Name: Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Öğrenin, fare dalak dendritik hücre alt gruplarını Flt-3 ligandı ile genişleterek manyetik boncuk ayrımıyla izole etme yöntemini. Yüksek saflıkta ve verimde hücre elde edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

çalışmalar AIDS Araştırma Einstein Kanser Merkezi&#39;nde (NIH / NCI CA013330) ve Merkezi (NIH / NIAID AI51519) tarafından desteklenen FACS çekirdek imkanları kullanılarak gerçekleştirilmiştir sitometri Bu çalışma, SAP Flow NIH / NIAID hibe AI45889 tarafından desteklenmiştir.

Hayvan deneyleri kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış esaslara uygun olarak yapılır. sterilite gerektiren tüm işlemler bir biyogüvenlik kabini içinde yapılmaktadır. Farelerde B16.Flt3L Melanom 1. implantasyonu <ol><li> Kültür, 37 ° C&#39;de% 10 CO2 ile birlikte DMEM ortamı içinde 0.5 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir yoğunlukta T25 doku kültürü şişelerinde Flt-3 eksprese eden B16 melanoma hücre soyu. Hücreler ulaşana kadar ~% 90 izdiham (~ 20 saat) büyütün. </li><li> sindirim tripsin hücreleri hasat. Aspire hücre kültür ortamı ve PBS ile yapışık hücrelere yıkayın. % 0.05 tripsin 5 ml ilave edilir ve 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edilir. Proteaz hazmı sönmesi için soğuk 20 ml bitmiş DMEM ortamı fetal dana serumu (FCS) ihtiva eden (4 ° C) ekleyin. hafifçe hücreleri kaldırın nazikçe yukarı ve aşağı pipetleme takip vurma. </li><li> 300 santrifüj hücreleri toplamak4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca x g. Hemasitometre veya otomatik hücre canlılığı sayacı kullanarak hücreleri sayın. PBS içinde 10 8 hücre / ml&#39;lik bir yoğunluğa yeniden süspanse edin. </li><li> Deri altına enjeksiyon ile tümör hücreleri ile implant fareleri (C57BL / 6 ya da başka bir histo suşu) hücre süspansiyonu, 100 ul (10 7 hücre) ile boyun tabanına Machholz ve ark., 19 tarafından tarif edildiği gibi. </li><li> organ için hayvanlar kurban edilmeden önce (12 gün - - çapı 10 mm, genellikle 7 2) tümör palpe veya görünür kadar büyümeye izin verin. </li></ol> Tümör taşıyan fareler ile Dalak Tek Hücre Süspansiyon 2. Hazırlık <ol><li> izofluran aşırı dozda (&gt;% 5 izofluran akış hızını ayarlamak ve durur nefes sonra poz en az 2 dakika devam) ile fareler anestezi. Ötenazi için kurumsal kurallarına göre servikal dislokasyon ile Flt-3 melanom tümör taşıyan fare Kurban. </li><li> diSteril makas 20 yardımı ile aseptik teknik kullanılarak,% 70 etanol ve hasat dalak ile cilt sinfect. </li><li> Biyogüvenlik kabini taşınması için steril bir Petri kabı içine dalak yerleştirin. steril koşullar altında burada tüm adımları uygulayın. </li><li> taze Petri kabı dalak aktarın ve RPMI ortamı ile yıkayın. Bir neşter kullanılarak küçük (~ 0.2 cm 2) parçalar halinde dalak kesin. kolajenaz / DNaz çözeltisinin 10 ml&#39;si ile 37 ° C&#39;de 30 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> 70 mikron hücre süzgecinden üzerine dalak dokusunun kısmen sindirilmiş süspansiyon dökün. 5 ml şırınga pistonu kullanarak süzgeçten ağı boyunca kalan doku parçaları sıkıştırın. </li><li> taze ortam 10 ml örgü filtre yıkayın ve filtreyi atın. pelet hücreleri 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de süspansiyon santrifüjleyin. </li><li> Süpernatant aspire ve RBC parçalama tamponu 2 ml hücre pelletini. RT f inkübeya da 10 dakika. tam RPMI ortamında 10 ml ekleyerek RBC parçalama tamponu Quench. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri. Uygun hacimde yeniden süspanse Fc Block antikoru (2.4G2) 20 ug / ml içeren bir hücre ayırma tamponu (örneğin, MACS) içinde 10 8 hücre / ml hücre yoğunluğu elde etmek için. </li></ol> Dalak Tek Hücre Süspansiyon gelen plasmasitoid DC&#39;ler, CD8α Pos DC&#39;lerin ve CD8α Neg DH&#39;lerin 3. saflaştırılması ., Tek bir hücre süspansiyonu dalak DC alt-izolasyonu, Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, bir çok-aşamalı bir işlemdir 4 bir ısıyı sürdürmek için önceden soğutulmuş tampon ve bir buzlu su banyosu kullanılarak, tüm adımları - 8 ° C: Not. Protokol aşağıdaki bölümde tüm reajan hacimleri 10 8 hücre / ml), dalak hücre süspansiyonu 200 ul bir ilk giriş için hesaplanır. Bu kadar ölçeklendirilebilir veyaaşağı ve orantılı ilk adım (3.1.1 ve 3.2.1) diğer reaktif (her zaman 1 x 10 8 hücre / ml yoğunlukta) hücre süspansiyonu hacmini değiştirerek ihtiyaca dayalı. buna göre tüm sonraki adımda reaktif hacimlerini ayarlayın. Örneğin, 1, 8 x 10 / ml dalak hücre süspansiyonu 100 ul ile başlayan tüm adımlarda yarısı belirtilen reaktif hacimlerini kullanımı. <ol><li> Plasmasitoid DC&#39;ler izolasyonu (PDC) <ol><li> dalak hücre süspansiyonu 200 ul plazmasitoid DC İzolasyon kiti temin biyotin etiketli antikor kokteyli 300 ul ekle. </li><li> İyice karıştırın ve 15 dakika buzlu su banyosunda enkübe edilir. askıya hücreleri korumak için, ve bağlayıcı antikor maksimize etmek için tüpü her 3 dakikada dokunun. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g santrifüj ile hücreler tampon sıralama 12 mi hücre ekleyin ve pelet. Süpernatant aspire bağlanmamış biotinlenmiş antikorlar kaldırmak için. </li><li> hücreyi yeniden süspansehücre sıralama tampon 500 ul pelet. anti-biyotin antikor eşlenik boncuklar 300 ul ekle. Adımı tekrarlayın 3.1.2 ve 3.1.3. </li><li> Süpernatant atılır ve hücre ayırma tamponu, 2 ml hücre pelletini. önceden soğutulmuş tamponlar kullanılarak oda sıcaklığında bu noktada tüm adımları. </li><li> manyetik stand LS sütun sıralama taze manyetik aktive hücre yerleştirin. Yıkama ve hücre ayırma tamponu, 5 ml ile kolon dengeye. </li><li> Sütun üzerine hücre süspansiyonu pipetle kolon yatağın yüzeyinin ortasına yavaşça uygulanması. akışı toplayın. </li><li> hücre sıralama 10 ml tampon ile kolon yıkayın. gerçekleşen bu akışa toplamak ve adım 3.1.7 geçen akış ile birleştirir. PDC (FT1) aracılığıyla bu sütun akışında zenginleştirilmiştir. </li><li> 2 ml hücre ayırma tamponu içinde 4 ° C, tekrar süspansiyon, 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile FT1 hücreleri pelet ve taze LS kolonu boyunca hücrelere geçme3.1.8 - adımları 3.1.6 tekrarlayarak. İki ardışık sütun bu kullanımı izole hücrelerin gelişmiş saflığını verir. </li><li> 2 ml tam RPMI ile 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ve tekrar süspansiyon Pelet hücreleri. gerekli olana kadar buz üzerine yerleştirin. </li></ol></li><li> CD8α POS ve CD8α Neg DC&#39;lerin izolasyonu Not: Bu prosedürde ilk adım B, pDC, T ve NK hücrelerinin tükenmesi olduğunu. <ol><li> Bütün dalak hücresi süspansiyonuna (adım 2.8 &#39;de elde edilen 10 8 hücre / ml&#39;lik 1 mi) ile başlayarak, CD8α Pos DC yalıtımı kitinde verilen biyotin-konjuge antikor kokteyli 100 ul ilave edin. </li><li> İyice karıştırın ve 15 dakika buzlu su banyosunda enkübe edilir. hedef hücrelere biotin etiketli antikorların bağlanma maksimize etmek için tüp hafifçe her 3 dakikada dokunun. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler tampon sıralama 12 mi hücre ekleyin ve pelet. aspire süperilişkisiz biotinlenmiş antikorlar kaldırmak için yüzen. </li><li> Hücre sıralama tampon 150 ul ve CD8α Pos DC yalıtımı kitinde verilen anti-biyotin boncuk 100 ul ekle. İyice karıştırın ve 15 dakika buzlu su banyosunda enkübe edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler tampon sıralama 10 mi hücre ekleyin ve pelet. </li><li> Yeniden süspanse 1 ml hücre ayırma tamponu içinde hücreler ve adımlar 3.1.8 boyunca 3.1.6 prosedüre uygun olarak taze bir LS kolonu üzerinden geçer. </li><li> 2 (FT2) aracılığıyla işaretlenmemiş akışını toplamak ve sütun bakiyenin atın. Bu etiketsiz fraksiyon CD8α Pos ve CD8α Neg DC&#39;ler için zenginleştirilmiştir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile FT2 hücreleri Pelet. </li><li> 1 ml hücre sıralama tampon hücreleri tekrar süspansiyon ve CD8α Pos DC izolasyon kiti sağlanan anti-CD8α konjuge manyetik boncuk 200 ul ekleyin. </li><li> temsilci3.2.6 arasındaki adımları 3.2.2 yemek. Sütunun geçen akış CD8α Neg DC&#39;ler için zenginleştirilmiş ve CD8α Pos DC&#39;ler için tükenmiştir. Bu 3 (FT3) akışı etiketli. </li><li> CD8α Pos DC&#39;ler sütununda muhafaza Zehir için, mıknatıstan sütunu kaldırmak hücre sıralama tampon 5 ml ekleyin ve LS kolonu ile temin edilen bir piston kullanarak kolon matrisi temizlemek. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri. 1 ml hücre ayırma tamponu içinde aspire supernatant ve tekrar süspansiyon. akış atmak ve 3.2.11 gibi muhafaza hücreleri toplamak dışında, saflığını artırmak 3.1.8 için adımları 3.1.6 tekrarlayarak yeni bir LS sütun aracılığıyla yeniden yıkandı hücreleri çalıştırmak için. </li><li> ST3 süspansiyondan CD8α Neg DC&#39;ler arıtmak için, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile FT3 pelet ve hücre ayırma tamponu, 300 ul süspansiyon haline getirin. </li><li> Anti-CD11c mag 100 ul ekleyinmanyetik boncuklar. İyice karıştırın ve 15 dakika buzlu su banyosunda enkübe edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile 10 mi hücre sıralama tamponu ve pelet hücreleri ekleyin. </li><li> Tekrarlayın 3.1.8 ile 3.1.5 adımları. CD8α Neg DH&#39;ler pozitif CD11c boncuklar ile seçilir ve kolona bağlanmıştır. akış yoluyla çıkarılabilir. </li><li> Saflaştırılmış CD8α Neg DCler toplamak için aşama 3.2.11 de tarif edildiği gibi kolon içinde alıkonur ve hücreler Zehir. </li></ol></li></ol> Antijen ve Hücre Transferi 4. Sıralı Yanan APC&#39;ler <ol><li> Arıtma, canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek tripan mavisi dışlama 21. kullandıktan sonra canlı hücreleri saymak. </li><li> tercih edilen antijen ile inkübe hücreleri. 100 nM konsantrasyonda 13 de glycolipid antijen denilen alfa-galaktozil seramid (αGalCer) analogları kullanın. Tipik haliyle, çok düşük attac kullanılarak 10 6 canlı hücre / kuyuda tam RPMI levhahment U tabanlı, 96 oyuklu plakalar hücre eki en aza indirir. 4 saat - 1, 37 ° C&#39;de% 5 CO2 atmosferinde inkübe hücreleri. </li><li> hafifçe birkaç kez pipetleme Hasat hücreleri. kesme kuvvetlerinin hücre hasarı en aza indirmek için geniş delik pipet uçları kullanın. PBS ile kuyu yıkayın ve hücre hasat üst düzeye çıkarmak için bu yıkar havuz. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de Pelet hücreleri ve PBS içinde arzu edilen bir yoğunluğa yeniden süspanse edin. Tipik olarak, alıcının, hayvan başına 200 ul 1.000.000 hücre enjekte edilir. konak hayvanların içine uygulanmadan önce canlılığı maksimize etmek hücreleri buz üzerinde tutun. </li><li> Intravenöz farelere ya yanal kuyruk damarı ya da retro-orbital venöz pleksus yoluyla 19 hücreleri enjekte edilir. 1 ml şırınga üzerinde 27 G iğne kullanın ve fare başına 0.1 ml maksimum hacim enjekte. </li></ol>

<ol><li>Steinman, R. M., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+cell+type+in+peripheral+lymphoid+organs+of+mice.+I.+Morphology%2C+quantitation%2C+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution.</a> J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li>
<li>Dudziak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+antigen+processing+by+dendritic+cell+subsets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo.</a> Science. 315 (5808), 107-111 (2007).</li>
<li>Belz, G. T., Nutt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+programming+of+the+dendritic+cell+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional programming of the dendritic cell network.</a> Nat Rev Immunol. 12 (2), 101-113 (2012).</li>
<li>den Haan, J. M., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+versus+activation-dependent+cross-presentation+of+immune+complexes+by+CD8%28%2B%29+and+CD8%28-%29+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Constitutive versus activation-dependent cross-presentation of immune complexes by CD8(+) and CD8(-) dendritic cells in vivo.</a> J Exp Med. 196 (6), 817-827 (2002).</li>
<li>Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation%3A+a+general+mechanism+for+CTL+immunity+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance.</a> Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).</li>
<li>Yamazaki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+CD205%2B+splenic+dendritic+cells+are+specialized+to+induce+Foxp3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD8+ CD205+ splenic dendritic cells are specialized to induce Foxp3+ regulatory T cells.</a> J Immunol. 181 (10), 6923-6933 (2008).</li>
<li>Mukherjee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEC-205-mediated+antigen+targeting+to+steady-state+dendritic+cells+induces+deletion+of+diabetogenic+CD8%28%2B%29+T+cells+independently+of+PD-1+and+PD-L1%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">DEC-205-mediated antigen targeting to steady-state dendritic cells induces deletion of diabetogenic CD8(+) T cells independently of PD-1 and PD-L1.</a> Int Immunol. 25 (11), 651-660 (2013).</li>
<li>Melief, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-review%3A+Regulation+of+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+by+dendritic+cells%3A+peaceful+coexistence+of+cross-priming+and+direct+priming%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming.</a> Eur J Immunol. 33 (10), 2645-2654 (2003).</li>
<li>Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The biology of NKT cells.</a> Annu Rev Immunol. 25, 297-336 (2007).</li>
<li>Benlagha, K., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1d-restricted+mouse+V+alpha+14+and+human+V+alpha+24+T+cells%3A+lymphocytes+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD1d-restricted mouse V alpha 14 and human V alpha 24 T cells: lymphocytes of innate immunity.</a> Semin Immunol. 12 (6), 537-542 (2000).</li>
<li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells%3A+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li>
<li>Arora, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+subset+of+dendritic+cells+controls+the+cytokine+bias+of+natural+killer+T+cell+responses+to+diverse+glycolipid+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A single subset of dendritic cells controls the cytokine bias of natural killer T cell responses to diverse glycolipid antigens.</a> Immunity. 40 (1), 105-116 (2014).</li>
<li>Semmling, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+cross-priming+through+CCL17-CCR4-mediated+attraction+of+CTLs+toward+NKT+cell-licensed+DCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs.</a> Nat Immunol. 11 (4), 313-320 (2010).</li>
<li>Duriancik, D. M., Hoag, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+and+enumeration+of+dendritic+cell+populations+from+individual+mouse+spleen+and+Peyer%27s+patches+using+flow+cytometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">The identification and enumeration of dendritic cell populations from individual mouse spleen and Peyer's patches using flow cytometric analysis.</a> Cytometry A. 75 (11), 951-959 (2009).</li>
<li>Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flt3+ligand+regulates+dendritic+cell+development+from+Flt3%2B+lymphoid+and+myeloid-committed+progenitors+to+Flt3%2B+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo.</a> J Exp Med. 198 (2), 305-313 (2003).</li>
<li>Mach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+dendritic+cells+stimulated+in+vivo+by+tumors+engineered+to+secrete+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+or+Flt3-ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand.</a> Cancer Res. 60 (12), 3239-3246 (2000).</li>
<li>Vremec, D., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+purification+of+large+numbers+of+antigen+presenting+dendritic+cells+from+mouse+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen.</a> Methods Mol Biol. 960, 327-350 (2013).</li>
<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li>
<li>Reeves, J. P., Reeves, P. A. Unit 1.9, Removal of lymphoid organs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReeves%2C+JP+%22Curr+Protoc+Immunol%22">Curr Protoc Immunol</a>. , (2001).</li>
<li>Strober, W. Appendix 3B, Trypan blue exclusion test of cell viability. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStrober%2C+W+%22Curr+Protoc+Immunol%22">Curr Protoc Immunol</a>. , (2001).</li>
<li>Vremec, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+dendritic+cell+viability+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Maintaining dendritic cell viability in culture.</a> Mol Immunol. 63 (2), 264-267 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Dendritik hücrelerin T hücre yanıtlarının prime dahil sunan hücreler büyük profesyonel antijen olarak kabul edilmektedir. Onların ana fonksiyonu T hücrelerine sunum için antijenleri alarak ve işleyerek doku mikro incelemektir. Belirli DC alt gruplarının işlevini incelemek için, bu normal fenotip ve fonksiyonlarını koruyan bir yaklaşım kullanarak yeterli sayıda izole edilmesi gerekir. Çoğu protokolleri naif farelerin spesifik DC alt kümesi izolasyonu güveniyor. Bu hücreler az olduğu için, izolasyon prosedürleri verimli d...

&quot;Büyük yıldızsı (Yunan dendron) hücre&quot; lenfoid organlara 1 bulunduğu gibi dendritik hücreler (DC) neredeyse kırk yıl önce keşfedildi. Birçok çalışma, DH&#39;ler etkili naif T hücreleri, 2 stimüle tek antijen sunan hücreler olduğunu göstermiştir. Bu hücrelerin önemli bir fonksiyonu, antijen molekülleri üzerine alımı ve antijenlerin sunumu ve verimli işlem ve bunların yüklenmesidir. fare dalağı içinde DH&#39;ler plazmasitoid geleneksel alt-grup halinde ayrılabilir. plazmasitoid DH&#39;ler CD11c düşük ekspresyon ve B220 ve GR-1&#39;in yüksek düzeyleri ile karakterize edilir. Onlar da yüzey işaretleyici mPDCA1 için pozitif ve reseptör 9 (TLR9) ligandların gibi ücretli cevaben interferon türü salgılar. Geleneksel DH&#39;ler CD11c ve MHC sınıf II ekspresyonu için yüksektir. Bunlar, CD4, CD8α, DEC205, CD fenotipik işaretleyiciler yüzey ekspresyonu göre üç farklı alt-grup halinde ayrılabilen11b ve (33D1 antikoru tarafından tanınan DCIR2) dendritik hücre inhibitör reseptör 2 proteinleri 3,4. CD8α Pos DH&#39;ler da CDC1 olarak bilinir, bu tür CD11b ve 33D1 olarak miyeloid belirteçler için DEC205 için olumlu, ama olumsuzdur. Ayrıca Cdc2 denilen CD8α Neg DC&#39;ler, 33D1, CD11b ve CD4 pozitif ama DEC205 yoksundur. Çift negatif alt kümesi (CD4 ve CD8α hem yani negatif) nadirdir ve DEC205 ve 33D1 için negatiftir. Bu en karakterize alt kümesi ve CD8α Neg DC daha az farklılaşmış formu olabilir. Çeşitli DC alt gruplarında Fenotipik farklılıklar da in vivo fonksiyonları uzanır. CD8α Neg DH&#39;ler yüksek fagositik ve esas olarak CD4 T hücrelerinin 3 MHC sınıf II ile ekzojen antijen mevcut olduğu düşünülmektedir. Bunun aksine, CD8α Pos DH&#39;ler MHC sınıf I çözünür protein antijeni için özel olanbir mekanizma çapraz sunum denir. Çapraz sunum sonucu bu DCler 5 aktivasyon durumuna bağlıdır, ve sitotoksik T hücrelerinin (CTL&#39;ler) veya düzenleyici T hücrelerinin 6 2,7 gelişimi genişlemesine neden olabilir ya da. Enfekte apoptotik hücrelerinden türetilen antijen sunumu kuvvetli bir CTL karşılığı 9 indükler ise, büyük ölçüde T-hücreleri, 8 silme anti-DEC205-antikor-aracılı teslim sonuçları kullanılarak CD8α Sıra DH&#39;lere antijenin hedefleme. Peptit antijenlerinin tanınması ek olarak, bir memeli bağışıklık sistemi lipid ve glikolipit antijenler tanımak gelişmiştir. Bu antijenler, çeşitli memelilerdeki çok benzer formlarda mevcut MHC sınıf I-benzeri hücre yüzeyi proteinleridir CD1 molekülleri tarafından sunulmaktadır. Farelerde, CD1d adlandırılan yüksek derecede korunmuş CD1 molekülünün tek tip glikolipit antijenler 10 sunumundan sorumludur. büyük<html> CD1d / glikolipid kompleksleri tanıyan T hücre popülasyonu değişmeyen NKT hücreleri (iNKT hücre) adı verilir. Bu hücreler, çeşitlilik 11 sınırlı TCRβ zincirleri ile eşleştirilmiş bir değişmeyen TCRα zinciri oluşan bir yarı-değişmez T hücresi reseptörü (TCR) ifade etmektedir. Çoğalmak ve aktive efektör T hücreleri olmak için ayırt etmek gerekir geleneksel T hücrelerinin aksine, iNKT hücreleri efektör nüfus olarak var ve glikolipid idaresi 12 sonra hızla yanıt başlar. fizyolojik olarak uygun yağ antigen sunan hücrelerin tanımlanması, aktif bir araştırma alanıdır ve bu tip B hücreleri, makrofajlar ve DCler olarak birkaç farklı hücre tipleri bu işlemi gerçekleştirmek için önerilmiştir. Bununla birlikte, DC&#39;lerin CD8α Pos grubu fare iNKT hücreleri 13 ve CD8 T hücreleri 14 glikolipid aracılı çapraz astarlama alımını ve lipid antijenlerin sunumu aracılık birincil hücre olduğu gösterilmiştir. farklı antijen sunan hücreler tarafından antijen oluşumunun verimliliğini karşılaştırmak için,&gt; &quot;ove_content, basit bir yaklaşım, bu tür hücre transfer deneyleri genellikle immünolojik çalışmalar yapılmaktadır naif ana Antigenin eşdeğer miktarlarda ile doldurulan. saflaştınlmış APC &#39;lerin farklı transfer etmektir. bu hücreler, toplam hücrelerin 15% 2&#39;sinden azını oluşturan lenfoid organlarda olduğu gibi nadir nüfusu var çünkü Ancak, ex vivo antijen tedavi DC&#39;ler transfer çalışmalarını gerçekleştirirken, zordur. donör hayvanlarda bu hücrelerin gelişimini arttırmak için bu nedenle gereklidir izole etme protokolleri şu etkinliğini geliştirmek için. Bilindiği gibi, PDC, CD8 Pos ve CD8 Neg DC alt kümeleri, ekspres fms bağlantılı reseptör tirosin kinaz 3 (Flt-3) oluşturulması için gerekli olan genel lenfoid ve ortak miyeloid progenitör. In vivo FLT-3 ligandı üzerine (Flt-3L) uygulama, emigratFlt-3, kemik iliği projenitör hücrelerin eksprese iyon periferal lemfoid organlarının artan tohum ve olgun DC döl 16 genişlemesi ile sonuçlanır artar. Flt-3 ifadesi B, T ve NK hücre farklılaşması yollara işlenmesi sırasında kaybolur. Bu nedenle, çok az değişiklikler Flt-3L uygulanması üzerine bu hücrelerde görülmektedir. DC popülasyonları benzer genişletme Flt-3L 17,18 sürekli sistemik düzeylerde temin edilmesi için basit ve ekonomik bir yöntem sağlar murin Flt-3L, salgılayan bir B16-melanom hücre hattı implantasyonu ile oluşturulan tümörleri taşıyan farelerde gözlenmiştir. Bu yaklaşımı kullanarak, bu şekilde büyük ölçüde daha sonraki deneyler için izole edilebilir, bu hücrelerin verimlerini büyük ölçüde artırmak, fare dalağı içinde normal DC alt-genişlemesini uyarmak için Flt-3L salgılayan B16 melanom hücreleri implantasyonundan göre bir protokol geliştirilmiştir . 14 gün deri altı im aşağıdaki - Biz sürekli 10 içinde bulmaktoplam dalak hücrelerinin% 60 - Flt-3 salgılayan tümör ekimi, fareler 40 oluşturacak DH&#39;lerin belirgin zenginleşme ile splenomegali gelişebilir. Bu dalaklarından farklı DC alt-gruplar yüksek saflıkta Standard Bu alt-spesifik fenotipik işaretleyiciler kullanan ticari olarak temin edilebilen hücre saflaştırma kitleri kullanılarak izole edilebilir.

<table><tbody><tr><td>% 0.05 Tripsin-EDTA&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri, Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDS019936-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz D&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (kuru toz)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>200 geçirmez etanol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9-6705-004-220</td> L-glutamin içeren <td>%70 etanol</td></tr><tr><td>RBC lizis tamponu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 ortamı</td> hazırlamak için kullanılır;<td>Yaşam Teknolojileri, Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin içeren DMEM ortamı&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri, Gibco</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-glutamin&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM esansiyel olmayan amino asitler&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri, Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>MEM esansiyel amino asitleri&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11130-051&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri, Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Yaşam Teknolojileri, Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS Ca2 + ve Mg2 + serbest pH 7.2)</td> <td>Yaşam Teknolojileri, Invitrogen</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (Ca2+ ve Mg2+) ile DPBS</td><td>, Life Technologies, Gibco</td><td>14040-182</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Etilendiamintetraasetat (EDTA) çözeltisi&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11050&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin/streptomisin&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri, Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi (kuru toz)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146-5G&nbsp;</td><td>PBS ile %0.08 hazırlayın</td></tr><tr><td>Plazmasitoid Dendritik Hücre İzolasyon Kiti II, fare</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-092-786</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD11c ve nbsp ile konjuge manyetik boncuklar;</td><td>Miltenyi Biyoteknoloji</td><td>130-152-001</td><td></td></tr><tr><td>CD8 ve alfa; Pos fare DC izolasyon kiti&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-169</td><td></td></tr><tr><td>Fc-gama reseptörü bloke edici antikor (Klon 2.4G2)</td> <td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD11c-FITC&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD8&alpha;-PerCP&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553036</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare B220-PE&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553090</td><td></td></tr><tr><td>1 ml şırıngalar&nbsp;</td><td>BD</td><td>26048</td><td></td></tr><tr><td>23 G1 iğne&nbsp;</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri kapları&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi aletler&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>INSMOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeci (70 & mikro; m)</td> <td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Büyük Petri plakaları&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Vakum filtrasyon sistemi (500 ml (0.22 & mikro; m))Corning</td><td></td> <td>431097</td><td></td></tr><tr><td>LS kolonları&nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik stand MACS ayırıcı ve nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Geniş çaplı 200 & mu; l Pipet Uçları&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>111623</td><td></td></tr><tr><td>Corning ultra düşük ataşman 96 oyuklu plakalar&nbsp;</td><td>Corning</td><td>CLS3474-24EA</td><td></td></tr><tr><td>6-8 haftalık dişi C57BL / 6 fare&nbsp;</td><td>Jackson Araştırma Laboratuvarları, Mach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>et al., 2000</td><td></td><güçlü>serum serbest DMEM ve RPMI ortamı</güçlü> 500 ml L-glutamin ile DMEM veya L-glutamin 5 ml MEM ile 500 ml RPMI-1640 tarafından tanımlanan melanom hücre hattı <td></td><td></td></tr><tr><td>esansiyel olmayan amino asitler (100x, 10&nbsp; mM) 5 ml HEPES Tamponu (1 M) 5 ml L-glutamin (200&nbsp; mM) 0,5 ml 2-merkaptoetanol (5,5 x 10-2 M)</td><td></td><td></td><td>Tüm malzemeleri bir biyogüvenlik kabininde ihtiyacınıza bağlı olarak DMEM veya RPMI ortamı ile karıştırın. Filtre, ortamı 0.22 & mikrodan geçirerek sterilize eder; M vakum filtrasyon sistemi.</td></tr><tr><td>< güçlü > komple RPMI ve DMEM ortamı< / güçlü ></td><td></td><td></td> <td>Tam ortam elde etmek için serum serbest RPMI veya DMEM ortamına 50 ml ısıyla inaktive edilmiş fetal buzağı serumu ekleyin.</td></tr><tr><td>MACS tamponu</td><td></td><td></td> <td>500 ml Fosfat tamponlu salin (PBS, Ca 2 + ve Mg 2 + Free, pH 7.2) ve 2&nbsp; &mikro; g/ml 2.4G2 (Fc-Blok antikoru).</td></tr><tr><td>< güçlü > FACS boyama tamponu< / güçlü ></td><td></td><td></td> <td>FACS boyama tamponu elde etmek için sodyum azidi MACS tamponunda %0.05'e (500 ml başına 0.25 g) çözün</td></tr><tr><td><güçlü>10x Kollajenaz D ve DNaz 1 stok çözeltisi< / güçlü> 
1 g kollajenaz D ve 0.2 ml DNaz 1 stoğu (1 mg / ml, 100x) Ca 2 + ve Mg 2 + içeren 20 ml PBS içinde çözün ve yaklaşık 1.000-2.000 Birim kollajenaz aktivitesine sahip bir çözelti elde edin.</td><td></td><td></td><td>Bu 10x stok çözümü önceden hazırlanabilir ve -20 °C'de saklanabilir; Birkaç hafta boyunca C. Kullanmadan hemen önce bunun 1 ml'sini 9 ml serumsuz RPMI ile seyreltin.</td></tr></tbody></table>

fare dendritik hücre alt grupları İzolasyonunda bir verimli ve yüksek verim yöntem

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritik hücreler (DC), elde etme işlemi ve T-hücresi-aracılı bağışıklık başlatma molekülleri antijen antijenler sunmak için başta sorumlu profesyonel antijen sunan hücrelerdir. Dendritik hücreler çeşitli fenotipik ve fonksiyonel heterojen alt kümeleri ayrılabilir. Dalak dendritik hücrelerin üç önemli alt grupları, CD8α Pos ve CD8α Neg hücreleri plasmasitoid vardır. plazmasitoid DCler tip I interferon doğal üreticileri ve anti-viral T hücre bağışıklık için önemlidir. CD8α Neg DC alt MHC sınıf II antijen sunumu için özel olan ve merkezi bir CD4 T hücrelerini priming yer almaktadır. CD8α Pos DH&#39;ler eksojen antijenler ve CD8 T hücresi priming çapraz sunumu için öncelikle sorumludur. CD8α Pos DC&#39;ler özel bir T cel için CD1d moleküller glycolipid antijenlerin sunumu en verimli olduğu ortaya konmuşturdeğişmeyen doğal öldürücü T (iNKT) hücreleri olarak bilinen l nüfus. FLT-3 ligand uygulanması sonuçta murin modellerinde periferal lemfoid organlarda, dendritik hücrelerin genişlemesi ile sonuçlanır kemik iliğinden dendritik hücre progenitörlerinin göç sıklığını artırmaktadır. Farklı DC alt gruplarının in vivo yeterliliğini karşılaştırma hücre transferi deneylerinde kullanılmak için fonksiyonel dendritik hücrelerin çok sayıda saflaştırmak için bu model adapte edilmiştir.

Bu prosedürün sonucu implante melanoma hücreleri tarafından ifade fare Flt-3L DC alt kümeleri genişletilmesi dayanmaktadır. B16.Flt3L tümör C57BL / 6 fareden türetildi ve red nedeniyle tesis haline tümörün başarısızlığı önlemek için bu suş kökenli, hayvanlara implante edilmiş olmalıdır. Bazı durumlarda, yollar veya ilgi reseptörleri sinyal bilinen kusurları ile DC&#39;ler elde etmek için genetik olarak modifiye edilmiş fareler kullanmak arzu edilebilir. Tümör gibi hayvanlarda farklı kine...

Farklı dendritik hücre alt kümeleri, lenfoid organlarda nadir popülasyonlar olarak bulunur ve bu nedenle immünolojik deneyler için yeterli sayıda ve saflıkta izole edilmesi zordur. Burada, fare splenik dendritik hücrelerinin şu anda bilinen tüm ana alt kümelerinin izolasyonu için yüksek verimli, yüksek verimli bir yöntem açıklıyoruz.

Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Bu protokolün genel amacı, dendritik hücre veya DC'ler üretmek için yüksek verimli, yüksek verimli bir yöntem geliştirmektir, bu da onların in vivo fenotipik ve fonksiyonel farklılıklarını kader olarak yansıtır. Dendritik hücreler, lenfoid organlarda büyük popülasyonlar olarak bulunur. Bu nedenle, bu izolasyonu kolaylaştırmak için donör dokulardaki bu temel hücrelerin sıklığını artırmak için filtre ligandı kullanıyoruz.Bu tekniğin ana avantajı, yalnızca ticari olarak mevcut ajanları kullanarak analiz için tüm DC alt kümelerinin uygun sayılarda oluşturulmasını kaldırmasıdır. %90 birleşik kültürden B16 melanom hücrelerini eksprese eden flt-3 ligandını hasat etmek için, önce hücreleri PBS ile yıkayın ve kültürü 37 santigrat derecede %05 tripsin ile inkübe edin. 5 dakika sonra, proteaz aktivitesini 20 mililitre 4 santigrat derece tam dima ortamı ile söndürün ve yapışan hücre modeli katmanını hafif vurma ve hafif pipetleme ile ayırın.Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve sayın. Daha sonra, tek hücreli süspansiyonu, C57 siyah 6 alıcı farelere deri altı enjeksiyonu için PBS'de mililitre başına 8 hücre konsantrasyonuna 1 kez yeniden askıya alın. Tümörün çapı iki ila on mililitreye ulaştığında, dalakları tümör taşıyan hayvanlardan toplayın ve dalakları taze RPMI ortamı içeren bir petri kabına yerleştirin.Bir neşter kullanarak, dokuları 0.2 santimetre karelik parçalar halinde kesin ve daha sonra parçaları on mililitre kollajenaz ve 37 santigrat derecede Dnase içinde inkübe edin. 30 dakika sonra, kısmen sindirilmiş doku bulamacını 70 mikronluk bir hücre süzgecine dökün ve kalan doku parçalarını süzgecin ağından geçirmek için beş mililitrelik bir şırınga pistonu kullanın. Filtreyi 10 mililitre taze ortamla durulayın, yıkamayı tek hücreli süspansiyonun geri kalanıyla birleştirin ve hücreleri topaklayın.Hücre peletini 2 mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponunda oda sıcaklığında 10 dakika süreyle askıya alıyoruz. Daha sonra hücreleri 10 mililitre taze RPMI ortamında yıkayın ve FC bloğu içeren hücre sıralama tamponunda mililitrede 1 kez 10 ila 8 hücre arasında yeniden süspanse edin. Plazma sitod DC'lerini izole etmek için, bir plazma sitot DC izolasyon kitinden 300 mikrolitre biyotin etiketli antikor kokteylini 200 mikrolitre splenik tek hücreli süspansiyon ile iyice karıştırın.Hücreleri 15 dakika boyunca buzlu su banyosuna yerleştirin ve her üç dakikada bir hafifçe vurun. Daha sonra hücreleri 12 mililitre hücre sıralama tamponu ile yıkayın ve peleti 500 mikrolitre taze sıralama tamponunda tekrar süspanse edin. Daha sonra, hücreleri 300 mikrolitre anti-biyotin, antikor konjuge boncuklar içinde buzlu suda 15 dakika daha düzenli olarak dokunarak inkübe edin.Hücreleri yeni ayırma tamponunda yıkadıktan sonra, paleti 2 mililitre hücre ayırma tamponunda yeniden askıya alın ve uygun boyutta bir manyetik sütunu karşılık gelen mıknatısına yükleyin. Sütunu beş mililitre taze 4 santigrat derece hücre sıralama tamponu ile dengeleyin. Tamponun tamamı kolonun üstünden boşaldığında, hücreleri dikkatlice kolon kafasının yüzeyinin ortasına ekleyin ve akışı toplayın.Daha sonra sütunu 10 mililitre taze, 4 santigrat derece ayırma tamponu ile yıkayın ve akışı aynı tüpte toplayın. İkinci bir manyetik kolondan geçtikten sonra,% 94'ten daha büyük bir saflığa sahip bir plazma sitod dendritik hücre popülasyonu beklenebilir. CD8aplha + ve CD8alpha-DC'leri izole etmek için, splenik hücre süspansiyonunun geri kalanını, az önce gösterildiği gibi, buz üzerinde 15 dakika boyunca bir CD8alpha + dendritik hücre izolasyon kitinden 100 mikrolitre biotion konjuge antikor kokteyli ile karıştırın.İnkübasyonun sonunda, hücreleri 12 mililitre 4 santigrat derece hücre ayırma tamponunda yıkayın ve peleti 150 mikrolitre taze 4 santigrat derece hücre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri 100 mikrolitre CD8alpha + dendritik hücre izolasyon kiti anti-biyotin boncukları ile karıştırın. Hafifçe vurarak buz üzerinde 15 dakika sonra, hücreleri 10 mililitre 4 santigrat derece hücre sıralama tamponunda yıkayın ve peleti 1 mililitre taze 4 santigrat derece ayırma tamponunda yeniden süspanse edin.İnkübasyonun sonunda, hücreleri, az önce gösterildiği gibi, akışı ve ilk yıkamayı toplayarak manyetik boncuk ayrımına göre sıralayın. Daha sonra, hücreleri döndürün ve peleti bir mililitre taze 4 santigrat derece hücre ayırma tamponunda yeniden askıya alın. Şimdi hücreleri kitten 200 mikrolitre anti-CD8aplha konjuge manyetik boncuklarla etiketleyin ve hücreleri CD8alfa-dendritik hücre akışını toplayarak yeni bir sütundan geçirin.CD8alpha + DC'leri toplamak için, sütunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve sütundan 5 mililitre taze 4 santigrat derece hücre sıralama tamponu daldırın. Hücreler ikinci bir sütundan geçirildikten sonra,% 96'dan daha büyük bir CD8alfa + dendritik hücre popülasyonu beklenebilir. CD8alfa hücrelerini izole etmek için, CD8alfa akış hücresi süspansiyonunu döndürün.Daha sonra hücreleri 100 mikrolitre anti-CD11 c-manyetik boncuklarla etiketleyin ve %97'den daha büyük bir CD8alfa-dendritik hücre alt kümesi popülasyonu elde etmek için az önce gösterildiği gibi manyetik boncuk pozitif hücre popülasyonunu toplayın. Son olarak, tripan mavisi dışlaması ile canlı hücrelerin sayısını belirleyin. Tümör palpe edilebilir hale geldiğinde, B16 flt-3 ligand tümörü taşıyan fareler, splenik dendritik hücre alt kümelerinin genişlemesi ile ilişkili olan splenik hücresellikte sürekli olarak dramatik bir artış gösterir.İlginç bir şekilde, bu hayvanlarda konvansiyonel DC'ler için mutlak hücre sayılarında 15 ila 20 kat artış gözlenirken, plazma sitot DC alt kümesi için sadece yaklaşık 4 kat artış gözlenir. Farklı dendritik hücre alt kümeleri B220, CD11b, CD11c ve CD8alfa ekspresyonlarına göre karakterize edilir. Hücre popülasyonları ayrıca başka benzersiz alt küme belirteçleri de sergiler, bununla birlikte, mPDCA1 yalnızca plazma sitod DC'leri üzerinde eksprese edilir, DEC205 CD8alpa + DC'lerde yüksek oranda eksprese edilir ve CD11b ve 33D1, CD8alpha-DC'lerde en belirgin şekilde tespit edilir.Bu yöntemi kullanarak, CD8alpa+DC'lerin, değişmez NKT hücreleri olarak bilinen özelleşmiş bir T hücresi popülasyonuna CD bağlama molekülleri tarafından antijenlerin sunumunda en verimli olduğunu gösterdik. DC izolasyonunun en kritik özelliği, sıkı sterilite ve antidoksan içermeyen koşulları korumaktır. Prosedürler sırasında, bu T hücreleri antidoksana oldukça duyarlıdır.Bu prosedürü denerken, tekrarlanan mekanik stimülasyon dendtritik hücrelerin olgunlaşma durumunu değiştirebileceğinden, hücreleri nazikçe tutmayı hatırlamak önemlidir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, tüm ana DC alt kümelerinin yüksek bir kısmını tek dalaktan izole etmek için kullanılabilir. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.

an-efficient-high-yield-method-for-isolation-mouse-dendritic-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Miltenyi MAC kiti kullanılarak lenfositlerin İzolasyon tüm lenfoid doku homojenatlarında hücreleri arındırmak için güvenilir bir yol. Miltenyi sistemini kullanarak saflaştırılmış Hücreler genellikle ≥% 96 saf. Burada, CD4 + T hücreleri, Miltenyi tarafından sunulan birçok kitleri biri izole etmek için atılan adımları göstermektedir.

CD4 İzolasyon Miltenyi MACS Arıtma Fare lenf düğümleri + T hücreleri

Fare akciğer dendritik hücreler yüksek oranda saflaştırılmış açıklanmıştır. Özgül ağırlık, geleneksel dendritik hücre alt izolasyon verilir.

Fare Akciğer Dendritik Hücrelerinin İzolasyonu

Burada, fare intestinal dendritik hücrelerinin (DC'ler) ve makrofajların hızlı izolasyonu için bir metodolojiyi detaylandırıyoruz. İntestinal DC'lerin ve makrofajların fenotipik karakterizasyonu çok renkli akış sitometrik analiz kullanılarak gerçekleştirilirken, fonksiyonel çalışmalar için yüksek saflıkta popülasyonlar elde etmek amacıyla manyetik boncuk zenginleştirmesi ve ardından hücre ayıklama yöntemi kullanılır.

Fare Barsak ayrı dendritik hücreler ve makrofajlar İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Bu videoda, yetişkin bir farenin kemik iliğinden dendritik hücrelerin (T hücrelerini aktive eden anahtar antijen sunan hücreler) üretilmesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücreler Üretimi: Fare Kemik İliğinden Dendritik Hücreler Üretme Yöntemi

Bu videoda, yüksek tuzla işlenmiş antijen sunan dendritik hücrelerin (DC'ler) farelere evlat edinerek transferi için bir prosedür gösterilmektedir. Murin CD11c + dendritik hücreleri (DC'ler), hücrelerde izolevuglandin (IsoLG) -protein eklentileri oluşturan yüksek miktarda sodyum içeren bir ortama maruz bırakılır. Bu eklentiler neoantijenler olarak işlev görür ve DC'lerin yüzeyinde sunulur. Yüksek tuzla muamele edilmiş hücreler, evlat edinici hücre transferi yoluyla farelere enjekte edilir.

Dendritik Hücrelerin Yüksek Tuz Tedavisi ve Farelere Evlat Edinme Transferi için Bir Yöntem

Bu protokol, antijen yoğunluğuna tek bir hücre süspansiyonu santrifüj ve ilgi hücre popülasyonlarının son olarak manyetik ve / veya FACS ayıklama, ardından doku enzimatik sindirimi farklı adımları ile insan timus hücreleri sunan izole etmek için bir yöntem göstermektedir.

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

Biz burada yalıtmak ve phenotypical ve fonksiyonel özellikleri değerlendirilmesi için insan kadın üreme sistemi içinde farklı anatomik bölmeleri dendritik hücrelerden arındırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem diğer bağışıklık hücreleri veya diğer Mukozal doku dendritik hücrelerden yalıtmak için adapte edilebilir.

İnsan dişi üreme yolu dendritik hücreler yalıtım Phenotypical ve fonksiyonel çalışmaları için

Monosit kaynaklı DC (MoDC) tehlike ilişkili molekülleri küçük miktarlarda hissi olabilir ve bu nedenle kolayca astarlanmalıdır. MoDC yalıtım kan ve tümörleri ve onların harekete geçirmek bağışıklık kompleksleri ile onların erken harekete geçirmek önlemek için düşünülmesi gereken önemli önlemler vurgulayarak süre için detaylı bir protokol sağlar.

Yalıtım Protokolü fare monosit kaynaklı dendritik hücreler ve onların sonraki Vitro harekete geçirmek ile tümör bağışıklık kompleksleri

Burada, geliştirmek ve tolerogenic dendritik hücreler (TolDCs) karakterize ve onların immunotherapeutic yardımcı programı değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Geliştirme ve işlevsel fare Tolerogenic dendritik hücrelerin karakterizasyonu

Burada, manyetik hücre sıralama ve içine saf fareler sonraki evlat edinen transfer tarafından fare dalağı dendritik hücreleri izole etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yüksek tuz aktif dendritik hücre modeli evlat edinen transfer ve Akış Sitometresi adım adım yordamlar açıklamak için seçildi.

Yalıtım ve yüksek tuz evlat edinen Transfer dendritik hücreler antijen sunan tedavi

Burada, 10 ng / mL GM-CSF / IL-4 ile 7 günlük kültürden sonra farelerden yüksek saflıkta kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri izole etmek ve üretmek için ekonomik ve etkili bir yöntem sunuyoruz.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Farelerden İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi için Ekonomik ve Verimli Protokol

Öğrenin, fare dalak dendritik hücre alt gruplarını Flt-3 ligandı ile genişleterek manyetik boncuk ayrımıyla izole etme yöntemini. Yüksek saflıkta ve verimde hücre elde edin.

Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

Daha fazla video keşfet