improves signal-to-noise ratio for low-abundance compounds, enhancing detection limits in antioxidant, amino acid, and phenol assays.
- Operational Value: Uses standard HPLC components with a derivatization pump, enabling straightforward integration into existing analytical platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports analysis of diverse compound classes including thiols, metals, antibiotics, and toxins, broadening applicability across safety and metabolite profiling studies.
- Operational Value: Maintains compatibility with UV/VIS detection at 520 nm, allowing seamless adoption without requiring new instrumentation.
Pipeline & Workflow Integration
RF-PCD fits within the discovery continuum by improving detection reliability in early-stage screening, where sensitive quantification of bioactive compounds informs lead identification and prioritization.
- Discovery Biology: Enhances confidence in detecting low-response metabolites and biomarkers by improving analytical sensitivity without derivatization inefficiencies.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs through minimized reaction volume and efficient mixing, supporting high-throughput compound evaluation.
- Analytics: Enables direct comparison of derivatized and underivatized streams, providing internal controls for assay validation and data normalization.
- Translational Research: Facilitates continuous monitoring of analytes from discovery through preclinical studies by preserving analyte integrity and detection fidelity.
- Enterprise Reuse: Leverages existing HPLC infrastructure with minimal added complexity, promoting cross-departmental standardization and method portability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in analyte detection by reducing false negatives from insensitivity and improving signal clarity.
- Operational Value: Improves reproducibility and scalability by removing variability associated with reaction coil preparation and mixing efficiency.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions in lead optimization by delivering more accurate structure-activity relationship data from sensitive detection.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of candidates by improving data quality in early ADME and toxicity screening assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in HPLC method development and flow rate optimization to balance derivatization reagent and mobile phase flows.
- Needs a dedicated derivatization pump and compatible tubing (0.13 mm ID) for precise reagent delivery to peripheral ports.
- Demands standardization of flow ratios between central and peripheral ports to ensure consistent derivatization efficiency across runs.
- Involves routine maintenance such as purging and equilibration steps to prevent reagent carryover and ensure column stability.
- Limited to one- or two-component derivatization reactions where both reagents can be introduced simultaneously via peripheral ports.
