Otomatik Proteomik İşleme Dijital Mikroakiskan

Klinik proteomik, hastalığın erken tanısı ve prognozu için yararlı olacak biyobelirteçlerin keşfini umut eden önemli yeni bir disiplindir. Burada, protein ekstraksiyonu, yeniden çözündürme azaltma, alkilasyon ve enzimatik sindirim dahil olmak üzere klinik proteomikte kullanılan çeşitli işlem adımlarını entegre eden yeni bir dijital mikroakışkanlar veya DMF yöntemi sunuyoruz. DMF, bir dizi elektrot üzerinde numune proteinlerinin ayrı mikro damlacıklarını kullanır ve oda sıcaklığında çalıştırılabilir, bu da numunelerin paralel otomatik analizine olanak tanır.

Bu metodoloji, geleneksel yöntemlere göre önemli bir ilerlemeyi temsil eder ve klinik proteomikte yararlı yeni bir araç olma potansiyeline sahiptir. Merhaba, ben Toronto Üniversitesi Kimya Bölümü ve Biyomalzemeler ve Biyomedikal Mühendisliği Enstitüsü'nde Laboratuvar Profesörü Erin Wheeler'dan Steve Sche. Merhaba, ben Toronto Üniversitesi'ndeki Wheeler Laboratuvarı'ndan Gabriel.

Ben Vivian Luke, aynı zamanda Toronto Üniversitesi'ndeki Wearer laboratuvarındanım. Adım Erin Wheeler. Steve Mace ve Vivian ile çalıştığım için şanslıyım.

Bugün size dijital mikroakışkanlar kullanarak proteomik işleme için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda proteinleri ve biyolojik örnekleri incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Piranha solüsyonundaki cam alt tabakaları temizleyerek çeker ocaktaki işleme başlayın. Yeterli koruma sağlarken, piranha çözeltisi üç ila bir konsantre sülfürik asit ila% 30 hidrojen peroksitten oluşur. Bu yüzden onunla çalışırken dikkatli olunmalıdır.

Cam alt tabakaları pirana içinde 10 dakika inkübe edin ve temizledikten sonra durulayın ve deiyonize veya su ile kurulayın ve alt tabakaları nitrojen gazı ile kurutun. 250 nanometre kalınlığa kadar krom biriktirmek için substratları elektron ışını buharlaşma odasının içine yerleştirin. Bu kalınlığa ulaşıldığında alt tabakaları hazneden çıkarın ve izopropanol ile durulayın, ardından 115 santigrat derecede beş dakika sıcak bir plaka üzerinde kurutun.

Kurutulmuş substratları heksa, metil, ksilazin veya HMDS ile 30 saniyede sıkma kaplaması ile astarlayın. Shipley S 1811 fotoğrafı ile tekrar 3000 RPM döndürme kodu. Aynı parametreleri kullanarak direnin.

Alt tabakayı doğrudan sıcak bir plaka üzerinde 100 santigrat derecede dakikada önceden pişirin. Ardından, bir fotoğraf maskesi aracılığıyla beş saniye boyunca ultraviyole veya UV ışınlamasına maruz bırakarak fotoğraf direncini modelleyin. Ardından, UV'ye maruz kalan alt tabakaları Shipley MF 3 21 geliştiricisinde geliştirin Alt tabakayı üç dakika sonra suya batıracak kadar.

Alt tabakayı DI su direğinde durulayın. Doğrudan 100 derecede sıcak bir tabakta bir dakika pişirin. Alt tabakaları 30 saniye boyunca tamamen kaplayacak kadar krom aşındırmaya batırarak açıkta kalan kromu aşındırın.

Alt tabakaları DI suyla durulayın ve alt tabakayı 10 dakika daldıracak kadar Z 300 T sıyırıcıya daldırın. Kalan fotorezisti çıkarmak için. DI suda durulayın ve nitrojen gazında kurutun.

Bu çökeltiyi takiben, iki ila beş mikrometre Paraline C.Kimyasal buhar biriktirme yoluyla substrat üzerine bir yalıtkan polimer, yüzeyi bir çözelti ile hidrofobik hale getirmek için 50 nanometre Teflon AF biriktirir. 60 saniye boyunca 2000 RPM'de flora sinir FC 40'ta ağırlık başına %1 ağırlık. Alt tabaka üzerine.

Üst plaka direğini oluşturmak için geçilmemiş indiyum kalay oksit veya ITO cam alt tabaka ile tekrarlayın. Her iki alt tabakayı da 160 santigrat derecede sıcak bir tabakta pişirin. Dijital mikroakışkan cihazı kurmak için 10 dakika.

Bir neşter ile kazıyarak bir alt alt tabakanın temas pedlerinden polimer kaplamaları çıkarın. Alt alt tabakanın açıkta kalan pedlerini, laboratuvar görünümünü çalıştıran bir bilgisayarda güç sağlayan 40 pinli konektörlerle birleştirin. DPAD tarafından kontrol edilen sinyallere sahip röleler içeren ev yapımı bir kontrol kutusu kullanıyoruz.

Bilgisayar kontrol kutusu, 40 pinli konektörler aracılığıyla cihaza 18 kilohertz başına 100 volt RMS sinyalinin uygulanması üzerinde kullanıcı kontrolünü kolaylaştırır. Ayrıca bir fonksiyon üretecini ve amplifikatörü açın. Alt alt tabakanın kenarlarına toplam kalınlığı 140 mikrometre olan iki parça çift taraflı bant yerleştirerek cihazı monte edin.

Rezervuarlardan birine dört mikrolitre DI su pipetleyin ve desensiz indiyum kalay oksit sürgüsünü Teflon kaplı tarafı aşağı bakacak şekilde cihazın üzerine yerleştirerek cihazı kapatın. Üst plaka çalışmasına bir topraklama konektörü takın. Laboratuvar, geri bildirim kontrolünü kalibre etmek için laboratuvar görünümünde başlatma programı oluşturdu, cihaz artık deneyler için hazır.

Bu protokolde, dijital mikroakışkan tasarımımızı ve kullanımımızı göstermek için protein örneği olarak sığır serum albümini veya BSA'yı kullanacağız. BSA, hacim başına %0.08 onik F1 27 ağırlık ile 100 milimolar tris HCL pH 7.8'den yapılmış çalışma tamponu veya WB'de seyreltilir. Her numune ve reaktif çözeltisinden bir mililitre hazırlayın ve ekleneceği rezervuarı belirtin.

Reaktif hazırlığının ardından, üst plakayı cihazdan çıkarın ve dört mikrolitre çözeltiyi kendisine tahsis edilen hazneye pipetleyin. Rezervuarları doldurduktan sonra, üst plakayı cihazın üzerine yerleştirin. Aşağıdaki adımları yürütmek için şirket içi laboratuvar görünümü programını kullanın.

Unutmayın, bilgisayar arayüzü, kullanıcının rezervuarlardan yaklaşık 600 nanolitre damlacık dağıtmasına ve elektrot dizisindeki damlacıkları manipüle etmesine izin verir. İlk olarak, R bir'den numune içeren bir protein damlası ve R iki'den bir damla çökeltici dağıtın. İki damlacığı birleştirin ve birleşik damlacığın beş dakika boyunca inkübe etmesine izin verin, böylece proteinler yüzeye çökelir.

Süpernatanı çökelmiş proteinden atık rezervuarına doğru harekete geçirin. R üç, çökelmiş proteini yıkamak için, R dörtten üç damla yıkama tamponu dağıtın ve bunları çökeltilmiş proteinden geçirip atık haznesine sürün. Çökeltinin kurumasını bekleyin ve R beşten proteinin üzerine bir damla yeniden çözündürücü tampon dağıtın.

Çökelti eriyene kadar tamponun 20 dakika inkübe edilmesine izin verin. Daha sonra, R altıdan bir damla indirgeyici madde dağıtın ve bunu numune damlacığı ile birleştirin. Kombine damlacığı dairesel bir düzende altı elektrot boyunca harekete geçirerek karıştırın.

Damlacığın oda sıcaklığında bir saat inkübe etmesine izin verin. R yediden bir damla alkilleyici madde dağıtın ve bunu numune damlası ile birleştirin, ardından karıştırın. Damlacığın ışıktan korunan oda sıcaklığında 15 dakika inkübe etmesine izin verin.

Son olarak, R sekizden bir damla tripsin dağıtın ve bunu numune damlası ile birleştirin, ardından karıştırın. Damlacığın, sıcak bir plaka üzerindeki bir Petri kabında 37 santigrat derecede üç saat inkübe etmesine izin verin. Reaksiyonu sonlandırmak için üst plakayı çıkarın ve pipetleme yoluyla sindirimi söndürün.

Sudaki altı mililitre% 2.5 trikloroasetik asidi reaksiyon damlacığına doğrultun. Numune damlacığını doğrudan alt plakadan sifonlayarak söndürülmüş reaksiyon ürününü saflaştırın. Üreticinin talimatlarına göre bir C 18 fermuar ucu kullanılarak, numuneler artık gerektiği gibi seyreltilebilir ve bu sistem kullanılarak numunedeki proteinleri tanımlamak için kütle spektrometresi ile değerlendirilebilir.

Bunu takiben kütle spesifik proteinler, %99.9'luk bir güven aralığına ve en az %30'luk dizi kapsamlarına eşdeğer, negatif üçe bir kattan daha az olasılık skorları ile tanımlandı. Bu nedenle, DMF, otomatik proteomik numune işleme için çok kullanışlı bir metodolojidir. Bu yüzden bugün sadece proteinleri otomatik bir şekilde çıkarmak ve işlemek için dijital mikroakışkanları nasıl kullandığımızı gösteriyoruz. Bu metodoloji, protein izolasyonu ve tanımlaması sırasında numune kaybı ve kontaminasyonu için potansiyel bir çözüm sağlar.

Gelecekte bu yöntemi, immünolojik testler ve hücre bazlı testler dahil olmak üzere diğer biyolojik uygulamalara uygulamayı umuyoruz. Bu tür bir deney yaparken, en önemli şey bundan zevk almayı hatırlamaktır. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.