Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

Bu protokolün genel amacı, dendritik hücre veya DC'ler üretmek için yüksek verimli, yüksek verimli bir yöntem geliştirmektir, bu da onların in vivo fenotipik ve fonksiyonel farklılıklarını kader olarak yansıtır. Dendritik hücreler, lenfoid organlarda büyük popülasyonlar olarak bulunur. Bu nedenle, bu izolasyonu kolaylaştırmak için donör dokulardaki bu temel hücrelerin sıklığını artırmak için filtre ligandı kullanıyoruz.

Bu tekniğin ana avantajı, yalnızca ticari olarak mevcut ajanları kullanarak analiz için tüm DC alt kümelerinin uygun sayılarda oluşturulmasını kaldırmasıdır. %90 birleşik kültürden B16 melanom hücrelerini eksprese eden flt-3 ligandını hasat etmek için, önce hücreleri PBS ile yıkayın ve kültürü 37 santigrat derecede %05 tripsin ile inkübe edin. 5 dakika sonra, proteaz aktivitesini 20 mililitre 4 santigrat derece tam dima ortamı ile söndürün ve yapışan hücre modeli katmanını hafif vurma ve hafif pipetleme ile ayırın.

Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve sayın. Daha sonra, tek hücreli süspansiyonu, C57 siyah 6 alıcı farelere deri altı enjeksiyonu için PBS'de mililitre başına 8 hücre konsantrasyonuna 1 kez yeniden askıya alın. Tümörün çapı iki ila on mililitreye ulaştığında, dalakları tümör taşıyan hayvanlardan toplayın ve dalakları taze RPMI ortamı içeren bir petri kabına yerleştirin.

Bir neşter kullanarak, dokuları 0.2 santimetre karelik parçalar halinde kesin ve daha sonra parçaları on mililitre kollajenaz ve 37 santigrat derecede Dnase içinde inkübe edin. 30 dakika sonra, kısmen sindirilmiş doku bulamacını 70 mikronluk bir hücre süzgecine dökün ve kalan doku parçalarını süzgecin ağından geçirmek için beş mililitrelik bir şırınga pistonu kullanın. Filtreyi 10 mililitre taze ortamla durulayın, yıkamayı tek hücreli süspansiyonun geri kalanıyla birleştirin ve hücreleri topaklayın.

Hücre peletini 2 mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponunda oda sıcaklığında 10 dakika süreyle askıya alıyoruz. Daha sonra hücreleri 10 mililitre taze RPMI ortamında yıkayın ve FC bloğu içeren hücre sıralama tamponunda mililitrede 1 kez 10 ila 8 hücre arasında yeniden süspanse edin. Plazma sitod DC'lerini izole etmek için, bir plazma sitot DC izolasyon kitinden 300 mikrolitre biyotin etiketli antikor kokteylini 200 mikrolitre splenik tek hücreli süspansiyon ile iyice karıştırın.

Hücreleri 15 dakika boyunca buzlu su banyosuna yerleştirin ve her üç dakikada bir hafifçe vurun. Daha sonra hücreleri 12 mililitre hücre sıralama tamponu ile yıkayın ve peleti 500 mikrolitre taze sıralama tamponunda tekrar süspanse edin. Daha sonra, hücreleri 300 mikrolitre anti-biyotin, antikor konjuge boncuklar içinde buzlu suda 15 dakika daha düzenli olarak dokunarak inkübe edin.

Hücreleri yeni ayırma tamponunda yıkadıktan sonra, paleti 2 mililitre hücre ayırma tamponunda yeniden askıya alın ve uygun boyutta bir manyetik sütunu karşılık gelen mıknatısına yükleyin. Sütunu beş mililitre taze 4 santigrat derece hücre sıralama tamponu ile dengeleyin. Tamponun tamamı kolonun üstünden boşaldığında, hücreleri dikkatlice kolon kafasının yüzeyinin ortasına ekleyin ve akışı toplayın.

Daha sonra sütunu 10 mililitre taze, 4 santigrat derece ayırma tamponu ile yıkayın ve akışı aynı tüpte toplayın. İkinci bir manyetik kolondan geçtikten sonra,% 94'ten daha büyük bir saflığa sahip bir plazma sitod dendritik hücre popülasyonu beklenebilir. CD8aplha + ve CD8alpha-DC'leri izole etmek için, splenik hücre süspansiyonunun geri kalanını, az önce gösterildiği gibi, buz üzerinde 15 dakika boyunca bir CD8alpha + dendritik hücre izolasyon kitinden 100 mikrolitre biotion konjuge antikor kokteyli ile karıştırın.

İnkübasyonun sonunda, hücreleri 12 mililitre 4 santigrat derece hücre ayırma tamponunda yıkayın ve peleti 150 mikrolitre taze 4 santigrat derece hücre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri 100 mikrolitre CD8alpha + dendritik hücre izolasyon kiti anti-biyotin boncukları ile karıştırın. Hafifçe vurarak buz üzerinde 15 dakika sonra, hücreleri 10 mililitre 4 santigrat derece hücre sıralama tamponunda yıkayın ve peleti 1 mililitre taze 4 santigrat derece ayırma tamponunda yeniden süspanse edin.

İnkübasyonun sonunda, hücreleri, az önce gösterildiği gibi, akışı ve ilk yıkamayı toplayarak manyetik boncuk ayrımına göre sıralayın. Daha sonra, hücreleri döndürün ve peleti bir mililitre taze 4 santigrat derece hücre ayırma tamponunda yeniden askıya alın. Şimdi hücreleri kitten 200 mikrolitre anti-CD8aplha konjuge manyetik boncuklarla etiketleyin ve hücreleri CD8alfa-dendritik hücre akışını toplayarak yeni bir sütundan geçirin.

CD8alpha + DC'leri toplamak için, sütunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve sütundan 5 mililitre taze 4 santigrat derece hücre sıralama tamponu daldırın. Hücreler ikinci bir sütundan geçirildikten sonra,% 96'dan daha büyük bir CD8alfa + dendritik hücre popülasyonu beklenebilir. CD8alfa hücrelerini izole etmek için, CD8alfa akış hücresi süspansiyonunu döndürün.

Daha sonra hücreleri 100 mikrolitre anti-CD11 c-manyetik boncuklarla etiketleyin ve %97'den daha büyük bir CD8alfa-dendritik hücre alt kümesi popülasyonu elde etmek için az önce gösterildiği gibi manyetik boncuk pozitif hücre popülasyonunu toplayın. Son olarak, tripan mavisi dışlaması ile canlı hücrelerin sayısını belirleyin. Tümör palpe edilebilir hale geldiğinde, B16 flt-3 ligand tümörü taşıyan fareler, splenik dendritik hücre alt kümelerinin genişlemesi ile ilişkili olan splenik hücresellikte sürekli olarak dramatik bir artış gösterir.

İlginç bir şekilde, bu hayvanlarda konvansiyonel DC'ler için mutlak hücre sayılarında 15 ila 20 kat artış gözlenirken, plazma sitot DC alt kümesi için sadece yaklaşık 4 kat artış gözlenir. Farklı dendritik hücre alt kümeleri B220, CD11b, CD11c ve CD8alfa ekspresyonlarına göre karakterize edilir. Hücre popülasyonları ayrıca başka benzersiz alt küme belirteçleri de sergiler, bununla birlikte, mPDCA1 yalnızca plazma sitod DC'leri üzerinde eksprese edilir, DEC205 CD8alpa + DC'lerde yüksek oranda eksprese edilir ve CD11b ve 33D1, CD8alpha-DC'lerde en belirgin şekilde tespit edilir.

Bu yöntemi kullanarak, CD8alpa+DC'lerin, değişmez NKT hücreleri olarak bilinen özelleşmiş bir T hücresi popülasyonuna CD bağlama molekülleri tarafından antijenlerin sunumunda en verimli olduğunu gösterdik. DC izolasyonunun en kritik özelliği, sıkı sterilite ve antidoksan içermeyen koşulları korumaktır. Prosedürler sırasında, bu T hücreleri antidoksana oldukça duyarlıdır.

Bu prosedürü denerken, tekrarlanan mekanik stimülasyon dendtritik hücrelerin olgunlaşma durumunu değiştirebileceğinden, hücreleri nazikçe tutmayı hatırlamak önemlidir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, tüm ana DC alt kümelerinin yüksek bir kısmını tek dalaktan izole etmek için kullanılabilir. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.