Name: Kimerik Yapılar HSV-aracılı Transgen İfade Farelerde GPCR Heteromers Davranışsal Fonksiyon Eğitim için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Öğrenin fare modellerinde GPCR heteromerizasyonunun davranışsal etkilerini HSV-aracılı gen transferi ile incelemeyi. Bu yöntem, 5-HT2A-mGlu2 reseptör kompleksinin halüsinojen yanıtlarındaki rolünü anlamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

NIH R01MH084894 Bu çalışmanın finansmanı katıldı. Biz Dr teşekkür etmek istiyorum. farelerin bağış ve bu çalışmanın çekimleri sırasında cerrahi ve davranış tesislerin kullanımı için Mount Sinai Tıp Okulu Yasmin Hurd ve Scott Russo.

NOT: Hayvan ıslahı ve bakımları için tüm prosedürler Sina Dağı&#39;nda Tıp Icahn Okulu Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) yönetmeliğine göre yapılmıştır. prosedür boyunca steril eldiven kullandığınızdan emin olun. 1. İlaç ve Virüs Hazırlık <ol><li> İlaç Hazırlama <ol><li> 12.9 ml% 0.9 tuzlu su çözeltisi içinde 100 mg / ml Ketamin 1.35 ml ve 20 mg / ml ksilazin 0.75 ml eritilmesi ile 15.0 mi, ketamin / ksilazin anestezik hazırlayın. Iyice çözüm karıştırmak. </li></ol></li><li> Virüs hazırlanması <ol><li> MGlu2 Clone ve mGlu2ΔTM4N standart protokoller daha önce 6 açıklanan aşağıdaki bir bicistronic herpes simpleks virüsü (HSV) vektörü içine oluşturur. Daha önce tarif edildiği gibi 6,13,14 viral partikülleri paketleyin. Kalıntıların Değişiklik Ala-677 4.40, mGlu2 Ala-681 4.44 ve Ala685 4.48 Ser686 4.40, Ph içinE690 4.44 ve Gly-694 4.48 mGlu3 (HA-mGlu2ΔTM4N) &#39;de daha önce 6 tarif edilmiştir. Not: Bu, daha önce kimerik yapısı, HA-mGlu2ΔTM4N sağlam G-protein-bağlı 6 Sinyal plazma membranında eksprese edildiği gösterilmiştir. </li><li> viral vektörlerin saklayın -80 ° C kullanılmadığı zaman. Daha sonra çözülme viral buz üzerinde vektör ve 10 ul kısma bölmeyin. cerrahi işlem için, buz üzerinde tutmak. </li></ol></li></ol> 2. Cerrahi <ol><li> cerrahi Hazırlık <ol><li> (1.1.1 ayrıntılar için bkz) fare tartılır ve ketamin / ksilizin kokteyl uygun dozda ile fare enjekte. </li><li> Düzgün anestezi olmadığını görmek bir tepki ortaya çıkarmak için yapamaz fare düzgün anestezi ise, ağrı yanıt ayak ve kuyruk sıkmak için fareyi kontrol edin. </li><li> makası kullanarak burun ucu kafatası tabanından fare kafasını tıraş. Fare af oftalmik jel uygulayınfare körlüğü önlemek için terward. </li><li> stereotaksik çerçeve üzerine her şırınga yükleyin. onlar 10 derece uzakta normal böylece daha sonra stereotaksik çerçeve her kolun dik kısmını yatırın. iğneler birbirine bakacak şekilde, kollar eğik olduğundan emin olun. </li><li> % 70 etanol ile iğne doldurarak her bir şırınga temizleyin. Şırınga temiz olduğundan emin olmak için iğne en az üç kez doldurun. </li><li> İğne temizlendikten sonra, çift distile H2O ile iğne doldurarak iğne floş Bir kez kızardı, çift distile H2O 1.3 ul her iğne doldurun Çift distile H2O 0.3 ul serbest bırakmak için şırınga pistonu Büküm İğnenin ucunda su boncuklar, dikkatlice su uzakta silin. hiçbir şey şırınga çıkarsa, aşağı tamamen pistonu itin ve şırınga temizlik tekrarlayın. </li><li> Su ile doldurduktan sonra, daha sonra şırınga ile dolum şırınga yukarı çekinHavanın 0.5 ul. </li><li> Hava ve su şırınga kez, dikkatle virüs çözümü 1.3 ul şırınga doldurun. Bu noktada şırınga toplam hacim 2.8 ul olduğundan emin olun. Yine virüsün 0.3 ul serbest bırakmak için şırınga ucu bükün. İğnenin ucundaki sıvı boncuklar, dikkatle sıvıyı uzak silin. hiçbir şey şırınga çıkarsa, aşağı tamamen pistonu itin ve şırınga temizlik tekrarlayın. </li></ol></li><li> cerrahlık <ol><li> Kafatası seviyesi ve düz olacak şekilde stereotaksik çerçeve ayarlamak için emin olun, stereotaksik çerçeve için fareyi takın. maruz kafa derisi povodine-iyot uygulayın. Bir neşter kullanılarak, maruz traş alanı içinde kafatası orta hat boyunca sagittal bir kesi yapmak. Sonra kafatası maruz kalır emin olmak için kesi yerinde cilde büret kelepçeleri takın. </li><li> Ve dikişler maruz periost uzak çözmek için H 2 O 2 kullanınkafatası. Şimdi Bregma ve dikişler görünür olduğundan, kafatası seviyesi olduğundan emin olmak için stereotaksik çerçeve ayarlamak için emin olun. </li><li> bregma ile şırınga iğne uçları hizalayın ve bregma koordinatlarını kaydetmek. iğneler takılı olacak koordinatlarını hesaplamak. <ol><li> Rostral-Cauldal (RC) düzlem için, kaydedilen RC Bregma koordinatları (bregmadan 1,6) 1.6 mm ekleyin. Dorsal-ventral (DV) düzlem için, kaydedilen DV Bregma koordinatları (bregmadan -2.4) 2.4 mm çıkarın. </li><li> Son olarak, Medial Lateral (ML) düzlem için, kaydedilen ML Bregma koordinatları (bregmadan 2,6) 2.6 mm ekleyin. Bu ikili bir enjeksiyon olduğu gibi tüm koordinatlar için, hem sol ve sağ koordinatlarını kaydetmek için emin olun. </li></ol></li><li> İstenilen koordinatlarına iğne getir. iğneler sokulur ve bir matkap ile işaretlenmiş alanların matkap olacak nereye yerleri işaretleyin. </li><li> Bir pamuk uçlu aplikatör wi ileherhangi bir aşırı kan ya da kemik parçasını uzağa pe. </li><li> iğne uçları beynin yüzeyine dokunmadan kafatasına iğneler getirin. Sonra yavaş yavaş onları düşürücü istenilen koordinatlara iğneler indirin. </li><li> iğne istenen koordinatlara olduğunda, yavaş (toplam 0.5 ul) 5 dakika boyunca dakikada iğne 0.1 ul pistonu bükerek enjekte edilir. </li><li> Enjeksiyon yapıldıktan sonra başka bir 5 dakika kortekste şırınga bırakın. </li></ol></li><li> Up / kapama Bakımı <ol><li> sürekli ve yavaş yavaş fare korteks iğne çıkarın. Sonra stereotaksik çerçeve fare kaldırmak. </li><li> forseps cilt flep kapmak ve birlikte koyun ile daha sonra kesi deri taban kanatlarına siyanoakrilat (dermal yapıştırıcı) uygulayın ve. </li><li> siyanoakrilat kurumasını bekleyin. ısıtma yastığı Surg eğer isteğe bağlıdır (bir ısıtma yastığı üzerinde kafes içinde fare yerleştirinnik paketi 37 ° C oda sıcaklığında altında tutulur - Aksi gerekli değildir). yatak cerrahi bölgeye bağlı olmadığından emin olmak için bir kağıt havlu üzerine fare koyun emin olun. </li><li> İşlemden sonra 60 dakika - cerrahi işlemin süresine bağlı olarak, fareler 30 içinde anestezi dışında olduğundan emin olun. Ameliyatı takiben, hayvan kendi kafes yerleştirilir ve kurtarmak için kendi odasına dönmeden önce bilinçli hale gelene kadar izlenir. Onlar beyin biyokimyasal yollar bazı değiştirerek bizim deneylerin sonuçlarını değiştirebilir çünkü hiçbir analjezikler, postoperatif kullanılmaktadır. Ancak ameliyat günü anestezi kurtarmak kadar, hayvanlar izlenir, ve enfeksiyon ve ağrı / sıkıntı değerlendirilmesi belirtileri günlük operasyon sonrası. </li></ol></li></ol> 3. Kafa Seğirme Tepki Deneyi <ol><li> Kurmak <ol><li> 3 gün stereota sonra - 2 10:00 ve 02:00 PM arasındaki tüm davranış testleri yürütmekViral parçacıklar CTIC enjeksiyonu. </li><li> Çözündürün (±) -1- (2,5-dimetoksi-4-iyodofenil) 2.0 mg / kg bir% 0.9 salin çözeltisi -2-aminopropan hidroklorür (DOI). Ayrıca% 0.9 tuzlu su çözeltisi hazırlayın. </li><li> Herhangi bir yatak olmadan bir ev kafes (28 x 18 x 15 cm) hazırlayın ve video kamera görüntüle doğrudan ana kafes üstünde olacak şekilde bir tri-bölmesini kullanarak, bir kamera ayarlayın. </li><li> Deneyin başlamasından önce en azından 4 saat oda fareler alıştırarak. </li><li> Baş seğirme kaydetmek için kamera ayarlayın. </li></ol></li><li> deneme <ol><li> Bir evde kafes üzerinden doğrudan böylece kamerayı yerleştirin. Tüm ana kafes görüş alanında olacak şekilde kamera kalibre edin. </li><li> fare tartılır ve% 0.9 tuzlu su ya da DOI ya uygun dozu (0.01 ml / g) ile periton içine fare enjekte edilir. Not: Fare 25 gram ağırlığında durumunda, 0.25 ml lik bir toplam hacime dozunun uygulanması. </li><li> fo evlerine kafes geri her fare yerleştirinR 10 dk. Boş ev kafesin merkezine 10 dakika, yer fare sonra kameranın görüş alanında kör noktalar vardır olduğunu doğrulamak. Kamerada basın kaydı. odayı terk. NOT: Fare hareketleri ve orada çeşitli davranışsal tepkileri (... Kafa seğirme, kulak çizik vb DOI tarafından uyarılan davranışsal tepkilerin tam listesi için Gonzalez-Maeso ark 2007 ek veri tablosunun 1&#39;e bakınız) 3, kaydedilmiş olacak 30 dk. Nedenle, kaydedilen görüş alanında kör noktalar vardır önemlidir. </li><li> 30 dakika orijinal ev kafesine geri kamera ve yer fare kayıt durdurduktan sonra. Her fare için bu işlemi tekrarlayın. </li></ol></li><li> gözden geçirmek <ol><li> Bantlar fare deneysel koşullara kör her hakem inceleme var) (yani., Baş sırasında kullanılan ilaçlar deney veya intrakranial enjeksiyon sırasında kullanılan virüs seğirme). El ile her kafa Throug seğirme kayıthout videosu. NOT: Baş-seğirme bir fare (ek videosu) tarafından yapılan hızlı sarsıntı baş hareketi olarak tanımlanır. </li><li> Her fare için, kör hakemlerin üç toplamları nihai HTR yanıtını ortalama. Daha sonra grup, bu deneysel koşulu ile değerler ve istatistiksel analiz (yani., T-testi veya ANOVA) yürütmek. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Fribourg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+Signaling+of+a+GPCR+Heteromeric+Complex+Reveals+a+Unifying+Mechanism+of+Action+of+Antipsychotic+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Decoding the Signaling of a GPCR Heteromeric Complex Reveals a Unifying Mechanism of Action of Antipsychotic Drugs.</a> Cell. 147 (5), 1011-1023 (2011).</li>
<li>Gonzalez-Maeso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+serotonin%2Fglutamate+receptor+complex+implicated+in+psychosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of a serotonin/glutamate receptor complex implicated in psychosis.</a> Nature. 452 (7183), 93-97 (2008).</li>
<li>Gonzalez-Maeso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallucinogens+Recruit+Specific+Cortical+5-HT%282A%29+Receptor-Mediated+Signaling+Pathways+to+Affect+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hallucinogens Recruit Specific Cortical 5-HT(2A) Receptor-Mediated Signaling Pathways to Affect Behavior.</a> Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).</li>
<li>Gonzalez-Maeso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+fingerprints+distinguish+hallucinogenic+and+nonhallucinogenic+5-hydroxytryptamine+2A+receptor+agonist+effects+in+mouse+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcriptome fingerprints distinguish hallucinogenic and nonhallucinogenic 5-hydroxytryptamine 2A receptor agonist effects in mouse somatosensory cortex.</a> J Neurosci. 23 (26), 8836-8843 (2003).</li>
<li>Moreno, J. L., Holloway, T., Albizu, L., Sealfon, S. C., Gonzalez-Maeso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+glutamate+mGlu2+receptor+is+necessary+for+the+pharmacological+and+behavioral+effects+induced+by+hallucinogenic+5-HT2A+receptor+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Metabotropic glutamate mGlu2 receptor is necessary for the pharmacological and behavioral effects induced by hallucinogenic 5-HT2A receptor agonists.</a> Neurosci Lett. 493 (3), 76-79 (2011).</li>
<li>Moreno, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Three+Residues+Essential+for+5-HT2A-mGlu2+Receptor+Heteromerization+and+its+Psychoactive+Behavioral+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of Three Residues Essential for 5-HT2A-mGlu2 Receptor Heteromerization and its Psychoactive Behavioral Function.</a> J Biol Chem. 287, 44301-44319 (2012).</li>
<li>Geyer, M. A., Vollenweider, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+research%3A+contributions+to+understanding+psychoses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Serotonin research: contributions to understanding psychoses.</a> Trends Pharmacol Sci. 29 (9), 445-453 (2008).</li>
<li>Nichols, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallucinogens%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Hallucinogens.</a> Pharmacol Ther. 101 (2), 131-181 (2004).</li>
<li>Hanks, J. B., Gonzalez-Maeso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+serotonergic+psychedelics%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Animal models of serotonergic psychedelics.</a> ACS Chem Neurosci. 4 (1), 33-42 (2013).</li>
<li>Fiorella, D., Rabin, R. A., Winter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+5-HT2A+and+5-HT2C+receptors+in+the+stimulus+effects+of+hallucinogenic+drugs.+II%3A+Reassessment+of+LSD+false+positives%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Role of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in the stimulus effects of hallucinogenic drugs. II: Reassessment of LSD false positives.</a> Psychopharmacology (Berl). 121 (3), 357-363 (1995).</li>
<li>Vollenweider, F. X., Vollenweider-Scherpenhuyzen, M. F., Babler, A., Vogel, H., Hell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psilocybin+induces+schizophrenia-like+psychosis+in+humans+via+a+serotonin-2+agonist+action%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Psilocybin induces schizophrenia-like psychosis in humans via a serotonin-2 agonist action.</a> Neuroreport. 9 (17), 3897-3902 (1998).</li>
<li>Moreno, J. L., Sealfon, S. C., Gonzalez-Maeso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+II+metabotropic+glutamate+receptors+and+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Group II metabotropic glutamate receptors and schizophrenia.</a> Cell Mol Life Sci. 66 (23), 3777-3785 (2009).</li>
<li>Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC2+regulates+atypical+antipsychotic+responses+through+the+modulation+of+mGlu2+promoter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">HDAC2 regulates atypical antipsychotic responses through the modulation of mGlu2 promoter activity.</a> Nat Neurosci. 15 (9), 1245-1254 (2012).</li>
<li>Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repressive+Epigenetic+Changes+at+the+mGlu2+Promoter+in+Frontal+Cortex+of+5-HT2A+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Repressive Epigenetic Changes at the mGlu2 Promoter in Frontal Cortex of 5-HT2A Knockout Mice.</a> Mol Pharmacol. 83 (6), 1166-1175 (2013).</li>
<li>Rives, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+GABAB+and+mGlu1a+receptors+reveals+new+insight+into+GPCR+signal+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between GABAB and mGlu1a receptors reveals new insight into GPCR signal integration.</a> Embo J. 28 (15), 2195-2208 (2009).</li>
<li>Milligan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Prevalence%2C+Maintenance+and+Relevance+of+GPCR+Oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The Prevalence, Maintenance and Relevance of GPCR Oligomerization.</a> Mol Pharmacol. (84), Epub ahead of print 158-169 (2013).</li>
<li>Ferre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+oligomerization+revisited%3A+functional+and+pharmacological+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives.</a> Pharmacol Rev. 66 (2), 413-434 (2014).</li>
<li>Gonzalez-Maeso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPCR+oligomers+in+pharmacology+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">GPCR oligomers in pharmacology and signaling.</a> Mol Brain. 4 (1), 20(2011).</li>
<li>Gonzalez-Maeso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Family+a+GPCR+heteromers+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Family a GPCR heteromers in animal models.</a> Front Pharmacol. 5, 226(2014).</li>
<li>Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+resonance+energy+transfer+%28BRET%29+imaging+of+protein-protein+interactions+within+deep+tissues+of+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 12060-12065 (2011).</li>
<li>Calebiro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+fluorescently+labeled+G-protein-coupled+receptors+reveals+complexes+with+distinct+dynamics+and+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (2), 743-748 (2013).</li>
<li>Fonseca, J. M., Lambert, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+of+a+class+a+G+protein-coupled+receptor+oligomer+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Instability of a class a G protein-coupled receptor oligomer interface.</a> Mol Pharmacol. 75 (6), 1296-1299 (2009).</li>
<li>Hern, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+dissociation+of+M1+muscarinic+receptor+dimers+seen+by+total+internal+reflection+fluorescence+imaging+of+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Formation and dissociation of M1 muscarinic receptor dimers seen by total internal reflection fluorescence imaging of single molecules.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2693-2698 (2010).</li>
<li>Hlavackova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+inter-+and+intrasubunit+rearrangements+during+activation+of+dimeric+metabotropic+glutamate+receptor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Sequential inter- and intrasubunit rearrangements during activation of dimeric metabotropic glutamate receptor 1.</a> Sci Signal. 5 (237), 59(2012).</li>
<li>Irannejad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+biosensors+reveal+GPCR+signalling+from+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformational biosensors reveal GPCR signalling from endosomes.</a> Nature. 495 (7442), 534-538 (2013).</li>
<li>Calebiro, D., Nikolaev, V. O., Persani, L., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+by+internalized+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Signaling by internalized G-protein-coupled receptors.</a> Trends Pharmacol Sci. 31 (5), 221-228 (2010).</li>
<li>Celada, P., Puig, M. V., Diaz-Mataix, L., Artigas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hallucinogen+DOI+reduces+low-frequency+oscillations+in+rat+prefrontal+cortex%3A+reversal+by+antipsychotic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The hallucinogen DOI reduces low-frequency oscillations in rat prefrontal cortex: reversal by antipsychotic drugs.</a> Biol Psychiatry. 64 (5), 392-400 (2008).</li>
<li>Béïque, J. -C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+5-hydroxytryptamine+2A+receptor-mediated+facilitation+of+synaptic+activity+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (23), 9870-9875 (2007).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Birlikte mGlu2-KO farelerde 5 mi olacak biçimde kültürlenmiş hücrelerde 5-HT2A -mGlu2 reseptör kompleksini oluşturmayan mGlu2 ve mGlu2 / mGlu3 kimerik yapıları ile sonuçlar, 5-HT2A -mGlu2 in heteromerik reseptör kompleksi fare frontal korteks LSD benzeri halüsinojenik 5-HT2A reseptörü agonistleri tarafından baş seğirme davranışını uyarmak için gereklidir. Bu yöntemin bir sınırlaması yerli dokuda hücre içi düzeyde yakın moleküler yakınlığı ölçmek olmamasıdır. Buna ek olarak, di...

LSD, psilosibin ve meskalin olarak halüsinojenler, insan bilinci, biliş ve duygu 7-9 önemli değişikliklere neden olmaktadır. Genetik ya da farmakolojik ya yaklaşımlarla serotonin 5-HT2A reseptörü sinyallemesinin inaktivasyonu belirgin iki kemirgen modellerinde 3,10 bölgesindeki halüsinojenler davranışsal tepkileri zayıflatılmış ve 11 insanlarda neden olur. Halüsinojenler, diğer reseptör alt-tipleri 8 bağlanan, ancak 5-HT2A reseptörü, bu kimyasal maddelerin benzersiz davranış aktivite için gerekli olarak kabul edilir. Grup II metabotropik glutamat reseptörleri (yani., MGlu2 ve mGlu3) halusinojenler moleküler mekanizması ve psikoz 12 altında yatan onların ayrılmaz rolüne ilişkin önemli ilgi hedef olmuştur. Daha önce, mGlu2 protein (mGlu2-KO fareleri) herhangi bir ifade ile farenin hal hücresel ve davranışsal etkilere karşı duyarsız olduğu gösterilmiştirlucinogens 5. Ayrıca, 5-HT2A ve mGlu2 reseptörleri serotonin ve glutamat ligandlan, canlı hücreler 1,2 G protein bağlama modelini modüle geçtiği belirli bir heteromerik kompleks oluşturduğunu ileri sürülmüştür. Yapısal olarak, zar-ötesi (TM) etki 4 ve mGlu2 5 5-HT2A reseptörü 5, heteromerik oluşumunda önemli bir rol oynamaktadır. Buna ek olarak, daha fazla araştırma mGlu2 bölgesinin TM4 hücre içi ucunda yer alan, üç kalıntıları hücreler 6 canlı 5-HT2A reseptörü -mGlu2 heterokompleks oluşturmak için gerekli olduğunu göstermiştir. Heterolog ifade sistemlerinde görülen Bu bulgulara dayanarak, burada test etmek için, vahşi tip mGlu2 ve mGlu2-KO farelerde frontal kortekste mGlu2 / mGlu3 Şimerik yapıların HSV-aracılı ifade kullanımını tarif 5-HT2A ile heteromerik oluşumu ve mGlu2 için gerekli olanhalüsinojenik 5-HT2A reseptörü agonistleri tarafından neden kafa seğirme davranışı.

<table><tbody><tr><td>mGlu2 bicitronic herpes simpleks virüsü (HSV) vektörü&nbsp;</td><td>MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 ve mGlu2DTM4N, CMV promotörün kontrolü altında GFP'yi eksprese eden bicistronic HSV-GFP virüs vektörü p1005+ HSV'ye alt klonlandı. Viral parçacıklar, McGovern Enstitüsü'ndeki (MIT) Viral Çekirdek Tesisi tarafından üretildi. Daha fazla bilgi için lütfen direktör Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu)</td></tr><tr><td>mGlu2&Delta ile iletişime geçin; TM4N bicitronic herpes simpleks virüsü (HSV) vektörü&nbsp;</td><td>MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 ve mGlu2DTM4N, CMV promotörün kontrolü altında GFP'yi eksprese eden bicistronic HSV-GFP virüs vektörü p1005+ HSV'ye alt klonlandı. Viral parçacıklar, McGovern Enstitüsü'ndeki (MIT) Viral Çekirdek Tesisi tarafından üretildi. Daha fazla bilgi için lütfen direktör Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu) ile iletişime geçin.</td></tr><tr><td></td><td>MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 ve mGlu2DTM4N, CMV promotörün kontrolü altında GFP'yi eksprese eden bicistronic HSV-GFP virüs vektörü p1005+ HSV'ye alt klonlandı. Viral parçacıklar, McGovern Enstitüsü'ndeki (MIT) Viral Çekirdek Tesisi tarafından üretildi. Daha fazla bilgi için lütfen direktör Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu)</td></tr> <tr><td>Xylazine&nbsp;</td> ile iletişime geçin;<td>Lloyd</td><td>List no. 4811-20ml, NADA # 139-236, NDC Kod(lar): 61311-481-10</td><td>1.35 ml ketamin (100 mg / ml) + 0.75 ml ksilazin (20 mg / ml) 12.0 ml% 0.9 tuzlu su çözeltisi içinde seyreltilir</td></tr><tr><td>Ketamin ve nbsp;</td><td>Vedco</td><td>KetaVed-10ml, NADA # 200-029, NDC Kod(lar): 50989-161-06</td><td>1.35 ml ketamin (100 mg / ml) + 0.75 ml ksilazin (20 mg / ml) 12.0 ml% 0.9 tuzlu su çözeltisi içinde seyreltilir</td></tr><tr><td>Oftalmik jel</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0550805</td><td></td></tr><tr><td>Burret klipsleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9268369</td><td></td></tr><tr><td>Tüy cerrahi bıçak</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9032736</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen Peroksit</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-898-919&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton şırınga</td><td>Fisher Scientific</td><td>14815203</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton & trade; Küçük Hub Çıkarılabilir İğneler (33 Ga)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14816206</td><td></td></tr><tr><td>Akülü Mikro Matkap</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9089241</td><td></td></tr><tr><td>Dermabond Dermal Yapıştırıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0690470</td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)-1- (2,5-Dimetoksi-4-iyodofenil) -2-aminopropan hidroklorür (DOI)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>42203-78-1</td><td>% 0.9 tuzlu su çözeltisi içinde 2.0 mg / kg konsantrasyonuna kadar çözülür</td></tr></tbody></table>

kimerik yapılar hsv-aracılı transgen İfade farelerde gpcr heteromers davranışsal fonksiyon eğitim için

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

5-HT2A ve mGlu2 arasındaki heteromerik reseptör kompleksi, psikoz1,2'nin fare modellerindeki bazı davranışsal fenotiplerde rol oynamıştır. Sonuç olarak, şizofreni ile ilişkili davranışları etkileyen 5-HT2A ve mGlu2 arasındaki etkileşimin yapısal detaylarının incelenmesi güçlü bir translasyon aracını temsil etmektedir. Daha önce gösterildiği gibi, farelerde kafa seğirmesi tepkisi (HTR) halüsinojenik ilaçlar tarafından ortaya çıkar ve bu davranışsal yanıt 5-HT2A nakavt (KO) farelerindeyoktur 3,4. Ek olarak, 5-HT2A reseptörünü sadece kortekste şartlı olarak eksprese ederek, kortikal piramidal nöronlar üzerindeki 5-HT2A reseptörüne bağlı sinyal yollarının, halüsinojenik ilaçlara3 yanıt olarak kafa seğirme davranışını ortaya çıkarmak için yeterli olduğu gösterilmiştir. Son olarak, halüsinojenler DOI ve liserjik asit dietilamid (LSD) tarafından indüklenen baş seğirmesi davranışsal tepkisinin mGlu2-KO farelerinde önemli ölçüde azaldığı gösterilmiştir5. Bu bulgular, mGlu2'nin, LSD benzeri ilaçların neden olduğu 5-HT2A reseptörüne bağlı psikoz benzeri davranışsal etkiler için en azından kısmen gerekli olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, bu, bu davranışsal fenotip için 5-HT2A-mGlu2 reseptör kompleksinin gerekli olup olmadığına dair kanıt sağlamaz. Bu soruyu ele almak için, mGlu2-KO farelerinin frontal korteksinde mGlu2 veya mGlu2ΔTM4N'yi (5-HT2A-mGlu2 reseptör kompleksini oluşturmayan mGlu2 / mGlu3 kimerik yapı) eksprese etmek için herpes simpleks virüsü (HSV) yapıları, bu GPCR heteromerik kompleksinin LSD benzeri ilaçların neden olduğu davranışsal etkiler için gerekli olup olmadığını incelemek için kullanıldı6.

Önceki bulgular halusinojenler tarafından güvenilir ve sağlam ortaya bir fare davranış cevabı baş-seğirme olduğunu göstermektedir ve bu 5-HT 2A -KO fareler 3 yoktur. Ayrıca, DOI ve LSD halüsinojenik 5-HT2A agonistlerin kafa seğirme yanıtı anlamlı mGlu2-KO farelerde 5 azaldığını göstermiştir. Bununla birlikte, her ne kadar önceki bulgular ikna edici çözülemediğini canlı farelerde gibi bu yapısal düzenleme hareket ile 5-HT2A ve mGlu2 t...

Bu makalede, GPCR heteromerik oluşumunu gerektiren davranış testleri test etmek için fare frontal korteks içine viral vektörlerin enjekte açıklamaktadır.

Kimerik Yapılar HSV-aracılı Transgen İfade Farelerde GPCR Heteromers Davranışsal Fonksiyon Eğitim için

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

Bu yöntemin genel amacı, virüs aracılı gen transferinin, fare modellerinde G-protein kenetli reseptörlerin heterodimerizasyonunu gerektiren davranışsal fenotipleri nasıl etkilediğini gözlemlemektir. Bu yöntem, nöro ve psikofarmakoloji alanındaki temel soruların, özellikle de G-protein kenetli reseptörlerin moleküler düzeyde birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğinin yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu yöntemi kullanarak, bu etkileşimin şizofreni ve depresyon gibi psikiyatrik bozukluk modellerinde davranışı nasıl etkilediğini anlayabiliriz. Bu yöntemi kullanarak, her ikisinin de şizofreni hastalarının tedavisinde kullanılan ilaçların etki mekanizmasında rol oynadığı gösterilen serotonin 2a ve metabotropik glutamat reseptör 2'yi özel olarak inceleyeceğiz. Fareyi onaylanmış yöntemlere göre uygun şekilde anestezi ederek başlayın.Ayak parmağı sıkıştırma testi yaparak yanıt alınmadığının gözlemlenmesiyle cerrahi anestezi düzeyine ulaşıldığından emin olun. Ardından, gözleri korumak için oftalmik jel uygulayın. Kafatasının düz ve yatay olduğundan emin olacak şekilde başın eğimini ayarlayarak fareyi stereotaktik çerçeveye sabitleyin.Açığa çıkarılan kafa derisine povidon iyot uygulayın. Bir s

hsv-mediated-transgene-expression-chimeric-constructs-to-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz retroviral transdüksiyon kullanarak fare antijen spesifik T-hücrelerinin üretmek için bir protokol...

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

Viral vektörler hedefli gen manipülasyonu için izin verir. Bu arka boynuzu içine, bir viral vektör stereotaksik enjeksiyon, birincil somatosensoriyel afferentleri ve merkezi sinir sistemi nöronları arasındaki sinaptik bir temas önemli yer kullanılarak, koşullu gen ekspresyonu ya da fare omurilik ablasyonu için bir yöntem göstermektedir.

Fare Omurilik Koşullu Gen Manipülasyon için bir Viral Vector Stereotaksik Enjeksiyon

İkili bir genetik stratejiden yararlanarak, Cre aracılı rekombinasyondan sonra tamamlayıcı transsinaptik izleyicileri eksprese eden farelerde nöral devre izleme için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. Hücreye özgü izleyici üretimi genetik olarak kodlandığından, deneysel yaklaşımımız, murin embriyonik beyin gelişimi sırasında tek hücre çözünürlüğünde nöral devrelerin oluşumunu ve olgunlaşmasını incelemek için uygundur.

Embriyonik Fare beyninde İzleme Koşullu Genetik transsinaptik

Enterik sinir sistemi, bağırsağı çoğaltan, göç eden ve kolonize eden nöral krest hücreleri tarafından oluşturulur. Nöral krest hücreleri, nörotransmitter fenotiplerine özgü belirteçlerle nöronlara farklılaşır. Bu protokol, enterik sinir sistemi nörotransmitter ekspresyonunu görselleştirmek için murin embriyonik gastrointestinal sistemin diseksiyonu, sabitlenmesi ve immün boyanması için bir tekniği tanımlar.

Fare Enterik Sinir Sistemi Geliştirme gözünüzde canlandırın için immün

Geçerli protokol birleştiren tek hücre insan TCR alpha ve beta zinciri sıralama ile eşleştirilmiş retroviral vektörler vitro ve in vivo TCR ifade ile uyumlu nesil aerodinamik.

Tek hücre TCR yalıtım ve üretme-in Vitro için Retroviral Vektörler ve In Vivo ifade insan TCRs aerodinamik

Kümelenmiş düzenli olarak kısa palindromik tekrarlar/ilişkili CRISPR protein 9 (CRISPR/Cas9) interspaced sistem genetik mühendisliği için umut verici bir araçtır ve hedeflenen entegrasyonu transgenes olasılığı kadar açılır. Biz (HMEJ) katılmadan homoloji-aracılı son tarif-verimli DNA Tümleştirme vivo içinde hedef ve gen tedavileri CRISPR/Cas9 kullanarak hedef için strateji tabanlı.

Bir bitiş homoloji-aracılı katılmadan tabanlı strateji kullanarak hedeflenen Integration CRISPR/Cas9-aracılı Vivo içinde

Recombinase bağımlı rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV) kesici enjeksiyon herhangi bir genetik olarak etiketli hücre tipi spinal kord işlemek için kullanılabilir. Burada biz lomber spinal kord dorsal boynuz nöronlarda transduce anlatan. Bu teknik işlenmiş nöron alt türündeki fonksiyonel sorgulama sağlar.

Omurilik genetik olarak tanımlanmış nöronlar Adeno ilişkili virüs-aracılı Transgene ifade

Burada, lentiviral bir vektör perivitelline alanda bir döllenmiş yumurta, basit bir iğne ile transgene entegrasyon ve kurucusu transgenik fareler ile yüksek etkinlik üretimini teşvik için bir protokol mevcut.

Lentiviral aracılı transgenik fareler üretimi: doğrudan eğitim kurucuları basit ve son derece etkili bir yöntem

Burada sunulan canlı fare oküler yüzey görüntüleme için bir multifoton mikroskobik platformdur. Floresan transgenik fare hücre çekirdekleri, hücre zarları, sinir lifleri ve oküler yüzey içinde kılcal damarların görüntülenmesi sağlar. Kolaj nasyonal yapılardan elde edilen doğrusal olmayan ikinci harmonik nesil sinyalleri stromal mimariler için etiketsiz görüntüleme sağlar.

Fare Kornea ve Konjonktiva Canlı Görüntüleme için Özel Multifoton Mikroskop platformu

Kaçakçılık reseptörlerinin retroviral transdüksiyonu ve reseptör aracılı organ ve mikroçevreye özgü lenfosit konumlandırmasını incelemek için rekabetçi hedef arama için geliştirilmiş protokoller sunuyoruz. Bu yöntem, bağışıklık hücresi kaçakçılığı mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sunar ve gelecekteki temel ve terapötik araştırmalarda potansiyel uygulamalara sahiptir.

Farklı Doku Mikroortamlarında GPCR Aracılı T Hücresi Lokalizasyonunu Araştırmak için Verimli Retroviral Transdüksiyon ve Rekabetçi Hedef Arama

Öğrenin fare modellerinde GPCR heteromerizasyonunun davranışsal etkilerini HSV-aracılı gen transferi ile incelemeyi. Bu yöntem, 5-HT2A-mGlu2 reseptör kompleksinin halüsinojen yanıtlarındaki rolünü anlamak için kullanılır.

Kimerik Yapılar HSV-aracılı Transgen İfade Farelerde GPCR Heteromers Davranışsal Fonksiyon Eğitim için

Daha fazla video keşfet