Yüksek basınçlı Sıvı Kromatografi ile Glukosinolat Ekstraksiyon ve Analiz A Basit Yöntemi (HPLC)
15 Mart 2017
Burada, öğütülmüş bitki materyallerinden glukozinolatların ekstraksiyonu için yerleşik ve sağlam bir protokolü ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Ekstraktların kolon üzerinde sülfataz muamelesinden sonra, desülfoglukozinolatlar ayrıştırılır ve yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ile analiz edilir.
Bu protokolün genel amacı, bitkilerde ve diğer biyolojik örneklerde glukozinolatların kolay ve anlaşılır bir analizini yapmaktır. Glukozinolatları ekstrakte etmek ve analiz etmek için kullanılan bu yöntem, bitki-böcek ekolojisi, bitki patolojisi, bitki ıslahı ve gıda bilimlerindeki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin ana avantajı, iyi doğrulanmış olması ve çok çeşitli biyolojik numunelere geniş çapta uygulanabilir olmasıdır.
Bu yöntem esas olarak bitki materyallerindeki glukozinolatların miktarını belirlemek için kullanılsa da, topraklara veya hazırlanmış gıda maddelerine de uygulanabilir. Bu ekstraksiyon prosedürü hemen hemen her laboratuvarda gerçekleştirilebilir, çünkü çoğunlukla standart laboratuvar ekipmanı kullanırsınız. Genellikle bu yönteme yeni başlayan bireyler, filmi en az bir kez okuyup gözlemlediklerinde analizleri ve incelemeyi daha iyi yapacaklardır.
Prosedüre başlamak için 10 gram G-25 çapraz bağlı dekstrin jeli 125 mililitre ultra saf su ile karıştırın. Karışımı 4 santigrat derecede kapaklı bir şişede saklayın. Daha sonra, 10.000 birim tip H-1 arilsülfatazı 30 mililitre ultra saf suda çözün.
Buna 30 mililitre mutlak etanol ekleyin ve karışımı iyice karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 2.650 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı bir beherde 90 mililitre mutlak etanol ile birleştirin.
Karıştırın ve yeni santrifüj tüplerine dökün. Karışımı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 1.030 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
Peletleri toplam 25 mililitre ultra saf suda çözün ve birleştirin. Karışımı iyice vorteksleyin ve ardından karışımı 1 mililitrelik tüplere aktarın. Sülfat örneklerini 20 santigrat derecede bir yıla kadar saklayın.
Daha sonra, yaklaşık 90 miligram sinogram tartın ve ağırlığı 1 mikrogram hassasiyetle kaydedin. Daha sonra sinogram monohidratı 10 mililitre ultra saf suda çözün. Bu sinogram stok çözeltisinden, 50 ila 750 mikromolar arasında değişen konsantrasyonlara sahip beş referans çözeltisi hazırlayın.
Referans çözeltileri 20 santigrat derecede 1,5 mililitrelik tüplerde saklayın. Ardından, her numune ve referans için 2 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünü sütun rafı konumunda etiketleyin. Daha sonra dondurarak kurutma için her bir mikrosantrifüj tüp kapağını bir diseksiyon iğnesi ile delin.
Etiketli tüpleri, etiketli sütunlarla aynı konfigürasyonda ve aralıkta bir bloğa yerleştirin. Cam pipet kolonlarını hazırlamak için, 1 santimetreye 1 santimetrelik bir cam yünü parçasını pipete hafifçe bastırmak için tahta veya cam çubuk kullanın. Cam yününü, pipet haznesinin gövdeye geçişinde paketleyin.
Raftaki etiketli her konuma bir pipet sütunu yerleştirin. Rafı bir atık tepsisinin üzerine yerleştirin. 1 mililitrelik plastik bir pipet ucunun ucunu kesin.
Hazırlanan dekstrin jelini iyice çalkalayın. Ardından, her sütuna 0,5 mililitre hazırlanmış dekstrin jeli yüklemek için genişletilmiş pipet ucunu kullanın. Kolonlarda dekstrin jel sızıntısı olup olmadığını kontrol edin ve sızıntı yapan kolonları değiştirin.
Tüm sütunlar dekstrin jeli ile doldurulduktan sonra, her sütunu 1 mililitre ultra saf su ile yıkayın. 50 ila 100 miligram serbest adım ağırlığında, güvenlik kapaklı 2 mililitrelik bir reaksiyon tüpünde ince öğütülmüş bitki materyali ve ağırlığı 0,1 miligram hassasiyetle kaydedin. Her tüpe iki adet 3 milimetre çapında metal küre yerleştirin.
Her tüpe ultra saf suda 1 mililitre% 70 metanol ekleyin ve her karışımı kısaca girdaplayın. Tüpleri ek güvenlik kapaklarıyla kapatın ve hemen 90 ila 92 santigrat derece su banyosuna yerleştirin. Testere ucu kaynamaya başlayana kadar tüpleri ısıtın.
Tüpleri ultrasonik bir banyoya aktarın ve numuneleri 15 dakika boyunca sonik olarak ısıtın. Sonikasyon sırasında, sülfat örneğini ve sinogram referanslarını çözmeye başlayın. Sonikasyondan sonra, numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2, 700 kez G'de santrifüjleyin.
Süpernatanları ve çözülmüş sinogram referanslarını, bitki maddesini pipete çekmemeye dikkat ederek ilgili sütunlara yükleyin. Her tüpe 1 mililitre% 70 metanol ekleyin. Karışımları girdaplayın.
Ve karışımları 15 dakika boyunca ultrasonik olarak ısıtın. Tüpleri daha önce olduğu gibi aynı koşullar altında tekrar santrifüjleyin. Süpernatanları ilgili sütunlara yükleyin.
Her sütuna iki adet 1 mililitrelik %70 metanol porsiyon ekleyin ve sütunların her porsiyon arasında kurumasına izin verin. Her sütundan kalan metanolü 1 mililitre ultra saf su ile yıkayın. Daha sonra, her bir sütunu iki adet 1 mililitrelik 20 milimolar sodyum asetat tamponu, pH 5.5 ile yıkayın.
Sodyum asetat tamponunun son kısımları atık rafına boşaltıldıktan sonra, rafı atık tepsisinden çıkarın ve rafın ayaklarını mendille kurulayın. Rafı, etiketli mikrosantrifüj tüpleri bloğunun üzerine yerleştirin, böylece kolon uçları ilgili tüplerde olur. Her bir kolona 20 mikrolitre sülfat çözeltisi yükleyin ve çözeltinin kolon malzemesinin yüzeyine ulaştığından emin olun.
Sülfatat çözeltisini 50 mikrolitre sodyum asetat tamponu ile kolon malzemesine yıkayın. Sülfatın kolona yıkanması çok önemlidir. Enzimin, kolona bağlı bozulmamış glukozinolatlara reaksiyona girmesi için kolon üzerinde olması gerekir.
Sülfat çözeltisi her bir kolona yıkandıktan sonra, kolonları alüminyum folyo ile kaplayın. Sütunların gece boyunca durmasına izin verin. Daha sonra, her sütundan de-sülfo-glukozinolatları iki adet 0.75 mililitrelik ultra saf su ile ima edin.
Sütunlar kuruduktan sonra, sütun rafını çıkarın ve her bir tüpü kapatın. Tüpleri sıvı nitrojen içinde veya 80 santigrat derecede en az 30 dakika dondurun. Numuneleri 12 ila 24 saat dondurarak kurutun.
Her kalıntıyı 1 mililitre ultra saf suda çözün. Ardından her bir numuneyi ve referansı etiketli HPLC numune şişelerine aktarın. Ekstraktları ters fazlı bir CAT sütununda ayırın.
229 nanometrelik bir algılama dalga boyu kullanın. HPLC ile ayrıldıktan sonra, glukozinolatlar, alıkonma sürelerinin ve UV spektrumlarının bilinen glukozinolat standartlarıyla karşılaştırılmasıyla tanımlanabilir. Numunedeki glukozinolat konsantrasyonları, bir sinogram kalibrasyon eğrisinden ve yanıt faktörleri için literatür değerlerinden hesaplanır.
Bundan, orijinal bitki numunesindeki glukozinolat konsantrasyonları belirlenebilir. Kullanılan HPLC koşulları altında, sağlıksız progoitrin oldukça erken ortaya çıkar ve biyolojik olarak faydalı glukorafaninden ayrılır. Endo-glukozinolatlar da iyi bir şekilde ayrılmıştır.
Liyotropik seriler, alconol, methylfol-alconol ve daha uzun zincirli metil-solfinol-glukozinolatlar için artan yan zincir bağlantıları ile gözlenir. Bu nedenle bilinmeyen glukozinolatlar, UV spektrumları ile kombinasyon halinde bu liyotropik serilere dayalı olarak geçici olarak sınıflandırılabilir. Uygun hazırlık ile, bir iş gününde bir kişi tarafından 150 ila 200 numune çıkarılabilir.
Numuneleri dondurarak kurutmak ve HPLC için hazırlamak için sütunlara atıfta bulunmak bir gün daha alacaktır. Bu prosedürü takiben, kromatogramınızdaki bilinmeyen desülfo-glukozinolatları tanımlamak için LCMS gibi başka yöntemler de uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, biyolojik numunelerinizden glukozinolatları nasıl çıkaracağınızı ve bunları HPLC ile nasıl analiz edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.
Metanol ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve her zaman çeker ocak altında yapılması gerektiğini unutmayın.
Genel Bakış
Bu makale, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi kullanarak bitki materyallerinden glukozinolatların özütlenmesi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Yöntem, basit ve çeşitli biyolojik örneklere uygulanabilir şekilde tasarlanmıştır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Bitki-böcek ekolojisi
- Bitki patolojisi
- Gıda bilimleri
Arka Plan
- Glukozinolatlar bitkilerde önemli bileşiklerdir.
- Bitki savunma mekanizmalarında rol oynarlar.
- Konsantrasyonlarının anlaşılması çeşitli biyolojik çalışmalara yardımcı olabilir.
- Bu protokol geniş bir örnek yelpazesi için valide edilmiştir.
Çalışmanın Amacı
- Glukozinolat ekstraksiyonu ve analizi için güvenilir bir yöntem sağlamak.
- Bitkiyle ilgili alanlardaki araştırmaları kolaylaştırmak.
- Çeşitli örneklerdeki glukozinolatların miktar tayinine olanak sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Dekstrin jel ve sülfataz çözeltisinin hazırlanması.
- Metanol ve sonikasyon kullanılarak örnek ekstraksiyonu.
- Analiz için yüksek performanslı sıvı kromatografisi.
- Alıkonma sürelerinin ve UV spektrumlarının standartlarla karşılaştırılması.
Temel Sonuçlar
- Bitki materyallerinden glukozinolatların başarılı bir şekilde ekstrakte edilmesi.
- Yöntemin çeşitli biyolojik örnekler üzerinden doğrulanması.
- Glukozinolatların HPLC aracılığıyla tanımlanması.
- Ekoloji ve gıda bilimlerindeki potansiyel uygulamalar.
Sonuçlar
- Protokol, glukozinolat analizi için etkilidir.
- Çeşitli araştırma ortamlarında kullanılabilir.
- İleri çalışmalar, bitki bilimlerindeki uygulama alanlarını genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörle İlgili Yönetici Özeti
Glukozinolatların doğru şekilde miktarının belirlenmesi, bitki tabanlı biyoaktif bileşik keşfinde hedef doğrulamasını destekleyerek, nutrasötik ve ürün koruma adaylarının mekanistik risklerinin azaltılmasını sağlar. Bu yöntem, faydalı ve zararlı glukozinolat profillerinin belirlenmesinde öngörücü güven sağlayarak, tarımsal biyoteknoloji ve fonksiyonel gıda geliştirme süreçlerinde öncü bileşiklerin tanımlanmasına ve portföy önceliklendirmesine bilgi sağlar. Bitki dokuları ve biyolojik örnekler genelindeki geniş uygulanabilirliği, keşiften preklinik değerlendirmeye kadar olan translasyonel sürekliliği artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Spesifik glukozinolat yapılarını progoitrin (zararlı) veya glukorafanin (yararlı) gibi biyolojik aktivitelere bağlayarak terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Mirozinaz inaktivasyonu ve sülfataz işlemi sonrası bozulmamış glukozinolatların güvenilir nicelleştirmesi yoluyla biyolojik risk azaltmayı destekler.
- Öngörücü Değer: Yapı-aktivite ilişkisi analizi için nicel veriler üreterek hedef doğrulamadaki öngörü güvenini kolaylaştırır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: HPLC tabanlı tespit ve miktar tayinine uygun desülfoglukozinolatlar sağlayarak, valide edilmiş biyolojik sistemleri sonraki iş akışlarına hazırlar.
- Operasyonel Değer: Sinigrin tabanlı kalibrasyon eğrileri ve belirlenmiş yanıt faktörleri aracılığıyla analiz standardizasyonunu ve tekrarlanabilirliğini sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: Kişi başına günde 150–200 örneğin işlenmesine olanak tanıyarak yüksek kapasiteli tarama hazırlığını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Keşif aşamasındaki glukozinolat profillemesini, bitki patolojisi ve gıda bilimlerindeki hastalıkla ilişkili sistemler aracılığıyla preklinik doğrulamaya bağlar.
- Riske Göre Düzenlenmiş İlerleme: Glukozinolat profillerine dayanarak, zararlı yıkım ürünlerini (örneğin nitriller) faydalı olanlardan (örneğin izotiyosiyanatlar) ayırarak devam/durdur kararlarını destekler.
- Biyobelirteç Uyumu: Ekolojik ve ıslah çalışmalarındaki fenotipik sonuçlarla glukozinolat konsantrasyonlarını ilişkilendirerek translasyonel biyobelirteç geliştirmeye olanak tanır.
Hat ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem; erken hedef doğrulamasından öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik desteğe kadar olan keşif sürecine, özellikle nütrasötik ve ürün özelliği geliştirme süreçlerine entegre edilmektedir.
- Keşif Biyolojisi: Biyoaktif bozunma ürünlerinin oluşumunu belirleyen glukozinolat profillerini nicelendirerek hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturma çalışmalarını destekler.
- Tarama: PDA/UV deteksiyonlu HPLC aracılığıyla analize hazır, kantitatif çıktılar sağlayarak çeşitli bitki matrislerinde güvenilir bileşik değerlendirmesine olanak tanır.
- Analitik: Koşullar arası karşılaştırmaya ve yapı tabanlı sınıflandırmaya izin veren ölçülebilir veriler (alıkonma süreleri, UV spektrumları, konsantrasyon hesaplamaları) sunar.
- Translasyonel Araştırma: Glukozinolat bozunma ürünlerinin biyolojik sonuçları etkilediği gıda güvenliği ve bitki sağlığı uygulamaları aracılığıyla preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Standart laboratuvar ekipmanlarına olan bağımlılığı ve geniş örnek uyumluluğu (bitki, toprak, gıdalar) sayesinde yeniden kullanılabilir bir analitik platform olarak işlev görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef doğrulamada öngörü güvenilirliği, biyoaktif bileşiklerin tanımlanmasında mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: Erişilebilir ekipman kullanan laboratuvarlar arasında standardizasyon, tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik.
- Stratejik Değer: Biyoaktif bileşik geliştirmede iyileştirilmiş devam/durdurma kararları, sermaye verimliliği ve geç evre biyolojik risklerin azaltılması.
- Portföy Etkisi: Doğrulanmış glukozinolat miktar tayinine dayalı, riske göre ayarlanmış önceliklendirme ve ilerleme kararları.
Uygulama Hususları
- Bitki numunesi hazırlama, enzimatik işlem ve HPLC kullanımı konularında uzmanlık gerektirir.
- Santrifüjlere, su banyolarına, ultrasonik banyolara, dondurarak kurutuculara (liyofilizatör) ve PDA/UV dedektörlü HPLC sistemlerine erişime bağlıdır.
- Ekstraksiyon süresi, sülfataz inkübasyonu ve referans eğrisi hazırlama süreçlerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Farklı bitki matrisleri (yaprak, tohum, kök) ve bitki dışı numuneler (toprak, gıdalar) için adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Çeker ocak kullanımını gerektiren metanol kullanım riskleri ve işlem süresini etkileyen 12–24 saatlik dondurarak kurutma adımı gibi pratik sınırlamaları kapsar.
