Name: Geliştirme ve işlevsel fare Tolerogenic dendritik hücrelerin karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Öğrenin fare tibias ve femur kemiklerinden tolerejenik dendritik hücre geliştirme ve karakterizasyon yöntemini. Bu standart protokol otoimmün hastalıklar için hücresel immünoterapi araştırmalarında tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Tekrar ilaç CDDO DFPA verdiğiniz için teşekkür ederiz. Ayrıca Jane ve Lee Seidman sandalye Pediatrik kanser yenilik (John Letterio) desteğiyle anıyoruz. Bu eser Savunma Bakanlığı tarafından [W81XWH-12-1-0452]; desteklenmiştir Angie Fowler ergen ve Genç Yetişkin kanser araştırma girişimiyle durumda kapsamlı Kanser Merkezi; ve FJ Callahan temelden Hsi-Ju Wei Callahan mezunu Scholar Ödülü.

Case Western Reserve Üniversitesi Tıp Fakültesi'nın kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış yordamlar ile uyumlu tüm çalışmaları yapıldı.
1. dendritik hücreler (BMDCs) kemik iliği türevi hazırlayın
<ol><li>Isıyla üzerinden tüm cerrahi aletler sterilize ve sınıf II biyolojik Emanet yürüttüğü güvenlik prosedürleri ile kabine deneme gerçekleştirin.</li>
	<li>C57BL/6 fareler CO2 odası kullanarak 8-10 hafta-in yaş ötenazi. Parçalanmış bir tahta üzerine fareyi getirin ve % 70 etanol ile durulayın. Cerrahi makas kullanarak Tibia-fibula ve uyluk kemikleri tüketim ve ile % 70 etanol 10 cm kültür tabağına koyun.</li>
	<li>Cerrahi bıçaklar ve forseps uzak doku incelemek için kullanın 10 cm kapağındaki mümkün olduğunca kültür çanak ve izole yırtılmalarıteşhis ve uyluk ile % 70 etanol 6 cm kültür tabağına koyun.</li>
	<li>Her iki ucunda da yırtılmalarıteşhis ve uyluk kırpmaya cerrahi bıçaklar kullanın. 3 mL PBS 3 ml şırınga 23 G iğne ile kemik iliği içeriğini kemik bir ucundan 12 ml PBS içeren bir konik tüp floş için kullanın. Bu adım 3 x her kemik için tekrarlamak.</li>
	<li>300 x g 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet kırmızı kan hücreleri kaldırmak 5 dakika için 1 ml ACK lysing tampon ile resuspend.</li>
	<li>9 ml ACK lysing tampon ve 5 dakika için 300 x g, santrifüj sulandırmak için PBS ekleyin.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve 10 ml kültür orta (RPMI-1640 artı L-glutamine, %10 FBS, % 1 esansiyel olmayan amino asit (100 x), 10 mM HEPES, 50 nM β-mercaptoethanol ve % 5 penisilin/streptomisin) ile resuspend. Not: Endotoksin düzeyi daha az 0.1 EU/ml FBS içinde olmak zorunda.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 40 mikron hücre süzgeç aracılığıyla geçmek ve hücre süspansiyon, 20 µl alıp trypan canlı hücreleri sitometresi kullanarak saymak için mavi 80 µl ile karıştırın.</li>
	<li>1 x 106 hücre/ml 15 ng/ml GM-CSF ve 10 ng/ml Il-4 ile cep numarasını ayarlayın.</li>
	<li>3 ml 1 x 106 hücre/ml her iyi 6-şey plaka plaka ve 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem CO2 kuluçka hücreleri kuluçkaya. Not: Bir fare kemik iliği hücrelerinden olduğunu çevresinde 3-5 x 107 hücreleri, bu 2 ila 3 6-şey plakaları için yerleştirilebilir gösteren.</li>
	<li>Günde 3, tüm 3 ml kültür orta her kuyudan çıkarmak her kuyuda 2 ml taze PBS ekleyin ve sonra yavaşça yapışık olmayan hücreleri kaldırma sağlamak için plaka girdap.</li>
	<li>15 ng/ml GM-CSF ve 10 ng/ml Il-4 her iyi 3 ml taze kültür orta yerine. 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem CO2 kuluçka hücreleri kuluçkaya.</li>
	<li>5 günde, doğrudan başka bir 3 ml taze kültür ortamına 15 ng/ml GM-CSF ve 10 ng/ml Il-4 ile her kuyuya ekleyin. 37 ° C, % 5 CO2, ve % 95 nem CO2 kuluçka hücreleri kuluçkaya. Not: Toplam her iyi şimdi 6 ml birimdir.</li>
	<li>7 günde 10 dakika için buz üzerinde tüm plaka koymak. Hafifçe gevşek-yapışık BMDCs iDCs süspansiyon çıkarmak için her şey kültür ortamında pipette. Not: Yapisan makrofajlar hala plakasına eklenir. Düşük sıcaklık ve yavaşça yordamlar deneyler daha da etkilemeye DC etkinleştirme önlemek için anahtarıdır.</li>
	<li>300 x g 5 dakika için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi ve daha fazla deneyler için taze kültür orta ile resuspend. Not: BMDCs floresan etiketli CD11c antikor ile akış sitometresi tarafından tespit edilebilir ve Şekil 1' de BMDCs bizim perdeleme strateji daha fazla deneyler için gösterdi.</li>
</ol>2. TolDC gen ve Protein profil karakterize
<ol><li>2 ml 1 x 106 BMDCs/ml 6 iyi-plaka bir kuyu başına 1 h 37 ° C, % 5 CO2 ve % 95 nem CO2 Kuluçka kuluçka için 100-400 nM CDDO-DFPA içinde kültür orta ile plaka. Not: CDDO-DFPA, sentetik bir triterpenoid 2 faktör (Nrf2) uyarıcı ve nükleer faktör-κB (NF-κB) inhibitörü - gibi - nükleer faktör (2 erythroid elde edilen) değil. İDCs IL-10, D3 vitamini, deksametazon veya BAY 11-7085, gibi diğer maddeleri TolDCs indüksiyon için uygulamak ve bu adımı her aracısının en uygun bir durumuna değiştirebilirsiniz.</li>
	<li>10 veya 100 ng/ml LPS (kuluçka süresi nedeniyle mRNA veya protein ölçümü farklıdır) mDCs ikna etmek için 4-24 gönderilen kuluçka için ekleyin.</li>
	<li>Yavaşça her şey kültür ortamında pipette ve 1 ml pipet kullanarak hücre süspansiyon hasat. 300 x g hücreleri ve süpernatant, sırasıyla toplamak 5 dakika için de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Uyarıcı ligandlar gibi akış sitometresi tarafından yüzey ligandlar hücre topakları üzerinden analiz: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL veya inhibitör ligandlar: PD-L1, PD-L2, ILT3, ILT4.</li>
	<li>RNA hücre topakları üzerinden yalıtmak ve RNA ve süpernatant örnekleri için nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ve ELISA, sitokin profil ve gen ve protein düzeyleri sırasıyla çözümleyebilirsiniz. Not: için örnek, inflamatuar sitokinlerin: TNF-α, IFNγ, EDN-1, IL-6, IL-12 ve IL-23 veya anti-inflamatuar sitokinlerin: Il-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 ve HO-1.</li>
</ol>3. TolDCs fonksiyonun değerlendirildiği Vitro ve In Vivo
<ol><li>
T-hücre Syngeneic yayılması tahlil
	<ol>
<li>Isıyla üzerinden tüm cerrahi aletler sterilize ve sınıf II biyolojik Emanet yürüttüğü güvenlik prosedürleri ile kabine deneme gerçekleştirin.</li>
		<li>MAC'ler arabellek % 0.5 Sığır serum albumin (BSA) ve 2 mM EDTA 500 ml PBS kullanarak hazırlayın. Arabellek 0.2 µm filtreden süzerek sterilize. Not: aşağıdaki deneme sırasında arabellek buz üzerinde tutun.</li>
		<li>CD4 elde etmek için+ T hücreleri, CO2 odası kullanarak 8-10 hafta-in yaş OT-II T-hücre reseptör (TCR) transgenik fareler ötenazi. Parçalanmış bir tahta üzerine fareyi getirin ve % 70 etanol ile durulayın. Karın sol tarafındaki dalak cerrahi makas ve forseps kullanarak yalıtmak.</li>
		<li>2 ml PBS ile dalak bir 6 cm kültür tabak koyun ve bir 40 mikron hücre süzgeç geçirerek dalak bin dereden su getirmek için bas-3 ml şırınga parça arka kullanın.</li>
		<li>Hücre süspansiyon ve 5 dakika için 300 x g, santrifüj toplamak.</li>
		<li>Hücre Pelet MAC'ler arabellek 400 μl içinde resuspend.</li>
		<li>CD4 100 μl eklemek+ T hücre Biotin-antikor kokteyl 4° c 5 dakika için. Not: Antikor kokteyl CD4 dışındaki diğer hücre türleri üzerinde bağlar+ T hücreleri, CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R gibi (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC sınıf II, Ter-119 ve TCRγ/δ.</li>
		<li>MAC'ler arabelleği 300 μl ve anti-Biotin boncuk (Tablo reçetesi) 200 μl 4 ° C'de 10 dakika için ekleyin.</li>
		<li>Sütun oluşan yer ferromanyetik küre (Malzemeler tablo) ve ön ayırma alanını seçin ve MAC'ler arabellek 3 ml ile durulayın filtrede birlikte manyetik.</li>
		<li>MAC'ler arabelleği 9 ml hücreleri ve 300 x g, santrifüj 5 dakika için ekleyin.</li>
		<li>Hücre Pelet 3 ml MAC'ler arabellek resuspend ve sütun uygulayın. Toplamak akışı içeren CD4 aracılığıyla+ T hücreleri.</li>
		<li>Başka bir 3 ml MAC'ler arabelleği sütun yıkama ve aynı zamanda akış aracılığıyla toplamak.</li>
		<li>Dalak pan DCs elde etmek için CO2 odası kullanarak C57BL/6 fareler 8-10 hafta-in yaş ötenazi. Parçalanmış bir tahta üzerine fareyi getirin ve % 70 etanol ile durulayın. Karın sol tarafındaki dalak cerrahi makas ve forseps kullanarak yalıtmak. Dalak 2 ml collagenase D çözeltisi içeren bir 6 cm kültür tabak koyun (2 mg/ml collagenase D çözünmüş kalsiyum, magnezyum içeren HBSS).</li>
		<li>1 ml collagenase D çözeltisi dalak için iki kez 1 ml şırınga ve bir 25 G iğne ile enjekte. Dalak küçük parçalar halinde küçük makasla kesilmiş.</li>
		<li>Salla ve 25 dakika için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>0, 5 M EDTA 500 μl, oda sıcaklığında 5 dakika için ekleyin. Not: 3.1.13-3.1.14 adımlardan DCs verimini artırmak için kritik öneme sahiptir.</li>
		<li>Şimdi itmek-3 ml şırınga parça arka tarafından geçen 40 mikron hücre süzgeç dalak Bulamaç kıyma ve 300 x g 5 dakika için de centrifuging tarafından hücre süspansiyon toplamak için kullanın.</li>
		<li>Hücre Pelet MAC'ler arabellek, 50 μl FcR engelleme reaktif ve Pan dendritik hücre Biotin-antikor kokteyl, 100 μl 4 ° C'de 10 dakika için 350 μl resuspend. Not: Antikor DC'ler tarafından ifade değil antijenlere karşı kokteyl.</li>
		<li>Hücreleri 300 x g 5 dakika için de 9 ml MAC'ler arabellek ve santrifüj ekleyerek yıkayın.</li>
		<li>Hücre Pelet MAC'ler arabellek 800 μl içinde resuspend ve anti-Biotin boncuk 200 μl 4° C'de 10 dakika için ekleyin.</li>
		<li>DCs toplamak için 3.1.9-3.1.11 gelen adımları yineleyin.</li>
		<li>Başka bir 3 ml MAC'ler arabelleği sütun iki kez yıkama ve aynı zamanda akış aracılığıyla toplamak.</li>
		<li>2 x 105 DCs/ml 100-400 nM CDDO DFPA 37 ° c+ için 1 saatlik ayrı, etiket CD4 T hücreleri (1 x 107/ml) içinde cihaz 15 dakika süreyle 37 ° C'de 1 mikron CFSE ile tedavi, PBS ile yıkayın ve son konsantrasyonu 2 x 106 T hücre/ml almak için birimin yeniden ayarlayabilirsiniz.</li>
		<li>Daha sonra bir 96-şey tabak içinde tedavi dendritik hücreler 100 μl CFSE etiketli CD4 aynı hacmi ile ortak kültür+ T hücreleri,--dan belgili tanımlık yukarıda merdiven-1:10 almak için toplanan her ikisi de oranı. Şimdi 100 ng/mL ovalbumin (OVA) peptid 323-329 iyi ve ölçü CFSE yoğunluk akış sitometresi tarafından T hücrelerinin başına 2-3 gün sonra kuluçka ekleyin. Not: Hücre sayıları ve oranı DCs ve T hücreleri bizim önceki iş37optimize edilmiştir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pasif neden BMDCs enjekte edilerek EAE Geniş puls miyelin Oligodendrocyte glikoprotein (MOG) (35-55)
	<ol>
<li>2 ml 1 x 106 BMDCs/ml 6 iyi-plaka bir kuyu başına 1 saat kuluçka için 100-400 nM CDDO-DFPA içinde kültür orta ile plaka.</li>
		<li>10 ng/ml LPS 24 kuluçka için ekleyin gönderilen.</li>
		<li>100 μg/ml MOG (35-55) 4 kuluçka için ekleyin gönderilen.</li>
		<li>Hücre süspansiyon ve 5 dakika için 300 x g, santrifüj hasat.</li>
		<li>Hücre Pelet PBS ile resuspend ve hücreleri saymak.</li>
		<li>Subkutan 200 μl 8-10 hafta yaşlı kadın C57BL/6 farelere (her arka bacak içine 100 μl) 2 x 106 hücrelerinin enjekte et.</li>
		<li>BMDC enjeksiyon ve 48 gün gönderilen. daha sonra 200 enjekte ng boğmaca toksin (PTX) her fare.</li>
		<li>Adımları 3.2.6-3.2.7, 4 hafta boyunca haftada bir kez yineleyin.</li>
		<li>EAE klinik belirtileri günlük standart ölçütleri37 (0,5-topal kuyruk sonunda, 1-topal kuyruk, 2-orta arka bacak zayıflık, 3 şiddetli hind uzuv zayıflık, 4-tam hind felç, 5-kesici veya can çekişen devlet, 6-ölüm) kullanarak değerlendirmek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Bu kağıt için tekrarlanarak iDCs oluşturmak ve daha sonra onları TolDCs ayırt etmek için kullanılabilir verimli bir iletişim kuralı tanımlar ve önerdiğimiz bu TolDC ikna etmek için yeni moleküler hedef aracıları kapasitesini değerlendirmek için uygulanabilir fenotip. Bu raporda açıklanan, hangi biz ilk yüzey ligandlar TolDC ifade tarafından qRT-PCR ve ELISA tarafından ölçülen DC sitokin profil bir değerlendirmesini ve ardından akış sitometresi analiz bir sıra takip ettik. Son olarak, TolDCs immunoregulatory fonksiyonu T ...

Dendritik hücreler (DC) doğuştan gelen bağışıklık sisteminin ayrılmaz bir parçası olan ilk keşfetti ve Ralph Steinman ve Zanvil Cohn birincil profesyonel antijen sunan hücreler1olarak 1973 yılında ile karakterizedir. DCs T hücreleri ve B hücreleri MHC kompleksi (MHC) ile işlenmiş antijen ikincil lenfoid organlara içinde doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık sistemleri2bağlantı sunarak bağışıklık harekete geçirmek içinde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Memeli bağışıklık sisteminde miyeloid DCs ve plazmasitoid DCs (PDC)3açıklanan DC'lerin en az iki kategorisi vardır. Myeloid DCs, geleneksel DCs (KGK), CD11c ifade tarafından karakterize ve olgunlaşmamış DCs (iDCs) içinde vitro kemik iliği progenitör hücre veya kullanarak periferik kan monosit olarak farklı olarak da bilinir granülosit-makrofaj-koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ve Il-4 fare veya insan türler, sırasıyla4.
Sürücü moleküler desenleri (PAMP) patojen ilişkili veya moleküler desenleri (nem), hasar ilişkili öyle aynı derecede immunojenik DCs doğru iDCs olgunlaşma olgun DCs (mDCs) olarak çeşitli desen tanıma reseptörleri bağlama via 'tehlike' aktive, sinyalleri DC yüzey5. İmmunojenik DCs daha da prime saf T hücre çoğalması ve MHCII2, costimulatory ligandlar (CD80, CD86 ve CD40)6, sitokinler ve diğer çözünür arabulucu7upregulation aracılığıyla farklılaşma. Pro-inflamatuar arabulucu üretim immünojenik DCs gelen bir çağlayan sitokin aracılıklı T hücre farklılaşması için esastır. Örneğin, IL-12 ve IFN γ Th1 farklılaşma8 ve Il-1, için gerekli olan Il-6 ve IL-23 saf T hücre polarizasyon Th17 hücreleri9doğru için önemlidir. Her ne kadar olgun DCs yabancı antijenleri için tepki, kontrolsüz DC etkinleştirme tarafından öz-antijenleri tolerans ablasyon neden olabilir ve autoreactive T hücreleri olan harekete geçirmek10 doku yıkıma yol oluşturarak otoimmün hastalıklar gelişimi teşvik .
Son raporlar DC plastisite, yeteneklerini kendi doku microenvironment içinde farklı ipuçları ile etkileşim ve farklı efektör/bastırıcı DC alt kümeleri ayırt etmek için tarafından örneği açık kanıtlar sağlamıştır. IL-1011, TGF-β12ve HO-113 gibi anti-inflamatuar arabulucu tolerogenic DCs (TolDCs) inducing tarafından bağışıklık suppression içinde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Bu TolDCs düzenleyici işlevleri elde etmek ve T hücre proliferasyonu14bastırmak. Ayrıca, DC'ler tarafından ortak uyarım eksikliği ve anti-inflamatuar arabulucu TolDCs gelen üretim hem düzenleyici T hücreleri (Tregs) indüksiyon katkı ve aynı zamanda etkili Th1 ve Th17 farklılaşma ve genişleme15inhibe. İki yıl, TolDCs tedavi edici potansiyelini birkaç müfettişler tarafından bildirilmiştir. Bu çalışmalarda ex vivo yönetim sadece iyileştirmiştir TolDCs patolojik belirtiler otoimmün hastalıklar16 farklı preklinik modellerin oluşturulan ama aynı zamanda17 hastalarda immün tolerans gelişmesine yol açtı ,18. Otoimmün hastalıklar da dahil olmak üzere çeşitli klinik çalışmalarda 1 diyabet19, romatoid artrit20, türü için ilginç bir şekilde, bugün TolDCs terapi alternatif veya ek bir yaklaşım kabul edilmiştir 21, multipl skleroz (MS)22,23,24ve Crohn hastalığı25.
Çeşitli TolDCs geliştirmek için kullanılan iletişim kuralları vardır ve birkaç laboratuar yöntemleri üretimi ve TolDCs fenotipik karakterizasyonu için bildirdin. Bu yöntemler tekrarlanarak TolDCs vitro hematopoetik ataları oluşturmak ve stabil bir tolerogenic devlet vivo içinde26,27,28,29onları korumak için kullanılabilir. İDCs-ebilmek var olmak değiştirmek TolDCs çeşitli immunomodulatory farmakolojik ajanlar veya anti-inflamatuar sitokinlerin maruz. Örneğin, D3 vitamini IL-10 üretimi artırmak ve DCs gelen IL-12 salgılanması bastırmak ve böylece onların immünsüpresif işlevi30artırmak için bilinen bir iyi bilinen farmakolojik ajandır. DCs lipopolisakkaritler (LPS), gibi güçlü inflamatuar uyarıcılara maruz kaldığında Ayrıca, deksametazon31, rapamycin32ve kortikosteroidler33 gibi çeşitli farmakolojik ajanlar ikna etmek için gösterilmiştir CD40, CD80, CD86 ve MHCII34DC yüzey ifade azaltarak TolDC fenotip. IL-10 ve TGF-β DC tolerans35 ve eşlik eden maruz kalma bu sitokinler her ikisi de ikna etmek için en okudu anti-inflamatuar sitokinlerin tolerogenic fenotip DCs36içinde ikna etmek için göstermiştir vardır.
Yerine fenotipik işaretleri tarafından orada DC fonksiyonel özelliklere göre tanımlanır tolerogenic beri büyük bir TolDCs hücresel ve fonksiyonel karakterizasyonu için tutarlı bir yöntem geliştirmek zorundayız. Eğer biz etkili ve tekrarlanarak TolDC fenotip ikna etmek için yetenek yeni ajanların karşılaştırmak için Ayrıca, titiz ve tutarlı iletişim kuralı tutarlı değerlendirme ve tolerogenic DC fenotip karakterizasyonu için oluşturulmalıdır Laboratuvar. Burada ayrıntılı bir protokol ile adım adım yöntemler iDCs farelerin hematopoetik ataları gelen izole etmek ve daha sonra değerlendirme kapasitelerini TolDCs iDCs dönüştürmek için altında yeni ajanların etkinliğini çözümlemek için sağlam sağlayan sağlamak TolDCs fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu vitro ve içinde vivo. Bu açıklama TolDCs onların yüzey ligandlar, sitokin profil ve immünsupresif işlevleri vitrotarafından karakterize etmek için ayrıntılı bir yöntem içerir. Biz de bu TolDCs MS, deneysel otoimmun ensefalomiyelit (EAE), önceden klinik bir modeli potansiyel tedavi uygulanması keşfetmek için bir yöntem örneği sağlar. Bu oluşturulmuş protokol TolDCs indüksiyon teşvik için yeni acentalar kapasitesini değerlendirmek için Müfettişler yardımcı olacak ve TolDC terapötik geliştirme kapsamını genişletmek için çaba kolaylaştıracaktır.

<table><tbody><tr><td>CDDO-DFPA (RTA-408)</td><td>Reata Pharmaceuticals</td><td>ev sentezinde</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>Fare GM-CSF</td><td>Peprotech Inc.</td><td>315-03</td><td>BMDC farklılaşma</td></tr><tr><td>Fare IL-4</td><td>Peprotech Inc.</td><td>214-14</td><td>BMDC farklılaşması</td></tr><tr><td>Lipopolisakkaritler (LPS)</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>L2880</td><td>Hücre kültürü</td></tr> <tr><td>ve beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>516732</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>Boğmaca toksini (PTX)</td><td>Ar-Ge D sistemleri</td><td>3097</td><td>EAE indüksiyon</td></tr><tr><td>MOG (35&ndash; 55) peptit</td><td>21. yüzyıl Biyokimyasalları</td><td>ev sentezinde</td><td>EAE indüksiyonu</td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Gibco, Yaşam Teknolojileri</td><td>15250-061</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>RPMI-1640 artı L-glutamin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11875-093</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asit (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140050</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630080</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>penisilin/streptomisin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>40 &#956; m hücre süzgeci</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>Hücre izolasyonu</td></tr><tr><td>PE konjuge CD80</td><td>BD Biosciences</td><td>557227</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>PE konjuge CD86</td><td>BD Biosciences</td><td>555665</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>PE konjuge PD-L1</td><td>BioLegend</td><td>124307</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>APC konjuge MHCII</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-112-388</td><td>Akış sitometrisi</td></tr>, <tr><td>APC-konjuge CD11c</td>, <td>BD Biosciences</td><td>340544</td><td>Akış sitometrisi</td>,</tr><tr><td>İzotip, uyumlu, PE</td>, <td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-091-835</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>İzotipi ile eşleşen APC</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-091-836</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>BioLegend</td><td>423801</td><td>T hücresi proliferasyon testi</td></tr><tr><td>Pan dendritik hücre izolasyon kiti</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>T hücre proliferasyon deneyi</td></tr><tr><td>FcR Bloke Edici Reaktif</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>T hücre proliferasyon deneyi</td></tr><tr><td>Pan Dendritik Hücre Biyotin-Antikor Kokteyli</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>T hücre proliferasyon deneyi</td></tr><tr><td>Anti-Biotin Mikro Boncuklar</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>T hücre proliferasyon deneyi</td></tr><tr><td>CD4 + T hücre izolasyon kiti</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>T hücresi proliferasyon deneyi</td></tr><tr><td>CD4 + T hücresi Biotin-Antikor Kokteyli</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>T hücre proliferasyon deneyi,</td></tr><tr><td>Anti-Biotin Mikro Boncuklar</td>, <td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-104-454</td><td>T hücre proliferasyon testi</td></tr><tr><td>ACK parçalama tamponu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1049201</td><td>BMDC farklılaşması</td></tr><tr><td>1 ml şırınga</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>T hücresi proliferasyon testi</td></tr><tr><td>3 ml şırınga</td><td>BD Biosciences</td><td>309588</td><td>BMDC farklılaşması</td></tr><tr><td>25G iğne</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>T hücre proliferasyon testi</td></tr><tr><td>23G iğne</td><td>BD Biosciences</td><td>309588</td><td>BMDC farklılaşması</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>A2058</td><td>T hücresi proliferasyon deneyi</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575020</td><td>T hücresi proliferasyon testi</td></tr><tr><td>LS Sütunu</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-042-401</td><td>T hücre proliferasyon deneyi</td></tr><tr><td>Ön Ayırma Filtresi</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-095-823</td><td>T hücre proliferasyon deneyi,</td></tr><tr><td>kollajenaz D</td><td>Sigma Aldrich, Inc.</td><td>11088858001</td><td>T hücresi proliferasyon testi</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025076</td><td>T hücresi proliferasyon testi</td></tr><tr><td>ovalbümin (OVA) peptidi 323&ndash; 329</td><td>Sigma Aldrich A.Ş.</td><td>O1641</td><td>T hücre proliferasyon deneyi</td></tr><tr><td>Fare IFN-&gama; TaqMan probu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01168134_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Fare IL-12a TaqMan probu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00434165</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Fare IL-12 p70 DuoSet ELISA</td><td>R& D sistemleri</td><td>DY419-05</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>Fare EDN-1 ELISA</td><td>RayBiotech</td><td>ELM-EDN1-1</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>TNF-&alfa; TaqMan probu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00443258</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Fare TNF-&alfa; Quantikine ELISA Kiti</td><td>R& D sistemleri</td><td>MTA00B</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-6 TaqMan probu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00446190</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Fare IL-6 Quantikine ELISA Kiti</td><td>R& D sistemleri</td><td>M6000B</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-23a TaqMan probu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01160011</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Fare IL-23 DuoSet ELISA</td><td>R& D sistemleri</td>: <td>DY1887-05</td>, <td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-4, TaqMan probu</td>, <td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm99999154_m1</td>, <td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>IL-10, TaqMan probu</td>, <td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01288386_m1</td>, <td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>TGF-&beta; TaqMan probu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01178820_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Anti-Heme Oksijenaz 1 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab13248</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Anti-&beta;-aktin antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab8226</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>CFX96 Dokunmatik Gerçek Zamanlı PCR Tespit Sistemi</td><td>Bio-Rad Inc.</td><td></td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>BD FACSCalibur Hücre Analiz Cihazı</td><td>BD Biosciences</td><td>Akış sitometrisi</td><td></td></tr></tbody></table>

geliştirme ve işlevsel fare tolerogenic dendritik hücrelerin karakterizasyonu

Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

Bağışıklık sisteminin yabancı antijenlere karşı denetleyici yanıt arasında sıkı bir denge tutarak çalışır ve öz-antijenleri yanı sıra antijenlere karşı tepkisiz bir durum komensal organizmalar türetilmiş. Bu bağışıklık homeostazı bozulma kronik inflamasyon ve otoimmünite gelişmesine yol açabilir. Dendritik hücreler (DC) doğuştan gelen bağışıklık sisteminin yabancı antijenlere karşı bağışıklık yanıtı başlatmak için saf T hücreleri aktive dahil profesyonel antijen sunan hücreler vardır. Ancak, DCs da korumak ve T hücre tolerans teşvik ve efektör hücreleri ya da otoimmün veya kronik inflamasyon koşulları gelişimine katkıda bastırmak için hareket TolDCs içine farklı. TolDCs son ilerlemesi anlayışımız içinde DC tolerans ayırt etme durumları oransal tarafından elde edilebilir öneriyor. Bu olay TolDC tedaviler çok sayıda bağışıklık bozuklukları nedeniyle neden olduğu bağışıklık toleransı kırmak için gelişmekte olan muazzam büyüme yol açmıştır. Preklinik otoimmünite fare modelleri başarılı çalışmalar daha da TolDCs immunotherapeutic yardımcı programı otoimmün hastalıklar tedavi doğrulanmış var. Bugün, TolDCs kliniğinde çeşitli bağışıklık hastalıkları bağışıklık toleransı koruyucu bağışıklık olduğu gibi bırakarak patojenik otoimmün yanıtları hedefleyerek geri getirmemesi için umut verici bir immunotherapeutic aracı haline gelmiştir. Stratejilerinin bir dizi TolDCs ikna etmek için birden fazla labs tarafından önerilen, orada olsa da hiçbir tutarlılık bu hücrelerinin hücresel ve fonksiyonel fenotip karakterize. Bu iletişim kuralı kemik iliği türevi DCs çok sayıda, onları bir sentetik triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic TolDCs ayırt etmek için kullanılan benzersiz bir yöntem geliştirilmesi için adım adım yönergeler sağlar asit-difluoro-propil-Amid (CDDO-DFPA) ve TolDCs temel moleküler imza analizleri de dahil olmak üzere kendi fenotip onaylamak için kullanılan teknikler. Son olarak, biz onların immünsüpresif yanıt vitro ve in vivo preklinik manken multipl skleroz test ederek TolDC işlevini değerlendirmek için bir yöntem gösterir.

Farklılaşma ve BMDCs seçimi:
Kemik iliği progenitör hücre GM-CSF ve Il-4 iDCs 7 gün (Şekil 1A) ayırt etmek için tam RPMI ortamda kültürlü. Gün 1, hücreleri küçük içinde büyüklük ve küresel morfoloji gösterdi. Önce gün 3 taze orta yerine hücreleri form kümeleri için yardımcı oldu ve aynı zamanda CD11c nüfusu arttı PBS ile yıkama+ hücreleri. Günde 4, BMDCs boyutunda büyütül...

Burada, geliştirmek ve tolerogenic dendritik hücreler (TolDCs) karakterize ve onların immunotherapeutic yardımcı programı değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Geliştirme ve işlevsel fare Tolerogenic dendritik hücrelerin karakterizasyonu

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

Bu protokolün genel amacı, multipl skleroz gibi otoimmün bozuklukların tedavisinde immünoterapötik faydalarının değerlendirilmesi için murin tolerojenik dendritik hücreleri geliştirmek ve karakterize etmektir. Bu yöntem, tolerojenik dendritik hücrelerin geliştirilmesi ve işlevsel olarak karakterize edilmesi için standartlaştırılmış bir yöntem sağlayarak tolerojenik dendritik hücre tedavisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin başlıca avantajları, başarılı tolerojenik dendritik hücre gelişimi ve fonksiyonel tolerojenik dendritik hücre etkinliği testi için kullanılabilmesidir.Bu tekniğin sonuçları önemlidir. Tolerojenik dendritik hücreler, içsel immün düzenleyici mekanizmalara tabi kalırken anormal bir immün yanıtı sıfırlayabildiğinden, otoimmün bozukluklar için hücresel immünoterapinin geliştirilmesine doğru uzanırlar. Sekiz ila 10 haftalık C57BL / 6 farelerinden arka bacak kemiklerini topladıktan sonra, standart protokollere göre, mümkün olduğunca fazla dokuyu incelemek için cerrahi bıçaklar ve forseps kullanın ve temiz tibiaları ve femurları altı santimetrelik bir kültür kabına yerleştirin% 70 etanol.Kemiklerin her iki ucunu da cerrahi bir bıçak

development-functional-characterization-murine-tolerogenic-dendritic

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu video fare kemik iliği myeloid dendritik hücrelerin ayırt etmek için prosedür göstermektedir. İzolasyon fare tibia ve femur, ve kemik iliği işleme göstermiştir. Hücre fenotipi ve CpG IL-12 üretimi takiben olgunlaşma gösteren farklılaşma öncesi ve sonrası hücre morfolojisi gösteren resimler ve rakamlar gösterilmektedir.

Myeloid dendritik hücreler kemik iliği öncüleri Kültür

Dendritik hücreler tarafından ikincil lenfoid organlara Antijen sunumu T hücre aracılı adaptif immün yanıt başlatılması için çok önemlidir. Burada kemik iliği kültürü elde edilen fare dendritik hücreler, aktivasyon, 2-foton görüntüleme için etiketleme göstermektedir.

Kemik İliği Üretimi 2-foton Görüntüleme Kullanım murin Dendritik Hücreler Türetilmiş

Bu video, insan monositlerinden olgunlaşmamış, olgun ve tolerojenik dendritik hücrelerin veya DC'lerin oluşumunu göstermektedir. Monositlerin büyüme faktörleri ve sitokinlerle inkübasyonu, olgunlaşmamış DC'lerin üretimine yol açar. İmmün düzenleyici moleküllere yanıt olarak, olgunlaşmamış DC'ler tolerojenik ve olgun DC'lere farklılaşır.

Monositlerden Olgunlaşmamış, Olgun ve Tolerojenik Dendritik Hücrelerin Üretilmesi

Bu videoda, immünomodülatör bir farmakolojik ajan kullanarak dendritik hücreleri (DC'ler) tolerojenik DC'lere (TolDC'ler) dönüştürme yöntemi gösterilmektedir. Bu dönüşüm, CD4 + T hücreleri üzerindeki immünosüpresif etkileri yoluyla TolDC fonksiyonunun değerlendirilmesiyle doğrulanır.

İmmünomodülatör Farmakolojik Bir Ajanın Dendritik Hücreler ve CD4+ T Hücreleri Arasındaki Etkileşim Üzerine Etkisi

Bu protokol, FACS-aracılı hücre izolasyon hidrodinamik gen transferi, ve Peyer yama bağışıklık alt-akışı analizi içeren teknikleri kullanarak, ortak bir dendritik hücre progenitörlerinden Peyer yama plazmasitoid dendritik hücrelerin farklılaşmasını değerlendirmek için deneysel prosedürler açıklanmaktadır.

Hematopoetik progenitörlerin Evlatlık Transferi kullanarak Peter Parçacıklannda Murin plazmasitoid dendritik hücreleri Gelişimini değerlendirilmesi

Bu çalışmada, Flt3 ligandı varlığında ortak lenfoid progenitörleri AC-6 besleyici hücrelerle birlikte kültürleyerek verimli bir şekilde pDC üretebilen bir in vitro kültür sistemi sunuyoruz.

AC-6 Besleyici Sistemi kullanılarak Ortak Lenfoid progenitörlerin dan Fare plazmositoid dendritik hücreler İn Vitro Nesil

Farklı dendritik hücre alt kümeleri, lenfoid organlarda nadir popülasyonlar olarak bulunur ve bu nedenle immünolojik deneyler için yeterli sayıda ve saflıkta izole edilmesi zordur. Burada, fare splenik dendritik hücrelerinin şu anda bilinen tüm ana alt kümelerinin izolasyonu için yüksek verimli, yüksek verimli bir yöntem açıklıyoruz.

Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

Olgunlaşmamış dendritik hücreler, bağışıklık ve tolerans arasındaki dengeyi düzenlemek için seçici olarak tolerojenik veya olgun dendritik hücrelere farklılaştırılabilir. Bu çalışma, metabolik fenotiplerde farklılık gösteren olgunlaşmamış monosit türevli dendritik hücrelerden (moDC'ler), in vitro tolerojenik ve olgun moDC'lerden üretmek için bir araç sunmaktadır.

Metabolik fenotipleri farklı olarak sahip Olgunlaşmamış, Olgun ve tolerojenik Dendritik Hücrelerinin Üretimi

Burada , in vitro DC farklılaşması için stabil nakavt hücre hatları elde etmek için shRNA'nın lentiviral transdüksiyonunu kullanarak dendritik hücrenin (DC) gelişiminde rol oynayan potansiyel transkripsiyon faktörlerini taramak için bir protokol sunuyoruz.

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücre Hattı In vitrounda Kısa Saç Tokası RNA Aracılı Gen Knockdown ile Dendritik Hücre Gelişiminin İncelenmesi Çalışması

Burada, 10 ng / mL GM-CSF / IL-4 ile 7 günlük kültürden sonra farelerden yüksek saflıkta kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri izole etmek ve üretmek için ekonomik ve etkili bir yöntem sunuyoruz.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Farelerden İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi için Ekonomik ve Verimli Protokol

Farmakolojik ajanların naif monosit türevli dendritik hücrelerden in vitro olarak tolerojenik dendritik hücreler üretme kapasitesini değerlendirmek ve otolog düzenleyici T hücresi üretimi ile potansiyellerini doğrulamak için bir prosedür tanımladık.

İnsan CD14+ Monositlerinden Tolerojenik Dendritik Hücrelerin Üretilmesi için İmmünomodülatör Ajanları Test Etmek İçin Basit ve Etkili Bir Yöntem

Öğrenin fare tibias ve femur kemiklerinden tolerejenik dendritik hücre geliştirme ve karakterizasyon yöntemini. Bu standart protokol otoimmün hastalıklar için hücresel immünoterapi araştırmalarında tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

Geliştirme ve işlevsel fare Tolerogenic dendritik hücrelerin karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet