Bozulmamış Arterlerin endotel katmanı Nitrik Oksit ve Süperoksit En Yüz Algılama

Bu prosedürün genel amacı, yeni izole edilmiş sağlam fare aortlarında floresan boya DAF-2DA ve DHE kullanarak hücre içi nitrik oksit ve süperoksit anyonlarını aynı anda tespit etmektir. Bu yöntem, endotel disfonksiyonu ve eNOS ayrılması gibi kardiyovasküler fizyoloji alanındaki araştırmacının vakasını laboratuvarda kurtarmaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, sağlam kan damarlarında nitrik oksit ve süperoksit anyonunun eş zamanlı olarak ex vivo doğrudan tespiti ve görselleştirilmesi için basit ve kesin bir yöntem sağlamaktır.

Bu protokol için, 37 santigrat dereceye kadar ısıtılabilen ve bir karbon gaz tankından %95 oksijen, %5 karbondioksit gazı ile havalandırılabilen bir organ banyosu sistemi inşa edin. Başlamak için, ilgilenilen dokuları yıkamak için gerektiği kadar taze Krebs-Ringer Bikarbonat Tamponu hazırlayın. Örneğin, bir deneyde aortlar için 200 mililitre gereklidir.

Organ banyosu sistemini açın ve ısı kontrolünü 37 santigrat dereceye ayarlayın. Hazneleri Krebs-Ringer Bikarbonat Tampon ile yıkadıktan sonra, her hazneye beş mililitre Krebs-Ringer Bikarbonat Tampon ekleyin ve gazı 30 dakika boyunca %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile havalandırmak için açın. Odaları kapalı tutun.

Ayrıca, havalandırmalı bir şişe buz gibi Krebs-Ringer Bikarbonat Tampon hazırlayın. Torasik aortu çıkardıktan sonra, tüm dokuyu hemen buz gibi soğuk Krebs-Ringer tamponu olan bir kaba daldırın. Diseksiyon mikroskobu altında, torasik aort segmentini tamponda tutarken kalbi ve aort arkını çıkarın.

Ardından, cerrahi makas ve forseps kullanarak aortu perivasküler dokuya yapışmadan diseksiyon yapın. Daha sonra, dokunun kenarını kavramak için forseps kullanın ve bir şırıngadan verilen buz gibi soğuk Krebs-Ringer tamponunu kullanarak kanı vasküler lümenden nazikçe yıkayın. Vasküler lümendeki kan pıhtıları, yapay sinyallere neden olabileceğinden ve floresan sinyallere müdahale edebileceğinden dışarı atılmalı ve aynı zamanda endotel tabakasına zarar vermemek için yıkama kuvveti kontrol edilmelidir.

Şimdi, temizlenmiş aort halkalarını üç milimetre uzunluğunda parçalar halinde kesin. Temizlenmiş aort halkalarını hazırladıktan sonra boyayın. Aort halkalarının sadece advential tarafına forseps ile dokunarak, kan damarlarını klemplemeden, temizlenmiş aort segmentlerini hazırlanan organ banyo odalarına aktarın.

Arterlerin tamponda 30 dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Yarım saat sonra, bir mikromolar son konsantrasyon vermek için organ banyosuna asetilkolin ekleyin ve arterleri asetilkolin ile 10 dakika inkübe edin. Bu arada, 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde, önceden ısıtılmış Krebs tamponu ile bir mililitre boyama çözeltisi hazırlayın.

Ardından, ışığa maruz kalmayı en aza indirmek ve 37 santigrat derecede tutmak için tüpü folyoya sarın. Asetilkolin stimülasyonundan sonra, aort halkalarını organ banyosundan boyama solüsyonu tüpüne aktarın ve havalandırma ile karanlıkta 30 dakika inkübe etmelerine izin verin. Bu noktadan sonraki tüm adımlar minimum ışığa maruz kalma ile yapılmalıdır.

Daha sonra, aort halkalarını bir dakika boyunca Krebs tamponu ile doldurulmuş yeni bir tüpe aktarın. Bu yıkama adımını üç kez gerçekleştirin. Daha sonra, aort halkalarını oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehit çözeltisi banyosuna sabitleyin.

Sabitleme adımından sonra, karşı boyayı uygulamak için halkaları oda sıcaklığında üç dakika boyunca DAPI çözeltisine aktarın. Ardından, aort halkalarını yıkama başına bir dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın. Halkaları hareket ettirirken daima endotel dokusunun kırılganlığına karşı hassas olun.

Mikroskop altında, aort halkalarını bir slayt üzerinde mikrocerrahi makasla uzunlamasına kesin. Ardından, aortu ıslak tutarken üzerindeki fazla sıvıyı çıkarın. İki mikrocerrahi forseps kullanarak kıvrılmış aortları, endotel cam slayt üzerinde aşağı bakacak şekilde bir slayta karşı düz bir şekilde zorlayın.

Bu süreçte aort damarlarını ileri geri hareket ettirmeyin. Bu adım çok kritiktir, ancak kullanımı kolay değildir. Resmi deneyden önce iyi pratik yapmak daha iyidir.

Ardından, montaj ortamını aort üzerine bırakın. Slaytı kapatın ve oje ile kapatın. Karanlıkta havayla kuruduktan sonra, konfokal mikroskopi kullanarak slaytları görüntüleyin.

200 hertz tarama hızı, 1024 x 1024 piksel çözünürlük ve çeyrek mikron z yığını boyutu kullanın. DAF-2DA'yı gözlemlemek için bir argon lazer kullanın, heyecan floresansını 488 nanometreye ve emisyon algılamasını 515 nanometreye ayarlayın. DHE'yi gözlemlemek için, uyarıcı floresansı 514 nanometreye ayarlayın ve algılamayı 605 nanometreye ayarlayın.

10x büyütme ile odaklama yaptıktan sonra, hedefi 40x büyütmeye ayarlayın. Şimdi, DAPI ile boyanmış çekirdekleri yer işaretleri olarak kullanarak, kontrol panelindeki z konumunu ayarlayarak endotel tabakasının aralığını tanımlayın. Ardından, lümen sınırındaki endotel tabakasından endotel tabakasının tam kalınlığı boyunca tarayın ve görüntüleri kaydedin.

Her örnek için en az üç farklı görüş alanını tarayın. Genç C57 siyah 6 fare, 14 hafta boyunca yüksek yağlı bir diyetle beslenerek obez hale getirildi. Kontroller normal bir yemekle beslendi.

14 hafta sonra torasik arterleri incelendi. Boyamadan önce, dokular bir nanomolarda bir saat boyunca eNOS inhibitörü L-NAME'e maruz bırakıldı. Yeşil renkte görülen DAF-2T'den gelen sinyal, floresan olmayan DAF-2'den nitrik oksit ile dönüştürülür.

Bu nedenle, boyama, bir hücrede nitrik oksit varlığını gösterir. Benzer şekilde, süperoksit tarafından oksitlendiğinde, DHE kırmızı bir floresan sinyali verir. Bu nedenle, daha fazla kırmızı renk gösteren örnekler, hücrelerde daha fazla süperoksit içerir.

Konfokal floresan görüntülerinin ölçülmesi, yüksek yağlı diyetle beslenen farelerin aort endotel tabakasında nitrik oksit üretiminde bir azalma ve L-NAME'ye duyarlı süper oksit oluşumunda bir artış olduğunu ortaya koydu. Bu veriler, eNOS ayrışmasının obezite ile ortaya çıktığı fikrini desteklemektedir. Bu videoyu izledikten sonra, nitrik oksit ve süperoksit anyonlarının nasıl tespit edileceğini ve sağlam kan damarlarında floresan boyaların kullanımını iyi anlamış olmalısınız.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa altı saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, tüm operasyon prosedürü boyunca endotel tabakasını sağlam tutmayı unutmamak önemlidir. Ve fiksasyon adımından önce endotel hücrelerini canlı tutmak için kan damarlarını her zaman Krebs-Ringer tamponuna daldırın.

Bu prosedürle birleştirilerek, vasküler tonusun düzenlenmesinde endotel hücrelerinin fizyolojik işlevi gibi ek soruları yanıtlamak için kan damarlarının vazomotor yanıtlarının analizi gibi diğer önlemler de gerçekleştirilebilir.