Kimerik Yapılar HSV-aracılı Transgen İfade Farelerde GPCR Heteromers Davranışsal Fonksiyon Eğitim için
July 9th, 2016
Bu makalede, GPCR heteromerik oluşumunu gerektiren davranış testleri test etmek için fare frontal korteks içine viral vektörlerin enjekte açıklamaktadır.
Bu yöntemin genel amacı, virüs aracılı gen transferinin, fare modellerinde G-proteinine bağlı reseptörlerin heterodimerizasyonunu gerektiren davranışsal fenotipleri nasıl etkilediğini gözlemlemektir. Bu yöntem, nöro ve psiko farmakoloji alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Spesifik olarak, g proteinine bağlı reseptörlerin moleküler düzeyde birbirleriyle nasıl etkileşime girdiği.
Bu yöntemi kullanarak, bu etkileşimin şizofreni ve depresyon gibi psikiyatrik bozukluk modellerinde davranışı nasıl etkilediğini anlayabiliriz. Bu yöntemi kullanarak, her ikisinin de şizofreni hastalarını tedavi etmek için kullanılan ilaçların etki mekanizmasında rol oynadığı gösterilen seratonin 2a ve metabotropik glutamat reseptörü 2'ye özel olarak bakacağız. Fareyi onaylanmış yöntemlere göre uygun şekilde uyuşturarak başlayın.
Bir ayak parmağı çimdikleme yaparak ve bir yanıt olmadığını not ederek cerrahi bir anestezi düzleminin elde edildiğinden emin olun. Ardından gözleri korumak için oftalmik jel uygulayın. Fareyi stereotaktik çerçeveye takın ve kafatasının eğimini kafatası düz ve düz olacak şekilde ayarladığınızdan emin olun.
Açıkta kalan kafa derisine povidon iyot uygulayın. Bir neşter kullanarak, açıkta kalan traşlı alan içinde kafatasının orta hattı boyunca sagital bir kesi yapın. Ardından, kafatasının açıkta kaldığından emin olmak için kesi bölgesindeki cilde pureit kelepçeleri takın.
Periosteumu çözmek için hidrojen peroksit uygulayın ve kafatasının dikişlerini ortaya çıkarın. Artık bregma ve dikişler göründüğüne göre, kafatasının düz olduğundan emin olmak için stereotaktik çerçeveyi ayarladığınızdan emin olun. Şırıngaların iğne uçlarını bregma ile hizalayın ve bregma koordinatlarını kaydedin.
Frontal korteksi bilateral olarak enjekte etmek için, kaydedilen rostral kaudal bregma koordinatına 1.6 mm ve kaydedilen medial lateral bregma koordinatına 2.6 mm ekleyin. Kafatasındaki enjeksiyon bölgelerini işaretleyin ve ardından enjeksiyon bölgelerinde küçük delikler açın. Pamuk uçlu bir aplikatör ile fazla kan veya kemik parçalarını silin.
İğneyi beynin yüzeyine getirin ve dorsal ventral koordinatın derinliğine kadar indirin. Daha sonra, 0,5 mikrolitrelik bir enjeksiyon için beş dakika boyunca dakikada 0,1 mikrolitre uygulamak için iğnenin pistonunu çevirerek şırınganın içeriğini yavaşça enjekte edin. Şırınganın beş dakika boyunca yerinde kalmasına izin verin.
Ayrılan süreden sonra, hayvanı stereotaksiden çıkarın, kesiği kapatın ve bir ısıtma pedi üzerine yerleştirin. Ameliyat sonrası analjeziyi onaylanmış hayvan protokolünüze göre uygulayın. Viral partiküllerin stereotaktik enjeksiyonundan iki ila üç gün sonra davranışsal test yapın.
Deneyin başlamasından en az dört saat önce fareleri odaya alıştırın. DOI'yi kilogram başına iki miligrama kadar yüzde 0.9'luk bir tuzlu su çözeltisine çözerek başlayın. Herhangi bir yatak takımı olmadan bir ev kafesi hazırlayın ve bir tripod kullanarak bir kamerayı doğrudan ev kafesinin üzerinde olacak şekilde ayarlayın.
Kamerayı, tüm ev kafesi görüş alanında olacak şekilde kalibre edin. Fareyi tartın ve uygun dozda yüzde 0.9 salin veya DOI ile intraperitoneal olarak enjekte edin. Fareyi on dakika boyunca ev kafesine geri koyun.
On dakika sonra, fareyi boş ev kafesinin ortasına yerleştirin ve kameranın görüş alanında kör nokta olmadığından emin olun. Video kamerada kayıt düğmesine basın ve odadan çıkın. 30 dakika sonra kaydı durdurun ve fareyi orijinal ev kafesine geri yerleştirin.
Davranış testini bir sonraki farede tekrarlayın. Hakemin videoları deney koşullarına kör olarak incelemesini sağlayın. Video boyunca her kafa seğirmesini manuel olarak kaydedin.
Kafa seğirmesi, bir fare tarafından gerçekleştirilen hızlı bir baş sallama hareketi olarak tanımlanır. Verileri protokolün yazılı bölümünde belirtildiği şekilde işleyin. Burada, frontal kortekste HSV aracılı transgen ekspresyonunun temsili bir görüntüsü gösterilmektedir.
HSV mGlu2 GFP frontal kortekse enjekte edildi ve immünositokimya ile GFP ekspresyonu ortaya çıkarıldı. Bu ölçek çubuğu 200 mikronu temsil eder. Bu görüntü, mGlu2 nakavt farelerinin frontal korteksinde HSV aracılı transgen ekspresyonu ve anti-mGlu2 reaktivitesinin batı lekesini göstermektedir.
Burada mGlu2'nin bir monomer olarak immünoreaktivitesini ölçtük. Bu histogram, mGlu2'nin viral aracılı ekspresyonunun, ancak mGlu2 nakavt farelerinin frontal korteksindeki kimerik mGlu2'nin değil, halüsinojenik seratonin 2a reseptör agonisti DOI tarafından indüklenen kafa seğirmesi tepkisini önemli ölçüde kurtardığını göstermektedir. Bu deneyle ilgili en kritik adımlar, viral enjeksiyonlar arasındaki zamanlama, kafa seğirme tepkisi ve farelerin ne zaman feda edildiğidir.
Herhangi bir gecikme, deneyin sonuçlarını değiştirebilir veya verilerde belirsizliğe neden olabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, fare ameliyatının virüsü enjekte etmesi yaklaşık 30 dakika sürecektir. Kafa seğirmesi deneyi de fare başına yaklaşık 35 dakika sürmelidir.
Şaşırtıcı ameliyatlar veya aynı anda birden fazla farede ameliyat edilmesi önerilir. Bu şekilde, viral yapının en yüksek ekspresyon zamanı olan ameliyattan sonraki üç ila dört gün içinde kafa seğirmesi deneylerinin yapılmasına izin veren bir zaman çizelgesi korunabilir. İzlediğiniz için teşekkürler ve denemenizde iyi şanslar.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, GPCR heteromeri oluşumu ile ilgili davranışsal değerlendirmeleri incelemek için fare frontal korteksine viral vektörler enjekte etme yöntemi açıklamaktadır. Yaklaşım, G-protein ile eşleşen reseptörlerin moleküler etkileşimlerini ve bunların psikiyatrik modellerdeki davranış üzerindeki etkisini açıklamayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Farmakoloji
- Davranış Bilimleri
Arka Plan
- G-protein ile eşleşen reseptörler (GPCR'ler) sinyal iletiminde önemli bir rol oynamaktadır.
- GPCR etkileşimlerini anlamak, psikiyatrik bozukluklar hakkında fikir verebilir.
- GPCR'lerin heterodimerizasyonu davranışsal sonuçları etkileyebilir.
- Bu yöntem, fare modellerinde gen transferi için viral vektörler kullanır.
Çalışmanın Amacı
- Virüs aracılı gen transferinin davranışsal fenotipler üzerindeki etkilerini araştırmak.
- Serotonin 2A ve metabotrop glutamat reseptörü 2 arasındaki etkileşimi keşfetmek.
- Nöro ve psiko farmakolojideki soruları ele almak.
Kullanılan Yöntemler
- Onaylanmış yöntemlere göre farelerin uygun şekilde anestezi yapılması.
- Viral vektörlerin frontal kortekse enjekte edilmesi.
- GPCR etkileşimlerinin etkisini değerlendirmek için davranışsal değerlendirmeler.
- Psikiyatrik bozukluklarla ilgili davranışsal fenotiplerin analizi.
Ana Sonuçlar
- GPCR heteromeri oluşumu ve bunun davranışsal etkileri hakkında fikirler.
- Serotonin 2A ve metabotrop glutamat reseptörü 2'nin rolünü anlamak.
- GPCR etkileşimleri ve psikiyatrik durumlar arasındaki olası bağlantılar.
- Deneysel bulgularla nörofarmakoloji alanına katkı.
Sonuçlar
- Bu yöntem, in vivo GPCR etkileşimlerini incelemek için bir çerçeve sağlamaktadır.
- Bulgular, psikiyatrik bozukluklar için terapötik stratejiler hakkında bilgi sağlayabilir.
- Bu etkileşimlerin etkilerini keşfetmek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Dissecting the behavioral function of GPCR heteromers using HSV-mediated transgene expression in mice addresses a critical challenge in neuropsychiatric drug discovery: establishing mechanistic links between receptor complexes and disease-relevant phenotypes. This approach enables predictive confidence in target validation for psychiatric disorders by isolating the functional necessity of specific receptor interactions. The method supports risk-adjusted portfolio decisions at the interface of early discovery and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of GPCR heteromer function in vivo for mechanistic de-risking.
- Clarifies the necessity of specific receptor complexes for disease-relevant behavioral phenotypes.
- Supports predictive confidence in target selection for neuropsychiatric indications.
Screening & Assay Development
- Establishes validated behavioral assays linked to molecular interventions for downstream screening.
- Provides quantitative behavioral outputs (head-twitch response) for assay standardization.
- Facilitates reproducible evaluation of genetic and pharmacological manipulations in vivo.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical behavioral models with human disease mechanisms via receptor complex interrogation.
- Enables continuity from molecular discovery to behavioral validation in animal models.
- Supports translational biomarker development by linking molecular interventions to quantifiable phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical validation by enabling hypothesis-driven testing of receptor complex function in disease-relevant behavioral systems.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing for GPCR heteromer involvement in psychiatric phenotypes.
- Screening: Provides a platform for quantitative behavioral readouts following genetic or pharmacological perturbation.
- Analytics: Delivers measurable endpoints (head-twitch counts) for statistical comparison across experimental groups.
- Translational Research: Connects molecular interventions to behavioral outcomes relevant to psychiatric disorders.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for interrogating other receptor complexes in vivo.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity for neuropsychiatric drug programs.
- Operational Value: Standardizes behavioral phenotyping linked to molecular interventions for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying the necessity of receptor complexes for disease-relevant behaviors.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and mechanisms for advancement in CNS pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery and behavioral phenotyping in rodents.
- Demands access to viral vector production and molecular validation infrastructure (immunocytochemistry, western blotting).
- Necessitates rigorous cross-team standardization of injection timing, behavioral testing, and data analysis.
- Adaptation to other receptor complexes or behavioral assays may require protocol optimization.
- Precise timing between viral delivery, behavioral assessment, and tissue collection is critical for data integrity.
