Mesaj Sütun Türevlendirme Reaksiyon Akış Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi sütunlar kullanma
26 Nisan 2016
Post kolon türevlendirmesi (PCD) kullanan yöntemler için reaksiyon akışlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi kolonlarının kullanımına yönelik bir protokol sunulmuştur.
Bu yöntemin genel amacı, bir reaksiyon akış kolonu kullanarak yüksek performanslı sıvı kromatografisinin kolon türevlendirme sonrası veya PCD yönteminin verimliliğini ve hassasiyetini iyileştirmektir. Bu yöntem, HPLC dedektörlerine düşük yanıt veren bileşiklerin analiz edildiği farmasötik, biyomedikal ve çevre bilimleri gibi alanlardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, reaksiyon bobinlerine ihtiyaç duyulmamasıdır.
Kolon atık suyunun karıştırılması ve reaktifin türetilmesi geleneksel yöntemlerden daha verimli bir şekilde gerçekleşir. Bu yöntem, antioksidanlar, amino asitler ve fenoller hakkında bilgi sağlamak için kullanılmıştır. Ayrıca tiyoller, metaller, antibiyotikler ve toksinler gibi diğer sınıf bileşiklere de uygulanabilir.
Numunenin tamamı türetilmese de, alt bant genişlemesi nedeniyle, atık akış akışı içindeki analit konsantrasyonu, geleneksel kolon sonrası türevlendirme analizinden daha yüksektir. Bu prosedüre başlamak için, HPLC cihazını mobil faz olarak Hat A'da %100 su ve Hat B'de %100 metanol ile hazırlayın ve pompaları üreticinin gereksinimlerine göre boşaltın. HPLC enstrümantal bileşenlerini ve ek türevlendirme pompasını kurun.
Bunu takiben, UV/VIS dedektörünü 520 nanometre dalga boyunda analiz edecek şekilde ayarlayın. Reaksiyon akışının girişini veya RF sütununu HPLC cihazına bağlayın. 15 santimetre uzunluğunda 0.13 milimetre iç çaplı boru kullanarak UV/VIS dedektörüne bir çıkış çevresel bağlantı noktası bağlayın.
Ardından, DPPH pompa hattını RF kolonunun çıkışındaki çevresel bir bağlantı noktasına bağlayın. Bir sütun durdurucu kullanarak RF sütununun çıkışındaki kullanılmayan çevresel bağlantı noktasını engelleyin. 15 santimetre uzunluğunda 0.13 milimetre iç çaplı bir boruyu RF kolonunun çıkış merkezi bağlantı noktasına bağlayın.
HPLC pompasının akış hızını %100 metanolde dakikada bir milimetreye getirin. Ardından sütunu 10 dakika boyunca% 100 metanol ile dengeleyin. Bu noktada, mililitre başına 0.1 miligramlık bir DPPH ve metanol çözeltisi hazırlayın.
DPPH reaktifini içeren şişeyi 10 dakika boyunca sonikleştirin. DPPH pompasını üreticinin gereksinimlerine göre hazırlanan DPPH reaktifi ile boşaltın. Bunu takiben, iki kuru ve temiz kap alın ve birini merkezi olarak etiketleyin ve diğerini çevre birimi olarak etiketleyin "İki kabı doğru bir şekilde tartın.
Merkezi limandan çıkan atık suyu bir dakika boyunca "merkezi" etiketli gemiye toplayın. Merkezi liman gemisini yeniden tarttıktan sonra, merkezi limandan gelen akışın ağırlığını hesaplayın. RF sütununun çevresel bağlantı noktasına bağlı UV/VIS'den çıkan atık su için önceki adımları tekrarlayın.
Çevresel liman kabının ağırlığını hesaplayın. Ardından, merkezi ve çevresel bağlantı noktalarından gelen akışın yüzdesini hesaplayın. Akış oranı doğru olana kadar önceki adımları tekrarlayın, ardından DPPH pompasının akış hızını dakikada 0.5 mililitre olarak ayarlayın.
Çalışma bittiğinde, türevlendirme reaktif pompası akışını durdurun. DPPH reaktif pompa hattını çevresel bağlantı noktasından çıkarın ve bağlantı noktasını durdurun. Kolonu depolanacağı mobil faz ile dengeleyin ve mobil fazın kolondan 10 dakika boyunca dakikada bir milimetre hızla geçmesine izin verin.
Ardından, HPLC cihazındaki kabarcık faz pompasının akışını durdurun. Son olarak, DPPH reaktifini metanol ile değiştirin ve ek pompayı boşaltın. Hem konvansiyonel PCD hem de RF-PCD enstrümantasyonu kullanılarak bir DPPH radikali ile türetilen bir ristretto kahve numunesinin iki kromatogramı burada gösterilmektedir.
Hem RF-PCD hem de konvansiyonel PCD modlarında analiz edilen amino asitlerin her biri için hesaplanan miktar tayini ve tespit limitleri burada listelenmiştir. Konvansiyonel PCD yöntemi, RF-PCD yöntemi ve RF-PCD yönteminden türetilmemiş akış kullanılarak analiz edilen dört amino asidin bir kromatogramı burada gösterilmektedir. Hem konvansiyonel PCD hem de RF-PCD yöntemleri kullanılarak glisin ve lösine bağlı pikler için elde edilen sinyallerin bir karşılaştırması burada gösterilmektedir.
Konvansiyonel PCD yöntemi, RF-PCD yöntemi ve RF-PCD yönteminden türetilmemiş akış kullanılarak analiz yapılırken triptofan zirvesinin tepe genişliğinin bir karşılaştırması burada gösterilmektedir. Türevlendirme şemasına yanıt gösteren bazı bileşenleri içeren ve bazılarını içermeyen 21 bileşenli bir test numunesi ayrıldı, türetildi ve tespit edildi. Aynı karışım da ayrıldı ve karşılaştırma için türetilmemiş olarak tespit edildi.
Hem RF-PCD sütunu kullanılarak türetilmiş hem de türetilmemiş olan para-Kresolün tepe şeklinin bir karşılaştırması burada gösterilmektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik geleneksel kolon sonrası türevlendirme analizi ile aynı anda kurulabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, öngörülen akış oranlarına mümkün olduğunca yakın olmayı unutmamak önemlidir.
Bu prosedürü takiben, diğer bileşikleri analiz etmek için OPA, ninhidrin veya halojenler gibi diğer kolon sonrası türevlendirme reaktifleri kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir reaksiyon akış sütununun nasıl kurulacağı ve ayarlanacağı konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, reaksiyon akış kolonları kullanarak yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kolon sonrası türevlendirme (PCD) yönteminin verimliliğini ve hassasiyetini artırmaya yönelik bir protokol sunmaktadır. Bu yöntem, çeşitli bilimsel alanlarda HPLC dedektörlerine düşük yanıt veren bileşiklerin analizinde özellikle yararlıdır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Farmasötik Bilimler
- Biyomedikal Bilimler
- Çevre Bilimleri
Arka Plan
- Yüksek performanslı sıvı kromatografisi, bileşik analizi için yaygın olarak kullanılır.
- Kolon sonrası türevlendirme, tespit hassasiyetini artırır.
- Geleneksel yöntemler genellikle bu yöntemin ortadan kaldırdığı reaksiyon bobinleri gerektirir.
- Kolon efllüentinin ve reaktiflerin etkili bir şekilde karıştırılması sağlanır.
Çalışmanın Amacı
- HPLC PCD yöntemlerinin verimliliğini artırmak.
- Düşük dedektör yanıtına sahip bileşikleri analiz etmek.
- Çeşitli bileşik sınıfları hakkında bilgi sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Reaksiyon akışlı yüksek performanslı sıvı kromatografi kolonlarının kullanımı.
- Kolon sonrası türevlendirme teknikleri.
- Antioksidanların, amino asitlerin ve fenollerin analizi.
- Tiyollere, metallere, antibiyotiklere ve toksinlere uygulama.
Temel Sonuçlar
- Bileşik tespitinde artırılmış verimlilik ve hassasiyet.
- Reaksiyon bobinlerinin ortadan kaldırılması yöntem performansını iyileştirir.
- Birden fazla bileşik sınıfında başarılı uygulama.
- Karmaşık biyokimyasal etkileşimlere dair kazanılan içgörüler.
Sonuçlar
- Reaksiyon akış kolonu yöntemi, HPLC PCD'yi önemli ölçüde iyileştirir.
- Bu teknik, çeşitli bilimsel uygulamalar için çok yönlüdür.
- Gelecekteki çalışmalar, bu yöntemin diğer analitik alanlardaki kullanımını genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Kolon sonrası türevlendirme (PCD), farmasötik ve biyomedikal araştırmalarda düşük yanıt veren analitlerin tespit hassasiyetini artırır, ancak geleneksel yöntemler büyük reaksiyon bobinleri nedeniyle bant genişlemesinden etkilenir. Reaksiyon akışlı PCD (RF-PCD), kolon içinde verimli karıştırmayı sağlayarak bu kısıtlamayı ortadan kaldırır, böylece ayırma verimliliğini ve sinyal-gürültü oranını iyileştirir. Bu ilerleme, amino asitler, antioksidanlar ve fenoller gibi bileşiklerin güvenilir şekilde miktar tayini yapılmasını destekleyerek, erken keşif iş akışlarındaki analiz hassasiyetini doğrudan etkiler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Merkezi porttan türevlendirilmemiş analitlerin tespitine olanak tanıyarak, mekanistik içgörü için doğal ve modifiye türlerin paralel izlenmesini sağlar.
- Operasyonel Değer: Reaksiyon bobinlerini ortadan kaldırarak sistem ölü hacmini azaltır ve kromatografik çözünürlüğü korumak için bant genişlemesini minimize eder.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Düşük bolluktaki bileşikler için sinyal-gürültü oranını iyileştirerek antioksidan, amino asit ve fenol analizlerindeki tespit limitlerini artırır.
- Operasyonel Değer: Bir türevlendirme pompası ile standart HPLC bileşenlerini kullanarak, mevcut analitik platformlara kolay entegrasyon sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Thioller, metaller, antibiyotikler ve toksinler dahil olmak üzere çeşitli bileşik sınıflarının analizini destekleyerek, güvenlik ve metabolit profilleme çalışmaları genelindeki uygulanabilirliği genişletir.
- Operasyonel Değer: 520 nm'de UV/VIS deteksiyonuyla uyumluluğu koruyarak, yeni enstrümantasyon gerektirmeden sorunsuz bir şekilde benimsenmesine olanak tanır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
RF-PCD, biyoaktif bileşiklerin hassas kantifikasyonunun öncü bileşik tanımlama ve önceliklendirmeye veri sağladığı erken aşama taramalarda saptama güvenilirliğini artırarak keşif sürekliliğine katkıda bulunur.
- Keşif Biyolojisi: Türevlendirme verimsizliklerini ortadan kaldırarak analitik hassasiyeti artırır ve düşük yanıtlı metabolitlerin ve biyobelirteçlerin tespitindeki güvenilirliği yükseltir.
- Tarama: Minimize edilmiş reaksiyon hacmi ve verimli karıştırma yoluyla kantitatif, tekrarlanabilir çıktılar sağlayarak yüksek kapasiteli bileşik değerlendirmesini destekler.
- Analitikler: Türevlendirilmiş ve türevlendirilmemiş akışların doğrudan karşılaştırılmasına olanak tanıyarak assay validasyonu ve veri normalizasyonu için dahili kontroller sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Analit bütünlüğünü ve tespit sadakatini koruyarak, keşif aşamasından preklinik çalışmalara kadar analitlerin sürekli izlenmesini kolaylaştırır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Mevcut HPLC altyapısını minimum ek karmaşıklıkla kullanarak departmanlar arası standardizasyonu ve yöntem taşınabilirliğini teşvik eder.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Duyarsızlıktan kaynaklanan yanlış negatifleri azaltarak ve sinyal netliğini artırarak analit tespitindeki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Reaksiyon bobini hazırlama ve karıştırma verimliliği ile ilişkili değişkenlikleri ortadan kaldırarak tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği iyileştirir.
- Stratejik Değer: Hassas tespit sayesinde daha doğru yapı-aktivite ilişkisi verileri sunarak, öncü bileşik optimizasyonundaki karar verme süreçlerini destekler.
- Portföy Etkisi: Erken ADME ve toksisite tarama analizlerinde veri kalitesini artırarak, adayların risk ayarlı şekilde ilerletilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Türevleme reaktifi ve mobil faz akışlarını dengelemek için HPLC yöntem geliştirme ve akış hızı optimizasyonu konusunda uzmanlık gerektirir.
- Periferik portlara hassas reaktif iletimi için özel bir türevleme pompası ve uyumlu borulama (0.13 mm ID) gereklidir.
- Çalışmalar boyunca tutarlı türevleme verimliliği sağlamak için merkezi ve periferik portlar arasındaki akış oranlarının standartlaştırılmasını gerektirir.
- Reaktif taşınmasını önlemek ve kolon stabilitesini sağlamak için temizleme (purging) ve dengeleme (equilibration) adımları gibi rutin bakımları içerir.
- Her iki reaktifin periferik portlar aracılığıyla eş zamanlı olarak eklenebildiği tek veya iki bileşenli türevleme reaksiyonları ile sınırlıdır.
