Kimerik Yapılar HSV-aracılı Transgen İfade Farelerde GPCR Heteromers Davranışsal Fonksiyon Eğitim için

Bu yöntemin genel amacı, virüs aracılı gen transferinin, fare modellerinde G-protein kenetli reseptörlerin heterodimerizasyonunu gerektiren davranışsal fenotipleri nasıl etkilediğini gözlemlemektir. Bu yöntem, nöro ve psikofarmakoloji alanındaki temel soruların, özellikle de G-protein kenetli reseptörlerin moleküler düzeyde birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğinin yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu yöntemi kullanarak, bu etkileşimin şizofreni ve depresyon gibi psikiyatrik bozukluk modellerinde davranışı nasıl etkilediğini anlayabiliriz. Bu yöntemi kullanarak, her ikisinin de şizofreni hastalarının tedavisinde kullanılan ilaçların etki mekanizmasında rol oynadığı gösterilen serotonin 2a ve metabotropik glutamat reseptör 2'yi özel olarak inceleyeceğiz. Fareyi onaylanmış yöntemlere göre uygun şekilde anestezi ederek başlayın.

Ayak parmağı sıkıştırma testi yaparak yanıt alınmadığının gözlemlenmesiyle cerrahi anestezi düzeyine ulaşıldığından emin olun. Ardından, gözleri korumak için oftalmik jel uygulayın. Kafatasının düz ve yatay olduğundan emin olacak şekilde başın eğimini ayarlayarak fareyi stereotaktik çerçeveye sabitleyin.

Açığa çıkarılan kafa derisine povidon iyot uygulayın. Bir skalpel kullanarak, tıraşlanmış açık alan içindeki kafatasının orta hattı boyunca sagital bir insizyon yapın. Ardından, kafatasının açık kalmasını sağlamak için insizyon bölgesindeki deriye pureit klemp takın.

Periostu eritmek ve kafatası sütürlerini açığa çıkarmak için hidrojen peroksit uygulayın. Bregma ve sütürler görünür hale geldiğinde, kafatasının düz olduğundan emin olmak için stereotaktik çerçeveyi ayarlayın. Şırıngaların iğne uçlarını bregma ile hizalayın ve bregmanın koordinatlarını kaydedin.

Frontal kortekse bilateral enjeksiyon yapmak için, kaydedilen rostral kaudal bregma koordinatına 1.6 mm ve kaydedilen medial lateral bregma koordinatına 2.6 mm ekleyin. Enjeksiyon bölgelerini kafatası üzerinde işaretleyin ve ardından enjeksiyon bölgelerine küçük delikler açın. Bir pamuklu çubuk yardımıyla, fazla kanı veya kemik fragmanlarını temizleyin.

İğneyi beynin yüzeyine getirin ve dorsal ventral koordinat derinliğine kadar indirin. Ardından, 0,5 µL'lik bir enjeksiyon için, iğnenin pistonunu çevirerek beş dakika boyunca dakikada 0,1 µL olacak şekilde şırınga içeriğini yavaşça enjekte edin. Şırıngayı beş dakika boyunca yerinde bırakın.

Belirlenen süre sonunda hayvanı stereotaksis cihazından çıkarın, insizyonu kapatın ve bir ısıtma pedinin üzerine yerleştirin. Onaylanmış hayvan protokolünüze uygun olarak ameliyat sonrası analjezi uygulayın. Viral partiküllerin stereotaktik enjeksiyonundan iki ila üç gün sonra davranışsal testleri gerçekleştirin.

Fareleri deney başlangıcından önce en az dört saat boyunca odaya alıştırın. İlk olarak DOI'yi yüzde 0,9'luk salin solüsyonu içerisinde kilogram başına iki miligram olacak şekilde çözün. İçinde altlık bulunmayan bir ev kafesi hazırlayın ve bir tripod kullanarak kamerayı doğrudan ev kafesinin üzerine gelecek şekilde ayarlayın.

Tüm ana kafesin görüş alanında olduğundan emin olacak şekilde kamerayı kalibre edin. Fareyi tartın ve uygun dozda 0.9 percent salin veya DOI'yi intraperitonal olarak enjekte edin. Fareyi on dakika boyunca tekrar ana kafesine yerleştirin.

On dakika sonra fareyi boş ev kafesinin merkezine yerleştirin ve kameranın görüş alanında kör nokta kalmadığından emin olun. Kamcorder'da kayıt düğmesine basın ve odadan ayrılın. 30 dakika sonra kaydı durdurun ve fareyi orijinal ev kafesine geri yerleştirin.

Davranış testini bir sonraki fare üzerinde tekrarlayın. Hakemin videoları, deneysel koşullardan habersiz (körleme) bir şekilde incelemesini sağlayın. Video boyunca gerçekleşen her kafa seğirmesini manuel olarak kaydedin.

Baş seğirmesi, bir fare tarafından gerçekleştirilen hızlı bir baş sallama hareketi olarak tanımlanır. Verileri, protokolün yazılı kısmında belirtildiği şekilde işleyin. Burada, frontal kortekste HSV aracılı transgen ekspresyonuna ait temsili bir görüntü gösterilmektedir.

Frontal kortekse HSV mGlu2 GFP enjekte edildi ve GFP ekspresyonu immünositokimya ile ortaya çıkarıldı. Bu ölçek çubuğu 200 mikronu temsil etmektedir. Bu görüntü, mGlu2 nakavt farelerin frontal korteksindeki HSV aracılı transgen ekspresyonunun ve anti-mGlu2 reaktivitesinin western blot analizini göstermektedir.

Burada, bir monomer olarak mGlu2'nin immünoreaktivitesini ölçtük. Bu histogram, mGlu2 knockout farelerin frontal korteksinde viral aracılı mGlu2 ekspresyonunun, kimerik mGlu2 ekspresyonunun aksine, halüsinojenik serotonin 2a reseptör agonisti DOI tarafından indüklenen baş seğirme yanıtını anlamlı düzeyde geri döndürdüğünü göstermektedir. Bu deneydeki en kritik adımlar; viral enjeksiyonlar, baş seğirme yanıtı ve farelerin sakrifiye edilme zamanı arasındaki zamanlamadır.

Herhangi bir gecikme, deneyin sonuçlarını değiştirebilir veya verilere belirsizlik getirebilir. Fare cerrahisiye hakim olunduğunda, virüs enjeksiyonu yaklaşık 30 dakika sürecektir. Baş seğirmesi deneyi de fare başına yaklaşık 35 dakika sürmelidir.

Ameliyatların kademeli olarak yapılması veya aynı anda birden fazla farenin ameliyat edilmesi önerilir. Bu sayede, viral konstrüktün en yüksek ekspresyon zamanı olan ameliyat sonrası üç ila dört gün içinde kafa seğirmesi deneylerinin gerçekleştirilmesine olanak tanıyan bir zaman çizelgesi sürdürülebilir. İzlediğiniz için teşekkürler, deneyinizde başarılar dileriz.