Bozulmamış Arterlerin endotel katmanı Nitrik Oksit ve Süperoksit En Yüz Algılama
25 Şubat 2016
Bu yazıda floresan boya tr yüz eşzamanlı algılama ve hücre içi nitrik oksit görselleştirme (NO) ve süperoksit anyon (O 2 diaminofluorescein-2 diasetat (DAF-2DA) ve dihydroethidium (DHE) kullanarak adapte nispeten kolay bir yöntem tarif .- ) sırasıyla, taze bir obezite fare modelinin sağlam aorta izole edilmiştir.
Bu prosedürün genel amacı, yeni izole edilmiş sağlam fare aortlarında floresan boya DAF-2DA ve DHE kullanarak hücre içi nitrik oksit ve süperoksit anyonlarını aynı anda tespit etmektir. Bu yöntem, endotel disfonksiyonu ve eNOS ayrılması gibi kardiyovasküler fizyoloji alanındaki araştırmacının vakasını laboratuvarda kurtarmaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, sağlam kan damarlarında nitrik oksit ve süperoksit anyonunun eş zamanlı olarak ex vivo doğrudan tespiti ve görselleştirilmesi için basit ve kesin bir yöntem sağlamaktır.
Bu protokol için, 37 santigrat dereceye kadar ısıtılabilen ve bir karbon gaz tankından %95 oksijen, %5 karbondioksit gazı ile havalandırılabilen bir organ banyosu sistemi inşa edin. Başlamak için, ilgilenilen dokuları yıkamak için gerektiği kadar taze Krebs-Ringer Bikarbonat Tamponu hazırlayın. Örneğin, bir deneyde aortlar için 200 mililitre gereklidir.
Organ banyosu sistemini açın ve ısı kontrolünü 37 santigrat dereceye ayarlayın. Hazneleri Krebs-Ringer Bikarbonat Tampon ile yıkadıktan sonra, her hazneye beş mililitre Krebs-Ringer Bikarbonat Tampon ekleyin ve gazı 30 dakika boyunca %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile havalandırmak için açın. Odaları kapalı tutun.
Ayrıca, havalandırmalı bir şişe buz gibi Krebs-Ringer Bikarbonat Tampon hazırlayın. Torasik aortu çıkardıktan sonra, tüm dokuyu hemen buz gibi soğuk Krebs-Ringer tamponu olan bir kaba daldırın. Diseksiyon mikroskobu altında, torasik aort segmentini tamponda tutarken kalbi ve aort arkını çıkarın.
Ardından, cerrahi makas ve forseps kullanarak aortu perivasküler dokuya yapışmadan diseksiyon yapın. Daha sonra, dokunun kenarını kavramak için forseps kullanın ve bir şırıngadan verilen buz gibi soğuk Krebs-Ringer tamponunu kullanarak kanı vasküler lümenden nazikçe yıkayın. Vasküler lümendeki kan pıhtıları, yapay sinyallere neden olabileceğinden ve floresan sinyallere müdahale edebileceğinden dışarı atılmalı ve aynı zamanda endotel tabakasına zarar vermemek için yıkama kuvveti kontrol edilmelidir.
Şimdi, temizlenmiş aort halkalarını üç milimetre uzunluğunda parçalar halinde kesin. Temizlenmiş aort halkalarını hazırladıktan sonra boyayın. Aort halkalarının sadece advential tarafına forseps ile dokunarak, kan damarlarını klemplemeden, temizlenmiş aort segmentlerini hazırlanan organ banyo odalarına aktarın.
Arterlerin tamponda 30 dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Yarım saat sonra, bir mikromolar son konsantrasyon vermek için organ banyosuna asetilkolin ekleyin ve arterleri asetilkolin ile 10 dakika inkübe edin. Bu arada, 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde, önceden ısıtılmış Krebs tamponu ile bir mililitre boyama çözeltisi hazırlayın.
Ardından, ışığa maruz kalmayı en aza indirmek ve 37 santigrat derecede tutmak için tüpü folyoya sarın. Asetilkolin stimülasyonundan sonra, aort halkalarını organ banyosundan boyama solüsyonu tüpüne aktarın ve havalandırma ile karanlıkta 30 dakika inkübe etmelerine izin verin. Bu noktadan sonraki tüm adımlar minimum ışığa maruz kalma ile yapılmalıdır.
Daha sonra, aort halkalarını bir dakika boyunca Krebs tamponu ile doldurulmuş yeni bir tüpe aktarın. Bu yıkama adımını üç kez gerçekleştirin. Daha sonra, aort halkalarını oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehit çözeltisi banyosuna sabitleyin.
Sabitleme adımından sonra, karşı boyayı uygulamak için halkaları oda sıcaklığında üç dakika boyunca DAPI çözeltisine aktarın. Ardından, aort halkalarını yıkama başına bir dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın. Halkaları hareket ettirirken daima endotel dokusunun kırılganlığına karşı hassas olun.
Mikroskop altında, aort halkalarını bir slayt üzerinde mikrocerrahi makasla uzunlamasına kesin. Ardından, aortu ıslak tutarken üzerindeki fazla sıvıyı çıkarın. İki mikrocerrahi forseps kullanarak kıvrılmış aortları, endotel cam slayt üzerinde aşağı bakacak şekilde bir slayta karşı düz bir şekilde zorlayın.
Bu süreçte aort damarlarını ileri geri hareket ettirmeyin. Bu adım çok kritiktir, ancak kullanımı kolay değildir. Resmi deneyden önce iyi pratik yapmak daha iyidir.
Ardından, montaj ortamını aort üzerine bırakın. Slaytı kapatın ve oje ile kapatın. Karanlıkta havayla kuruduktan sonra, konfokal mikroskopi kullanarak slaytları görüntüleyin.
200 hertz tarama hızı, 1024 x 1024 piksel çözünürlük ve çeyrek mikron z yığını boyutu kullanın. DAF-2DA'yı gözlemlemek için bir argon lazer kullanın, heyecan floresansını 488 nanometreye ve emisyon algılamasını 515 nanometreye ayarlayın. DHE'yi gözlemlemek için, uyarıcı floresansı 514 nanometreye ayarlayın ve algılamayı 605 nanometreye ayarlayın.
10x büyütme ile odaklama yaptıktan sonra, hedefi 40x büyütmeye ayarlayın. Şimdi, DAPI ile boyanmış çekirdekleri yer işaretleri olarak kullanarak, kontrol panelindeki z konumunu ayarlayarak endotel tabakasının aralığını tanımlayın. Ardından, lümen sınırındaki endotel tabakasından endotel tabakasının tam kalınlığı boyunca tarayın ve görüntüleri kaydedin.
Her örnek için en az üç farklı görüş alanını tarayın. Genç C57 siyah 6 fare, 14 hafta boyunca yüksek yağlı bir diyetle beslenerek obez hale getirildi. Kontroller normal bir yemekle beslendi.
14 hafta sonra torasik arterleri incelendi. Boyamadan önce, dokular bir nanomolarda bir saat boyunca eNOS inhibitörü L-NAME'e maruz bırakıldı. Yeşil renkte görülen DAF-2T'den gelen sinyal, floresan olmayan DAF-2'den nitrik oksit ile dönüştürülür.
Bu nedenle, boyama, bir hücrede nitrik oksit varlığını gösterir. Benzer şekilde, süperoksit tarafından oksitlendiğinde, DHE kırmızı bir floresan sinyali verir. Bu nedenle, daha fazla kırmızı renk gösteren örnekler, hücrelerde daha fazla süperoksit içerir.
Konfokal floresan görüntülerinin ölçülmesi, yüksek yağlı diyetle beslenen farelerin aort endotel tabakasında nitrik oksit üretiminde bir azalma ve L-NAME'ye duyarlı süper oksit oluşumunda bir artış olduğunu ortaya koydu. Bu veriler, eNOS ayrışmasının obezite ile ortaya çıktığı fikrini desteklemektedir. Bu videoyu izledikten sonra, nitrik oksit ve süperoksit anyonlarının nasıl tespit edileceğini ve sağlam kan damarlarında floresan boyaların kullanımını iyi anlamış olmalısınız.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa altı saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, tüm operasyon prosedürü boyunca endotel tabakasını sağlam tutmayı unutmamak önemlidir. Ve fiksasyon adımından önce endotel hücrelerini canlı tutmak için kan damarlarını her zaman Krebs-Ringer tamponuna daldırın.
Bu prosedürle birleştirilerek, vasküler tonusun düzenlenmesinde endotel hücrelerinin fizyolojik işlevi gibi ek soruları yanıtlamak için kan damarlarının vazomotor yanıtlarının analizi gibi diğer önlemler de gerçekleştirilebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, taze izole edilmiş sağlam fare aortalarında hücre içi nitrik oksit (NO) ve süperoksit anyonun (O2−) DAF-2DA ve DHE floresan boyaları kullanılarak eş zamanlı saptanması ve görselleştirilmesi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Yöntem, özellikle obezite kaynaklı vasküler değişiklikler bağlamında endotel fonksiyonu ve disfonksiyonunu incelemek için uygulanmakta olup, vasküler oksidatif durumun ex vivo analizi için basit ve kesin bir yaklaşım sağlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kardiyovasküler fizyoloji
- Vasküler biyoloji
- Endotelyal hücre araştırmaları
Arka Plan
- Endotel kaynaklı nitrik oksit (NO), endotelyal NO-sentaz (eNOS) tarafından üretilen temel bir vazoprotektif moleküldür.
- Uncoupling (ayrışma) gibi durumlar nedeniyle eNOS'un işlevsiz hale gelmesi, NO'nun azalmasına ve süperoksit anyonun (O2−) artmasına yol açarak kardiyovasküler hastalıklara katkıda bulunur.
- Kan damarlarındaki NO ve O2− değerlerinin doğrudan ölçümü, bu moleküllerin labil doğası nedeniyle zordur.
- Mevcut tespit yöntemleri genellikle düşük hassasiyete sahiptir, spesifik değildir veya teknik açıdan zahmetlidir.
Çalışmanın Amacı
- Bozulmamış kan damarlarında NO ve O2− tayini ve görselleştirilmesi için basit, doğrudan ve eş zamanlı bir yöntem sağlamak.
- Obezite kaynaklı vasküler disfonksiyonun mevcut olduğu bir fare modelinde endotel fonksiyonunu ve oksidatif stresi değerlendirmek.
- Bu tekniğin, çeşitli (fizyo)patolojik koşullar altındaki endotel (dis)fonksiyonu çalışmalarında daha geniş kapsamlı uygulanmasına olanak tanımak.
Kullanılan Yöntemler
- Ex vivo doku korunumu için sıcaklık ve gaz kontrollü bir organ banyosu sisteminin hazırlanması.
- Fare torasik aortunun diseksiyonu ve temizlenmesi, ardından aort halkalarının hazırlanması.
- Asetilkolin stimülasyonu ve L-NAME inhibisyonu kontrolleri eşliğinde, aort segmentlerinin DAF-2DA (NO için) ve DHE (süperoksit için) ile boyanması.
- Konfokal mikroskopi görüntüleme için dokunun fiksasyonu, DAPI ile karşıt boyanması ve lam üzerine yerleştirilmesi.
- Endotelyal tabakadaki NO ve süperoksit seviyelerini değerlendirmek için floresan sinyallerinin kantitatif analizi.
Temel Sonuçlar
- Obez farelerde (yüksek yağlı diyet), zayıf kontrol grubuna kıyasla aort endotel hücrelerinde NO üretiminin azaldığı ve süperoksit üretiminin arttığı gözlemlenmiştir.
- Floresans görüntüleme, NO (yeşil, DAF-2T) ve süperoksit (kırmızı, DHE) sinyallerinin net bir şekilde görselleştirilmesine ve miktarının belirlenmesine olanak sağlamıştır.
- Yöntem, eNOS inhibisyonuna (L-NAME) karşı duyarlılık göstererek NO ve süperoksit tespitine yönelik özgüllüğü doğrulamıştır.
- Protokol, işlem boyunca endotel bütünlüğünü ve canlılığını korumuştur.
Sonuçlar
- Bu floresan tabanlı teknik, sağlam kan damarlarında NO ve süperoksitin doğrudan ve eş zamanlı tespit edilmesini sağlar.
- Yöntem erişilebilir, tekrarlanabilir ve çeşitli hastalık modellerinde endotelyal fonksiyon çalışmalarına uygundur.
- Vasküler fizyoloji ve patolojiyi daha ayrıntılı araştırmak için diğer fonksiyonel analizlerle birleştirilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Endüstriyel Uygulama Alanları
İntakt arteriyel endotelde nitrik oksit ve süperoksitin eş zamanlı en face tespiti, erken evre kardiyovasküler araştırmalarda vasküler oksidatif durumun doğrudan ve kantitatif değerlendirmesine yönelik kritik bir ihtiyacı karşılamaktadır. Bu yetkinlik, vasküler disfonksiyon modelleri için hedef doğrulama ve mekanistik risk azaltmada öngörü güvenilirliğini artırarak, kardiyometabolik ilaç keşfindeki risk ayarlı portföy kararlarını destekler. Yöntemin tekrarlanabilirliği ve özgüllüğü, çalışmalar arası güçlü karşılaştırmalara ve keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar translasyonel sürekliliğe olanak tanır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- NO ve süperoksitin doğrudan nicelleştirilmesi, endotelyal disfonksiyon ve eNOS ayrışmasının mekanistik olarak sorgulanmasına olanak tanır.
- Hastalıkla ilişkili vasküler modellerde oksidatif stres katkılarını ayırt ederek biyolojik risk azaltmayı destekler.
- Kardiyovasküler programlar için hedef etkileşimi ve fonksiyonel doğrulamada öngörücü güveni kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- İntakt doku sistemlerinde oksidatif biyobelirteçler için valide edilmiş, kantitatif okumalar oluşturur.
- Alt akış bileşik tarama iş akışları için analiz standardizasyonunu ve tekrarlanabilirliğini sağlar.
- Endotelyal oksidatif dengenin farmakolojik modülasyonunu değerlendirmek için ölçeklenebilir bir platform sunar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Obezite ve metabolik sendrom bağlamlarında vasküler oksidatif durumun doğrudan değerlendirilmesine olanak tanıyarak hastalıkla ilgili modellerle uyum sağlar.
- Keşif aşamasındaki mekanistik çalışmalardan preklinik etkinlik ve biyobelirteç doğrulamasına kadar olan sürekliliği destekler.
- Fizyolojik olarak ilgili, kantitatif sonlanım noktaları sağlayarak translasyonel riski azaltır.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu floresan tabanlı tespit yöntemi, vasküler araştırmalarda erken mekanistik çalışmalar ile translasyonel biyobelirteç geliştirme arasında köprü kurarak, keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürece entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Bozulmamış endotelyumda eNOS fonksiyonu ve oksidatif stres yolları üzerinde hipotez test edilmesine olanak tanır.
- Tarama: Analiz geliştirme ve bileşik değerlendirme için tekrarlanabilir, kantitatif çıktılar sağlar.
- Analitikler: Farklı deneysel koşullar arasında NO ve süperoksit seviyelerinin güçlü bir şekilde karşılaştırılması için konfokal görüntüleme tabanlı ölçümler sunar.
- Translasyonel Araştırma: Kardiyovasküler hastalık ve metabolik disfonksiyonun preklinik modelleriyle uyumu kolaylaştırır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla hastalık modeli genelinde vasküler oksidatif biyobelirteç değerlendirmesi için yeniden kullanılabilir, uyarlanabilir bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Vasküler hedef doğrulamasında öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Oksidatif biyobelirteç tespitini tekrarlanabilir, ölçeklenebilir protokollerle standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Vasküler hedeflerin erken aşamada risklerinin azaltılmasını sağlayarak, devam/durdurme karar verme süreçlerini ve sermaye verimliliğini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Kardiyovasküler ve metabolik hastalık programlarının riskten arındırılmış önceliklendirmesini ve ilerlemesini destekler.
Uygulama Hususları
- Vasküler doku işlemleri ve konfokal mikroskopi konusunda uzmanlık gerektirir.
- Organ banyo sistemlerine, floresan boyalara ve görüntüleme altyapısına erişim gereklidir.
- Tekrarlanabilirlik ve veri karşılaştırılabilirliği için ekipler arası titiz bir standardizasyon gerektirir.
- Protokol optimizasyonu ile çeşitli vasküler yataklara ve hastalık modellerine uyarlanabilir.
- Güvenilir sonuçlar için endotel bütünlüğünün korunması ve ışık maruziyetinin en aza indirilmesi kritiktir.
![Gelişim ve karakterizasyonu İn Vitro Mikrodamar Ağ ve Endotel kantitatif ölçümleri [Ca 2+] I Ve Nitrik Oksit Üretimi](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F54014.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A18.166Z&w=384&q=75)
