Name: En iyi duruma getirilmiş bir Nkullanarak akut beyin dilimleri hazırlanması-metil-D-glucamine koruyucu kurtarma yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Keşfedin NMDG koruyucu kurtarma yöntemiyle akut beyin dilimleri hazırlamayı. Bu teknik, yetişkin hayvanlardan sağlıklı dilimler elde ederek elektrofizyolojik deneyler için yüksek nöron korunumu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser beyin bilim için Allen Enstitüsü tarafından finanse edildi. Yazarlar Allen Enstitüsü kurucuları, Paul G. Allen ve Jody Allen, vizyon, cesaret ve destek için teşekkür etmek istiyorum. Biz de hayvan bakımı, Hayvancılık ve Genotipleme gerçekleştirmek için Allen Enstitüsü teknik destek personeline teşekkür ederim.

Transgenik fareler içeren yordamlar beyin bilim için kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Allen Enstitüsü tarafından onaylanmıştır. Hem erkek hem de dişi C57BL/6 fare (ağırlık aralığı 10-30 g) bu deneylerde kullanılıyordu. Bazı temsilcisi sonuçları yaşayan insan beyni dilimleri toplanan veriler açıklanmıştır. Neocortical doku örnekleri neurosurgeries tümör kaldırma sırasında elde edilmiştir. Hastalıklı doku erişmek için üstteki neocortical doku kaldırmak için gerekli. Bilinçli hasta rızası Nöroşirürji doku kullanmak İsveç Tıp Merkezi Kurumsal inceleme Kurulu tarafından onaylı bir protokol altında araştırma amacıyla her durumda elde edildi.
1. medya ve Kimyasalları (tablo 1) hazırlanması
Not: Çözümler izleme metaller ve diğer kirleri olmadığından arıtılmış suya yapılmalıdır. Kullanılmayan çözümler 4 ° C'de 1 hafta kadar için isterseniz depolanabilir, ancak bu çözümleri taze deneme, gününde yapılması tavsiye edilir. Yukarıdaki her formülasyon 1 L 1 – 2 Dilimleme yordamlar için yeterlidir. Tüm aCSF çözümler carbogen (% 95'i O2/5% CO2) ile istikrarlı pH tamponlama ve yeterli oksijenasyonu sağlamak için kullanılmadan önce doymuş olmalı. Tüm çözümler pH 7.3 7.4 ve osmolalite için ayarlanması gereken ölçülen ve 300-310 mOsmol/kg için ayarlanır.
<ol><li>NMDG-HEPES aCSF (mM) olarak hazırlamak: 92 NMDG, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glikoz, 2 Tioüre, 5 Na-askorbat, 3 Na-pyruvate, 0.5 CaCl2·2H2O ve 10 MgSO4·7H2O. Titrate pH 7,3 için 17 mL +/-0,5 mL 5 M hidroklorik asit ile –7.4. Not: Bu titrasyon adım ideal yağış önlemek için divalent özellikler eklenmesi önce gerçekleştirilmelidir; Ancak, yağış fizyolojik aralığı pH ayarlaması ters olabilir.</li>
	<li>ACSF (mM) tutan HEPES hazırlamak: 92 NaCl, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glikoz, 2 Tioüre, 5 Na-askorbat, 3 Na-pyruvate, 2 CaCl2·2H2O ve 2 MgSO4·7H2O. Titrate 10 N NaOH pH 7,3-7.4 ile birkaç damla için konsantre.</li>
	<li>Kayıt aCSF (mM) olarak hazırlamak: 124 NaCl, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 24 NaHCO3, 12,5 glikoz, 5 HEPES, 2 CaCl2·2H2O ve 2 MgSO4·7H2O. Titrate pH 7.3 7.4 için birkaç damla ile 10 N NaOH yoğunlaşmıştır.</li>
	<li>Na+ spike içinde çözüm (2 M) hazırlamak: NaCl 580 mg 5 mL taze hazırlanmış NMDG-HEPES aCSF çözülmüş. Bu bir beyin dilim hazırlık için yeterli çözümüdür.</li>
	<li>% 2 özel doku gömmek için kullanılmak üzere hazırlayın. Özel tip 1B 2 g dağıtılması ( Tablo malzemelerigörmek) 100 ml 1 x PBS ve mikrodalga sadece kaynar kadar. Karıştırın, sonra 10 cm steril Petri yemekler karışımı dökmek ve kuvvetlendirmek için izin vermek için girdap. Özel plaka 4 ° C'de mühürlü bir plastik torba kullanmak kadar saklamak.</li>
	<li>Enjekte edilebilir anestezi hisse senedi çözüm çalışma hazırlamak. 2-metil-2-butanol ile 5 mL 2.5 g 2,2,2-Tribromoethanol mix ve sonra yavaş yavaş 200 mL PBS, pH 7,0-7,3 geçiyoruz. Hisse senedi çözüm kullanmadan önce 0.22 µm filtre ile filtre ve ışıktan korunan 4 ° C'de depolayın. Not: kendi hayvan kullanım Komitesi kurallar ve kurallar hisse senedi çözüm çalışma anestezi için süre sonu ve elden çıkarma yordamı belirlemek için başvurun.</li>
</ol>2. Kurulum Dilimleme istasyonu
<ol><li>Dilimleme istasyonunu havaya doku dilimleme makinesi ve cerrahi aletler ( Tablo malzemelerigörmek) ile ayarlayın. Dilimleme makinesi ayarlamak için zirkonyum seramik enjektör bıçak kullanarak hızlı yapıştırıcı tutkal, bıçak kol eklemek sonra numune tutucu takın ve öncü bir bıçak bıçak değil kazımak sağlamak için küçük bir boşluk bırakarak numune tutucu RIM için hizalayın metal. Not: bıçak kenarı değil fiziksel olarak zarar görmüşse bu için adl hafta hatta yeniden kullanılabilir ay yerine koymadan. Çeşitli doku parçaların modelleri ticari olarak kullanılabilir, bunların çoğu zaman en iyi şekilde kalibre mükemmel performans sağlar. İdeal araç en az z ekseni saptırma, ya doğrudan ölçülen ve ayarlı veya ampirik olarak gözlenen olmalıdır.</li>
	<li>NMDG-HEPES aCSF ve öncesi soğuk buz üzerinde 200 mL ile sürekli carbogenation (taş medyada dalmış bir gaz difüzör ile uygulanan) için dolu bir 250 mL ölçek ayarlamak > 10 dak. Not: Bu çözüm için transcardial perfüzyon ve dilimleme makinesi rezervuar kesit sırasında doldurmak için kullanılır.</li>
	<li>NMDG-HEPES aCSF 150 mL ile dolu ilk beyin dilim kurtarma odası kurmak (sürekli carbogenation korumak) ve 32-34 ° C'de tutulan suyu Banyo odası yer Not: Bir dilim odası tasarımı sonra Edwards ve Konnerth (1992)52 için bu adım önerilir. Bu odaları hazır laboratuvar öğeleri ile yapılabilir (250 mL kabı, naylon örgü örgü, 50 mL konik tüp, 35 mm plastik yuvarlak tabak). Kalan hava ücretsiz kumaşı dilim kabarcıklar olduğunu, özellikle de bu kadar float ve hasar için dilimler neden olabilir gibi sürekli carbogen gaz kabarcık taşlar tarafından üretilen sağlamak için özen göstermelidir. Örgü sıvı yüzeyin altında yaklaşık 1 cm sular altında.</li>
	<li>Odası tutan bir beyin dilim kadar ayarlayın; daha büyük bir rezervuar içinde birden çok bağımsız wells bir tasarımla tavsiye edilir ( Tablo malzemelerigörmek). Havzanın HEPES aCSF ve sürekli carbogenation altında oda sıcaklığında sıcak 450 mL kadar kullanmak doldurmak. Not: Beyin dilimleri ilk kurtarma odasından bu odasına Elektrofizyolojik kayıt önce uzun süreli depolama için transfer edilir. Dilim örgü kalır hava kabarcıkları ücretsiz her zaman emin olmak için bakım alınması gerekir.</li>
	<li>Erimiş özel doku gömmek için hazırlayın. 50 mL konik şişe bir çerez kesici gibi açık uçlu önceden hazırlanmış yemek % 2 özel bir blok kesmek için kullanın. Gevşek konik şişeyi kap sonra özel sadece erimiş kadar 10-30 s için mikrodalga. Aşırı ısınma değil.</li>
	<li>Erimiş özel 1,5 mL tüpler içine dökün. Özel bir thermomixer ile 42 ° C arasında güçlü sallayarak ile ayarla kullanarak erimiş durumda koruyun. Dikkatle erimiş özel zamanından önce kuvvetlendirmek değil emin olun.</li>
	<li>İçin dilimleyici şu anda önceden soğutmak için buz Bloğu soğutma Aksesuar yerleştirin.</li>
</ol>3. Transcardial perfüzyon
Not: Transcardial perfüzyon yordam Yetişkin Hayvanlar ile çalışırken önemli bir adımdır ve beyni hızlı soğutma elde etmek önemlidir ve metabolizma düşük Na+beyin infüzyonu ile yavaşladı, Ca2 +düşük/yüksek Mg2 + aCSF çözüm. Transcardial perfüzyon Ayrıca görselleştirme ve transgenik satırlarındaki fluorescently etiketli hücre popülasyonlarının hedefleme engelleyebilmesi autofluorescence azaltır beyin damarlara kırmızı kan hücreleri temizlemek için hizmet vermektedir. Transcardial perfüzyon atlamak için tavsiye edilmez.
<ol><li>Fareler anestezik çalışan hisse senedi çözüm mayi enjeksiyonu ile derin anestezi (250 mg / kg: 0,2 mL %1,25 anestezik başına 10 g vücut ağırlığı, hisse senedi çözüm çalışma bkz: Malzemeler tablo). Sonra ~ 2-3 dk, ayak çimdik refleks değerlendirmek tarafından yeterli anestezi derinliği doğrulayın. Gerekirse, ek bir anestezik çalışma stok hacmi enjekte ve ayak çimdik refleks başka bir 2-3 dakika sonra yeniden değerlendirmek.</li>
	<li>Carbogenated NMDG-HEPES aCSF 25 mL 30 mL şırınga (2-4 ° C sulu veya dondurulmuş çözüm olarak karşı en iyi yöntemdir) önceden soğutulmuş 250 mL kabı yüklemek. 25 5/8 gauge iğne takın.</li>
	<li>Sırtında fare ile forepaws ve istikrar için arka paws aşağı pin. 15 cm cam Petri kabına de üs olarak sertleştirilmiş silikon inşaat ile dolu.</li>
	<li>Bir neşter kullanmadan, diyafram düzeyde göğüs boşluğuna açmak için yanal bir kesi olun. İyi makas göğüs kafesi her iki yan kalp ve akciğer kırpma önlemek için dikkat çekici üzerinde kesmek için kullanın.</li>
	<li>Geri kalp ortaya çıkarmak için göğüs kafesi Merkezi kısmındaki toplu iğne. 30 mL şırınga iğne sol ventrikül yerleştirin ve sağ Kulakçık kan kalp çıkmak izin vermek için iyi makasla kesme.</li>
	<li>El ile sabit basınç kullanarak şırınga pistonu basın ve soğutulmuş NMDG-HEPES aCSF ~ 10 mL/dk hızında hayvanla sıvı. Not: perfüzyon başarılı ise karaciğer soluk sarı koyu kırmızı rengi ve bazı durumlarda sıvıları burun delikleri yordamının sonuna doğru çıkarken dikkat edilmesi açık değişecek.</li>
</ol>4. beyin diseksiyon ve dilimleme
<ol><li>Hayvan başını kesmek. Neşteri kafasına cilt açmak ve kafatası kapağı açmak için kullanın.</li>
	<li>Cilt üzerinde kafatası kap Kes gitsin ve küçük kesiler yanal Kaudal/ventral adlı iki tarafında kafatasını temel kullanım iyi süper kesim makas. Alttaki beyin zarar vermemeye dikkat çekici dorsal orta hat kadar rostral yönde hareket kafatası Kaudal/dorsal yönünü başlayan ek sığ kesim yapmak. Bir final 'T yapmak ' dik olfaktör Ampüller düzeyde için orta hat kesilmiş. Not: Faiz beyin region(s) bir zarar emin olmak için bakım alınması gerekir. Özellikle, hiçbir zaman orada beyin için basınç herhangi bir yük olmalı.</li>
	<li>Yuvarlak uçlu forseps medial rostral yönü de başlayan kafatası kavramak ve Kaudal-lateral yönde geri soyma için kullanın. Çatlamak her iki taraf için tekrar açın ve beyin ortaya çıkarmak için kafatası kapağı dorsal yarısı çıkarın. Yavaşça önceden soğutulmuş NMDG-HEPES aCSF kabı sağlam beynini dışarı kepçe. Beyin ~ 1 dk için düzgün soğutmak izin.</li>
	<li>Büyük spatula kabı ve filtre kağıdı ile kaplı Petri kabına üzerine beyin kaldırmak için kullanın. Trim ve dilimleme tercih edilen açısı according ve beyin bölgesi ilgi istenen beyin engellemek. Hızlı uzun süreli oksijen yetmezliği işleme sırasında uzak durmaya çalışın. Not: Birçok Dilimleme açıları mümkündür. Tam engelleme yöntemi ve dilimleme açısı tam beyin bölgesi, hücre tipi ve devre üzerinde belirlenmesi için bağlı olacaktır.</li>
	<li>Beyin blok yapıştırıcı tutkal kullanarak örnek sahibi için yapıştırmayın. Numune yeterince beyin blok tamamen içten çekilmeye sahibi iç parçası geri çek. Beyin blok tamamen özel kaplı kadar erimiş özel doğrudan sahibi dökün. Bloğun etrafında ~ 10 için numune tutucu ürpertici önceden soğutulmuş Aksesuar kelepçe özel katılaşmış kadar s.</li>
	<li>Numune tutucu dilimleme makinesi üzerinde kabın içine yerleştirin ve doğru hizalaması doğrulayın. Havzanın 250 mL kabı üzerinden kalan önceden soğutulmuş, oksijenli NMDG-HEPES aCSF ile doldurun ve bir kabarcık göle süresi için yeterli oksijenasyonu sağlamak için dilimleme pulu.</li>
	<li>Özel katıştırılmış beyin numune ilerleyen başlamak için mikrometre ayarlayın. Dilimleyici başlatmak ve ampirik olarak önceden hız ve salınım frekansı istenen düzeye ayarlayın. Not: Her iki ayar düşük aralığında olmalıdır. En iyi sonucu elde etmek için tek bir geçmek ve bıçak kol almak yaklaşık 20 s ve salınım yok açık uğultu ile bir çok pürüzsüz ve yumuşak uğultu gürültü üretmek gerekir.</li>
	<li>İlerleyen devam ve 300 µm artışlarla (veya diğer tercih edilen kalınlık) kadar beyin bölgesi ilgi dokusunda Dilimleme tam kesitli; Dilimleme işlemi için toplam süre daha az 15dk olmalıdır.</li>
</ol>5. en iyi duruma getirilmiş NMDG koruyucu kurtarma yordamı
<ol><li>İlk NMDG kurtarma adım (kritik adım): parça yordamı tamamlandığında, tüm bir kesme Pasteur plastik boru t kullanma dilim toplamak ve 150 mL ile dolu bir Önceden ısıtılmış (34 ° C) ilk kurtarma odasına aktarmak NMDG-HEPES aCSF. Tüm dilimler kısa olacak biçimde aktarmak ve en kısa zamanda tüm dilimler kurtarma odasına taşınır bir Zamanlayıcıyı başlatmak.</li>
	<li>En iyi Na+ spike içinde zamanlamaya göre fare yaş belirlemek için Tablo 2 bakın. Not: Bu yordam Na+ reintroduction beyin dilim odasına kontrollü bir oranı elde etmek için pratik bir yöntem olup bir belirli beyin dilim odası geometrisi ve rezervuar hacmi ve türü için (bkz. Tablo reçetesi) en iyi duruma getirilmiş.</li>
	<li>Na+ spike içinde çözüm belirtilen birimleri belirtilen ekleyerek spike içinde kademeli Na+ yordamı gerçekleştirmek kez. Na+ spike-çözüm doğrudan hızlı karıştırma kolaylaştırmak için ilk kurtarma odası bubbler baca ekleyin.</li>
	<li>Tüm dilimler oda sıcaklığında muhafaza HEPES aCSF uzun vadeli holding odası aktarın. Dilimleri yeniden elde etmek için ek bir 1 h odası yama kelepçe kayıt deneyler başlatılıyor önce holding HEPES içinde izin.</li>
</ol>6. yama kelepçe kayıt
Not: Aşağıdaki temel yordamlar sadece bazı pratik hususlar sağlamak ve olarak bunlar başka bir yerde53,54bulunabilir için yama kelepçe kayıtları, detaylı iletişim kuralları göstermek için amaçlanmamıştır. Bir yama kelepçe Elektrofizyoloji teçhizat bu uygulama için gereklidir. Bu genellikle kızılötesi fark girişim kontrast (IR-DIC) optik ile donatılmış bir dik mikroskop oluşacaktır ve micromanipulator ve mikroskop bir floresan aydınlatma sistemi, bir yama kelepçe amplifikatör ve veri çizim tablası, motorlu Platform, titreşim yalıtım tablo, Faraday kafesi ve çözüm Isıtma ve perfüzyon sistemi. Örnek odası ve platform batık dilim kaydı için tasarlanmış. Birden çok amplifikatörler, baş aşamaları ve yüksek kaliteli micromanipulators donatılmış bir teçhizat çok nöron yama kelepçe kayıtları için gereklidir. Buna ek olarak, en iyi sonuçlar bir teçhizat 900 nm IR bant geçiren filtre ile donatılmış ve optik bileşenleri eşleşen son derece tavsiye edilir bulunan hücre yeterli görselleştirme sağlamak için > 50 µm derin beyin dilimleri içinde. Kӧhler aydınlatma için doğru hizalaması da açık görselleştirme için önemlidir.
<ol><li>Hücre içi pipet çözümde (mM) hazırlamak: 130 K-glukonat, 4 KCl, 10 HEPES, 0.3 EGTA, 10 phosphocreatine-Na2, 4 MgATP, 0.3 Na2-GTP ve 13.4 biocytin. 1 M KOH ile 7,35 için pH ve osmolalite 285 – 290 mOsmol/kg Sükroz gerektiği gibi kullanarak ayarlayın.</li>
	<li>Yama EKG mandalları borosilikat cam kalın duvarlı kılcal üzerinden hazırlamak; ideal yama kelepçe elektrot nispeten kısa ve güdüktüler konik vardır ~ 3 – 6 ile MOhm uç direnci banyoda dolu.</li>
	<li>Gümüş elektrot teller istikrarlı kayıtları sağlamak için düzgün chlorided olduğundan emin olun. Bunu yapmak son batış tarafından (tipik) 3-4 mm gümüş tel içinde sıvı çamaşır suyu yaklaşık 30 dk ya kadar tel siyaha döner.</li>
	<li>Taşma önlemek için 3-4 mL/dak Circulate carbogenated aCSF giriş ve çıkış eşleştirmek için dikkat çekici kayıt odası aracılığıyla kayıt kümesine bir Peristaltik pompa kullanarak çözüm perfüzyon kurmak.</li>
	<li>Bir tek beyin dilim batma kayıt odasına aktarmak ve güvenli yerde naylon ile bir dilim U şeklinde çapa kullanarak dizeleri çapraz. Daha yüksek bir güç amaç için (örneğin, yüksek sayısal diyafram veya 40 X 60 X su daldırma hedefleri) geçiş yapmadan önce bir 4 X hava hedefi kullanarak hedef beyin bölgesi tanımlayın.</li>
	<li>Görsel olarak sağlıklı hedef hücre belirle. Soma, nöronal membran görünümünü IR-DIC mikroskobu tarafından görüntülenmiştir gibi bir aday hücre yama kelepçe kayıt için uygunluğu yargılamak için kullanılır. Not: Sağlıklı nöronların genellikle aşağıdaki özellikleri Sergi: ne çekmiş ne de şişmiş somata, membran kenarları ve pürüzsüz membran görünüm yumuşak karşıtlık. Buna ek olarak, sağlıklı hücreler bulunan çoğu > 30 µm yüzeysel nöronlar ile hasar görmüş gibi muhtemel olarak derin dilimi, dendritik süreçleri kopmuş. Oluklu bir görünüm, açıkça görünür çekirdeği veya 'kızarmış yumurta' görünüm veya çok koyu veya yüksek karşıtlık membran kenarları sorun oluşturan nöronlar kaçınılmalıdır.</li>
	<li>Arka-dolgu yama ile hücre içi çözüm ~ 5 µL pipet ve elektrot tutucu yükleyin. Pipet beyin dilim üzerinde kayıt banyo içine taşıyın ve ucu herhangi bir engelleri temizlemek için hafif pozitif basınç uygulayın. Pipet uzaklık sıfır ve bir membran sınama işlevini kullanarak uç direnci izlemek.</li>
	<li>Pipet ucu hedef nöron'ın hücre vücut ile temas ilerlemenizi sağlar. küçük bir çukur hafif pozitif basınç nedeniyle membran yüzeyinde oluşturmalıdır.</li>
	<li>En kısa zamanda bir membran Gamze görülmektedir, hızla pozitif basınç kaldırmak ve nazik emiş mührü oluşumu kolaylaştırmak için uygulayın. Bir kez için pipet direncini artırır > 100 MOhm, beklenen istirahat membran ile eşleşen bir seviyeye bir holding komut hedef hücre türü için potansiyel açın (-70 mV olan iyi bir başlangıç noktası).</li>
	<li>İpucu direnç ≥1 gigaohm ulaştığında, membran keskin emme kısa nöbetleri kullanarak düzeltme eki pipet altında omuriliği tarafından hücre içine kırmaya girişimi; 'zap' özelliği içeri girmenin gerektiği gibi kolaylaştırmak için yararlı. Not: Bir holding potansiyelini-70 mV kortikal nöronlar üzerinde gerilim kelepçe deneyler için önerdi. Sağlıklı nöronlar bir sızıntı geçerli deneme süresi için-100 pA daha daha fazla negatif olacak ama bu kısmen hücre türüne bağlıdır. İstirahat membran potansiyeli -50 daha fazla depolarized Eğer bir nöron analizinden dışlanacak mV, ya da erişim direnci fazla % 20 oranında değişiklik olmadığını.</li>
	<li>
İstikrarlı bütün hücreli yama kelepçe kayıt alındıktan sonra kayıt için ek nöronlar adımları 6,6-6.10 tekrar ederek hedef. İlk kayıt kaybetmenize neden olur mekanik bozuklukları önlemek için dikkat ediniz.
	<ol>
<li>100 µm içinde ek nöronlar ilk nöron synaptically birleştiğinde nöronlar bulma ihtimali makul emin olmak için seçin. Not: Birden fazla aday nöronlar ön tanımlamak ve ön yük ve çeşitli hedeflenen hücrelere yakın tüm Pipetler ilk yama kelepçe kayıt kurmadan önce önceden konumlandırmak için bazı durumlarda yararlı olabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Na + Spike, Gigaohm mühür oluşumu ve yama kelepçe başarı kayıt geliştirir NMDG koruyucu kurtarma yöntemi ilk sürümü özellikle yetişkin ve atma hayvanlar2,5için tasarlanmıştır. Biraz erken benimseyenler de çocuk hayvan beyin Dilimleme için bu yöntemi uygulamak çalışmışlardır (Yani, fareler < 30 gün eski). Ancak, bu olağanüstü görsel olarak teyit nöronal korunması aksine bu yaş aralığında NMDG koruyucu kurtarma yöntemi ile gigaohm mühür oluşumu sık sık dışarı, girişimleri kayıt başarısız yama kelepçe için önde gelen oyalayabilirim olduğunu not edildi. Bir hipotez NMDG özellikler daha kolay yetişkin beyin dilimleri göre çocuk beyin dilimleri içinde sıkışıp kalırlar ve mühür oluşumu engelleyebilir. Ancak, genç beyin dilimler tam olarak NMDG aCSF (veri gösterilmez) batık iken gigaohm mühürler kolayca oluşturabilir, böylece gösteren o NMDG aCSF başına gigaohm mühür oluşumu engelleyen şey değil.
Düşük yüksek Na+ çözüm ilk beyin dilim kurtarma adım bitiminde hızlı geçiş nöronal membranların hasara neden ve mühür oluşumu süreci perturbs. Verilen bu Mg2 + oranı düşük yüksek Na+, soğuk sıcak sıcaklık ve dramatik ayrıcalık yükselmesi Ca2 + geçiş toplu olarak kurşun spontan sinirsel aktivite büyük bir canlanma için bu sezgileri var. Bu yordam Dilimleme beyin inhibitör rebound aşamasında iskemik hakaret takip reperfüzyon hasarı ayna muhtemeldir. Böylece, daha da nöronal membran hasarı olduğu Na+ konsantrasyon NMDG koruyucu kurtarma kuluçka odasında yükselmesine yavaş yavaş yavaş yavaş Na+ spike-in prosedürü dahil ilk kurtarma aşamasında azaltmak ve tekrarlanarak hassas zamanlama ile yükseltilmiş. Özgün koruyucu kurtarma yordamı olduğu gibi sıcaklık yüksekliğinden Na+ ve Ca2 +/Mg2 + oranı ayrıcalık zamansal ayrılma faydalıdır. Ama Ayrıca, spike-in Na+ prosedürü artımlı artışlar küçük hücre dışı Na+ konsantrasyon erken zaman puan ve böylece beyin dokusu saglayan geç zaman Puan doğru büyük artışlar üzerinde yol açar bir daha iyi yükselen Na+ seviyesi yerleştirmek için bir fırsat. Bu yordam kademeli çözüm Satım alternatif bir perfüzyon pompa veya yerçekimi tarafından denetlenen Na+ düzeyleri sabit artışlara yol ve giriş ve çıkış taşma dilim odasının önlemek için dikkat gerektiren damla satırlar olacaktır. Özellikle, bu Na+ spike-in dilim odası çözümde osmolalite prosedürü yavaş yavaş bir dilimleri normal osmolalite eriyik-e doğru döndürülür, ancak bu dilim sağlığı olumsuz yönde etkilemedi birkaç dakika boyunca yükselir ya da yama kelepçe başarı kaydetme. Bir yüksek osmolalite kesme çözüm daha önce Orta dilim hazırlıkları daha iyi dopamin nöronlar için böylece gösteren yama kelepçe kayıtları57,58, o bu geçici korumak için kullanılmıştır hyperosmolality bazı bağlamlarda yararlı olabilir.
NMDG koruyucu kurtarma yöntemi ve kademeli Na+ birleştirerek en iyi duruma getirilmiş bir yordamı uygulayarak spike-adım bu beyin dilim metodoloji yardımcı programı olgun yetişkin hayvan çağlar boyunca Juvenil kapsayacak biçimde genişletilmiştir. Güncellenme Zamanı bu iletişim kuralı şimdi geniş bir tek en iyi NMDG aCSF formülasyonu ve yordamı kullanarak hayvan yaş için uygundur. Gerekirse, spike-in Na+ prosedürü bir aşamalı olarak daha uzun gecikme ve/veya beyin dilim üzerinden büyük hayvanlar canlılık geliştirmek için daha yavaş zaman ders ile uygulanabilir ve spike içinde önerilen zamanlamaları göre temel bir rehber hazırladık hayvan için yaş (bkz. Tablo 2). Biz temel bir çerçeve uygulamaları geniş bir dizi için uygun şartıyla iken, ek gelişmiş adımlar daha fazla canlılık ve uzun yaşam-in beyin dilimleri yetişkin ve atma hayvanlardan geliştirme için keşfedilmeyi olabilir. Örneğin, glutatyon restorasyon stratejileri bu bağlamda özellikle etkilidir ve başka bir yerde2,6açıklandığı gibi uygulanabilir.
Deneyler zor için üretilen iş geliştirme Yama kelepçe kaydederek sinaptik bağlantı analizi başarı yüksek bir güvenilirlik elde etmek için nöronal yapısı ve işlevi mükemmel korunması gereken zorlu bir uygulamadır. Aynı anda kaydedilmesi için nöronların sayısı olarak doğrusal olarak, teknik zorluk seviyesi supra-doğrusal olarak artar artar. Çok sayıda hata modu vardır ve bir veya daha fazla hedef hücreleri üzerine form yeterli gigaohm mühürler yetersizlik başarısızlık en sık nedenleri biridir. Bu ilerleme, özellikle üç büyük ölçüde yavaşlatabilir veya daha fazla nöronlar aynı anda kaydedilmesi gerekir. Gigaohm mühür oluşumu zaman en iyi duruma getirilmiş NMDG koruyucu kurtarma yöntemi ile daha hızlı bulgusu ile tutarlı, transgenik başarı oranı ve akış verimi çok nöron yama kelepçe kayıt deneyler, belirgin bir iyileşme ile her iki yetişkin fare beyin dilimlerini ve yetişkin insan Nöroşirürji beyin dilimleri. İyileştirilmiş verimliliği neredeyse kesinlikle daha hızlı ve güvenilir gigaohm mühür oluşumu ve dilimleri bu iletişim kuralı ile geliştirilmiş nöronal korunması atfedilebilecek olduğunu. Bu iletişim kuralı açıkça uygulamalar kayıt düzeltme eki kelepçe için faydaları üzerinde duruluyor olsa da, benzer kazançlar beyin dilim canlılığı her şeyden nerede diğer zorlu deneysel uygulamalar için beklenmektedir.

Akut beyin dilim hazırlık nörolojik bir temel deneysel model sistemidir. Kabaca yarısı bir yüzyıl için çok çeşitli anatomik beyin bölgeleri ve hayvan türleri arasında yaşayan beyin dinamik fonksiyonel çalışmalar bu platform sağlamıştır. Amaçlanan uygulama biyokimya, fonksiyonel görüntüleme, Morfoloji, Elektrofizyoloji olup, bu en iyi bütünlüğü ve dilimlenmiş doku canlılık sağlamak için son derece önemlidir. Son derece esnek Juvenil kemirgen beyin dilim hazırlık (Yani, doğum sonrası gün 30 fareler için daha genç) en çok tercih edilen tarih oldu bu nedenle içindir. Yeterince sağlıklı beyin almak üzere zorluk olgun yetişkin dilimler ve hayvanlar eskime çoğu için müthiş bir meydan okuma olduğu kanıtlanmıştır ve olgun beyin işlev Mimarlık eğitimi için ciddi sınırlamalar empoze. Bu özellikle kayıt düzeltme eki kelepçe mükemmel morfolojik ve fonksiyonel koruma gerektirir ve detaylı iç ve sinaptik özelliklerini tespit tek nöronların karakterize için vazgeçilmez bir teknik için de geçerlidir. Son birkaç on yıl için sağlıklı beyin dilimleri--dan genç ve çok daha az için hazırlamak için Sükroz yerine düşük Na+ aCSF1 kullanarak bir 'koruyucu kesme' yöntem yama kelepçe electrophysiologists büyük çoğunluğu dayanıyordu ölçüde, genç yetişkin hayvanlar. Bu yöntem pasif Na+ akını ve sonraki su giriş ve dilim kesme adımı sırasında şişme hücre olduğunu nöronlar, zavallı yaşama neden baskın hakaret özellikle yer alan bu nöronlar için öncül dayalı bıçak hareketi direkt travma sürdürebilmek olasılıkla yüzeysel katmanları. Ancak, koruyucu kesme yöntemi hala beyin dilim hazırlık bağımsız olarak uygulanan belirli aCSF formülasyonu olgun yetişkin hayvanlardan için arzu edilen düzeyde bırakır.
Bu sorun için basit ama etkili bir çözüm oldu2,3,4,5,6 açıklanan ve 'koruyucu Kurtarma' beyin dilim yöntemi olarak adlandırdığı. NMDG en çok yönlü ve (Sükroz, gliserol, Kolin ve Tris dahil) çeşitli diğer aday sodyum iyon yedekler arasında etkili olarak tanımlandığı gibi bir NMDG yerine aCSF bu yöntem özgün sürümünü kullanır. Medya formülasyon daha fazla beyin dilim ödem karşı ve daha güçlü pH7tampon sağlamak için HEPES eklenmesi, hem de takviyeleri zararlı etkilerini oksidatif stres (Tablo 1) eklenmesi tarafından geliştirilmiş oldu. Bu ampirik bir başlangıç kurtarma kuluçka adım düşük Na+, düşük Ca2 +, ve yetişkin beyin doku Dilimleme gerekli ve yeterli için hemen sonra yüksek Mg2 + NMDG aCSF nöronal geliştirilmiş belirlendi beyin bölgeleri, hücre tipleri ve hayvan yaş3,5,6geniş bir aralığı boyunca korunması.
Özellikle, ne şimdi koruyucu kurtarma yöntemi nitelenen önceki enkarnasyonları edebiyat1,8,9,10,11,12', bulunabilir 13, tam potansiyeline için olgun yetişkin ve hayvan beyin dilim ve yama kelepçe kayıt eskime değildi ancak tanınan veya bu önceki eserlerinde gösterdi. Buna ek olarak, farklı yaklaşımlar içeren yordam varyasyonları belirli deneysel uygulamalar4,14,15,16destek çıkmaya devam edin. Çok sayıda araştırma gruplarının çalışmalarını toplu gövdesi koruyucu kurtarma yöntemi geliştirilmiş doku koruma için sağlamlık yüksek güven kazandırır. NMDG koruyucu kurtarma yöntemi yaygın şekilde benimsenen şimdi ve yetişkin hayvan beyin dilim preparatları kullanan çok sayıda Yayınlanan araştırma çalışmalarında uygulanan. Bu akut dilim çalışmalar yayılan neocortical3,17,18, Hipokampal15,19,20,21, striatal22 , 23 , 24, orta25,26,27,28,29ve arka beyin30,31,32, 33 , 34 bölgeler ve nörotransmitter ve Nöromodülatör türleri glutamatergic4,30, GABAergic18,20,31,35 de dahil olmak üzere çeşitli ,36, dopaminerjik24,29,37,38, kolinerjik14,37,38, 39, noradrenergic40ve serotonerjik27,28 neurotransmission. Yöntemi Ayrıca Transjenik hayvanlar3,39 veya vivo içinde viral enjeksiyonları17,27ardından elde edilen dilimleri nöronal faaliyette optogenetic kontrolü için de uygun olduğu, 28,40,41,42,43, iyi olarak fonksiyonel Ca2 + görüntüleme nöronal aktivite2,44 olarak ,45,46. Analizleri, kısa vadeli plastisite4,47,48 ve uzun vadeli plastisite16,35,48 farklı biçimleri olmuştur bildirdi. Yeni yapılan bir çalışmada kapsamlı ve sistematik bir olgun yetişkin fare beyin dilimleri yapılandırma49 kayıt octopatch kullanarak görsel kortekste sinaptik bağlantı sondalama kolaylaştırmak için NMDG koruyucu kurtarma yöntemi uygulanan — güçlü gösteri yardımcı programını ve sağlamlık bu yöntemin. Koruyucu kurtarma yöntemi bile başarıyla gibi damarlara ve yetişkin kortikal beyin dilimleri50, yama kelepçe üzerinden kayıt perisitlerden geliştirilmiş korunması önceden öngörülemeyen deneysel bağlamlarda uygulandı interneuron nüfus 1-1.5 yaşında Alzheimer hastalığı fare modelleri20ve bir yetişkin beyni dilim reseptör kaçakçılığı tahlil51nakledilmektedir.
Aşağıdaki iletişim kuralı beyin dilim hazırlık akut beyin dilimleri canlılık geliştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir NMDG koruyucu kurtarma yöntemi uygulamak için adım adım yordamlar açıklanır. Gösteri bu metodoloji karmaşık çok nöron yama kelepçe deneyler genç yetişkin transgenik fare beyin dilimleri ve olgun yetişkin kayıt için açık faydaları yanı sıra geliştirilmiş nöronal korunmasına ilişkin ilkeleri tartışılmıştır insan Nöroşirürji beyin dilimleri. Aşağıdaki iletişim kuralı birden fazla yaş 21 gün eski fareler için de yetişkin hastalardan elde edilen insan Nöroşirürji numuneler gelince doğrulandı.

<table><tbody><tr><td>Sıkıştırma VF-200</td><td>Hassas Aletler</td><td>VF-200</td><td>Titreşimli doku dilimleyici (önerilir)</td></tr> <tr><td>N-metil-D-glukamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004</td><td>aCSF bileşeni</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td>aCSF bileşeni</td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>aCSF bileşeni</td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat monobazik dihidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71505</td><td>aCSF bileşeni</td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>aCSF bileşeni</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>aCSF bileşeni</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td>aCSF bileşeni</td></tr><tr><td>Sodyum Askorbat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td>aCSF bileşeni</td></tr><tr><td>Tiyoüre</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8656</td><td>aCSF bileşeni</td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5280</td><td>aCSF bileşeni</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td>aCSF bileşeni</td></tr><tr><td>Magnezyum Sülfat heptahidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1880</td><td>aCSF bileşeni</td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromoetanol ve nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T48402</td><td>Anestezik bileşen 1</td></tr><tr><td>2-metil-2-bütanol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>240486</td><td>Anestezik bileşen 2</td></tr><tr><td>Kavisli künt forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11065-07</td><td>Beyin diseksiyon araçları</td></tr><tr><td>İnce diseksiyon makası (süper kesim)</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14058-09</td><td>Beyin diseksiyon aletleri</td></tr><tr><td>Büyük ağır hizmet tipi makas 7''</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14000-18</td><td>Beyin diseksiyon aletleri</td></tr><tr><td>Metal spatula</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z511455-1PAK</td><td>Beyin diseksiyon aletleri</td></tr><tr><td>Jiletli</td><td>bıçaklar VWR</td><td>89031-954</td><td>Beyin diseksiyon aletleri</td></tr><tr><td>Beyin Dilimi Tutucu-4</td><td>Otomatik Bilimsel</td><td>S-BSK4</td><td>beyin dilimi tutma odası</td></tr><tr><td>naylon örgü ve nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0198</td><td>Küçük dilim geri kazanım odaları inşa etmek için</td></tr><tr><td>Pyrex cam beherler (250 mL)</td><td>VWR</td><td>89090-434</td><td>Küçük dilim geri kazanım odaları inşa etmek için</td></tr><tr><td>35 mm plastik tabak, yuvarlak</td><td>VWR</td><td>100488-376</td><td>Küçük dilim geri kazanım odaları oluşturmak için</td></tr><tr><td>Gaz difüzör taşları (10 & mikro; m)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>59277</td><td>Sabit karbojenasyon için (ince kabarcıklar)</td></tr> <tr><td>Agaroz Tip IB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0576</td><td>Beyin örneklerini gömmek için</td></tr><tr><td>Mikro yükleyici uçları</td><td>Eppendorf</td><td>22491229</td><td>Yama kelepçesi elektrotlarını doldurmak için</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td>Özel bir diseksiyon platformu yapmak için</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>Ortamın pH ayarlaması için</td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465-25G</td><td>Ortamın pH ayarlaması için</td></tr><tr><td>Potasyum Hidroksit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473</td><td>Ortamın pH ayarlaması için</td></tr><tr><td>Plastik transfer pipetleri 3 mL dereceli</td><td>VWR</td><td>89497-676</td><td>Dilim transferi için</td></tr><tr><td>Zirkonyum seramik enjektör bıçakları</td><td>Cadence Özel Bıçaklar</td><td>EF-INZ10</td><td>http://cadenceinc.com/</td></tr> <tr><td>KG-33 borosilikat cam filamentli kılcal</td> damar <td>King Glass Company</td><td>özel fiyat teklifi</td><td>ID: 0,87 mm, OD 1,50 mm</td></tr><tr><td>Biyosit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4261</td><td>Stajyer pipet çözeltisi</td></tr><tr><td>Fosfokreatin disodyum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7936</td><td>Stajyer pipet çözeltisi</td></tr><tr><td>Potasyum Glukonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4500-100G</td><td>Stajyer pipet çözeltisi</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td>Stajyer pipet çözeltisi</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9187</td><td>Stajyer pipet çözeltisi</td></tr><tr><td>Na2-GTP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51120</td><td>Stajyer pipet çözeltisi</td></tr><tr><td>sükroz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td>Stajyer pipet çözeltisi</td></tr><tr><td>Isıtmalı su banyosu (2.5L)</td><td>VWR</td><td>13491-060</td><td>Çeşitli</td></tr><tr><td>Filtre kağıdı mermiler</td><td>VWR</td><td>28456-022</td><td>Çeşitli</td></tr><tr><td>Siyanoakrilat yapıştırıcı</td><td>Amazon</td><td>B000BQRBO6</td><td>Çeşitli</td></tr><tr><td>Cam petri kabı</td><td>VWR</td><td>89000-326</td><td>Çeşitli</td></tr><tr><td>10X Fosfat tamponlu salin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td>Çeşitli</td></tr><tr><td>30 mL şırıngalar</td><td>VWR</td><td>BD302832</td><td>Çeşitli</td></tr><tr><td>1 mL şırıngalar</td><td>VWR</td><td>BD-309628</td><td>Çeşitli</td></tr><tr><td>25 5/8 gauge iğneler</td><td>VWR</td><td>89219-292</td><td>Çeşitli</td></tr><tr><td>Termomikser (w/1.5 mL tüp bloğu)</td><td>VWR</td><td>89232-908</td><td>Agarozu erimiş tutmak için&nbsp;</td></tr></tbody></table>

en iyi duruma getirilmiş bir nkullanarak akut beyin dilimleri hazırlanması-metil-d-glucamine koruyucu kurtarma yöntemi

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Bu iletişim kuralı Npratik bir kılavuzdur-metil-D-glucamine (NMDG) koruyucu kurtarma yöntemi beyin dilim hazırlık. Çok sayıda son yıllarda yapılan çalışmalarda nöronal korunması ve genel beyin dilim canlılığı arttırmak için bu yöntemin yarar doğrulanmış var. Bu teknik erken benimseyenler tarafından uygulanması çeşitli deneysel uygulamalar kullanarak ve çok çeşitli hayvan yaş, beynin ve hücre tipleri kapsayan beyin fonksiyonu ayrıntılı soruşturmalar kolaylaştırdı. Güvenilir bir şekilde sağlıklı beyin dilimler için yama kelepçe Elektrofizyoloji elde etmek için bir en iyi duruma getirilmiş NMDG yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) medya formülasyonu ve gelişmiş yordamı kullanarak koruyucu kurtarma beyin dilim tekniği oynayabilmeniz için adımları özetlenmiştir. Güncellenme Zamanı Bu yaklaşımla önemli bir gelişme hızı görülmektedir ve gigaohm güvenilirliğini mühür hedeflenen yama kelepçe böylece zorlu kolaylaştırmak mükemmel nöronal koruma koruyarak deneyler kayıt esnasında deneysel uygulamalar. Genç Yetişkin transgenik fareler ve olgun yetişkin insan Nöroşirürji numuneler sinaptik bağlantısı'nda neocortical beyin dilimleri tahlil için deneyler kayıt çok nöron yama kelepçe hazırlanan sağlanan temsilcisi sonuçlarıdır. Ayrıca, en iyi duruma getirilmiş NMDG koruyucu kurtarma yöntemi beyin Dilimleme böylece özgün metodoloji sınırlamasından çözme çocuk ve yetişkin hayvanlar ile uyumludur. Özet olarak, bir tek medya formülasyonu ve yordam Dilimleme beyin çeşitli tür ve yaş mükemmel canlılık ve doku koruma elde etmek için uygulanabilir.

Bu iletişim kuralı bir en iyi duruma getirilmiş Nuygulanmasını gösteren-metil-D-glucamine (NMDG) koruyucu kurtarma yöntemi beyin dilim hazırlık. Bir tek medya formülasyon güvenilir bir şekilde sağlıklı beyin dilimleri her yaştan ve çeşitli deneysel uygulamalar için hayvanlardan elde etmek için kullanılır.

En iyi duruma getirilmiş bir Nkullanarak akut beyin dilimleri hazırlanması-metil-D-glucamine koruyucu kurtarma yöntemi

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Bu prosedürün genel amacı, yama kelepçesi elektrofizyolojisi deneyleri için uygun olan olgun yetişkin hayvanlardan sağlıklı beyin dilimleri hazırlamaktır. Bu nedenle, beyin dilimi hazırlığı için bu optimize edilmiş NMDG Koruyucu Kurtarma Yöntemi, araştırmacıların birçok farklı beyin bölgesinde ve hemen hemen her yaştaki hayvanlar için beyin hücresi tiplerinin içsel ve sinaptik özelliklerini keşfetmelerine olanak tanır. Bu nedenle, bu özel tekniğin ana avantajı, önceki metodolojilere kıyasla daha yüksek derecede nöronal korumaya sahip beyin dilimleri hazırlamaya izin vermesidir.Ve ayrıca bu beyin dilimleri yama kelepçesi kaydı için daha uygundur. Bu yöntem yetişkin fare beyin dokusu için optimize edilmiştir. Nöroşirürjik olarak rezeke edilmiş insan beyin dokusu dahil olmak üzere çeşitli diğer türler için kullanılabilir.Bu prosedüre başlamak için, dilimleme istasyonunu doku dilimleyici makinesi ve cerrahi aletlerle kurun. Hızlı yapışkan yapıştırıcı kullanarak bıçak koluna bir zirkonyum seramik enjektör bıçağı takın. Ardından numune tutucuyu yerleştirin ve bıçağın ön kenarını numune tutucu kenarıyla hizalayın.Bıçağın metali sıyırmamasını sağlamak için küçük bir boşluk bırakın. 250 mililitrelik bir kabı 200 mililitre NMDG HEPES aCSF ile doldurun. Ve 10 dakikadan fazla sürekli karbojenasyon ile buz üzerinde önceden soğutun.Ardından, 150 mililitre NMDG HEPES aCSF ile doldurarak ilk beyin dilimi kurtarma odasını kurun. Ve odayı 32 ila 34 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin. Bir beyin dilimi tutma odası kurmak için, rezervuarı 450 mililitre HEPES aCSF ile doldurun ve kullanılana kadar sabit karbojenasyon altında oda sıcaklığına ısınmasına izin verin.Daha sonra, 50 mililitrelik konik bir şişenin açık ucunu kullanarak önceden hazırlanmış tabaktan %2'lik bir agaroz bloğunu keserek doku gömmek için erimiş agaroz hazırlayın. Konik şişeyi gevşek bir şekilde kapatın, ardından agaroz erimeye başlayana kadar 10 ila 30 saniye mikrodalgada pişirin. Aşırı ısıtmayın.Erimiş agarozu 1,5 mililitrelik tüplere dökün. Kuvvetli bir çalkalama ile 42 santigrat dereceye ayarlanmış bir termomikser kullanarak agarozu erimiş halde tutun. Ve erimiş agarozun erken katılaşmadığından dikkatlice emin olun.Bu sırada buz üzerinde dilimleyici için aksesuar soğutma bloğunu önceden soğutun. Bu prosedürde, kafatasını ortaya çıkarmak için başın derisi üzerinde bir kesik yapın. Ardından, takkenin üzerindeki deriyi kesmek için ince süper kesilmiş makas kullanın.Ve kafatasının kaudal ventral tabanının her iki tarafında yanal olarak küçük kesiler yapın. Kafatasının kaudal dorsal yönünden başlayarak, dorsal orta hatta rostral yönde hareket ederek ek sığ kesimler yapın. Altta yatan beyne zarar vermemeye özen gösterin.Bundan sonra, koku alma ampulleri seviyesinde orta hatta dik olarak son bir T kesimi yapın. Daha sonra, rostral medial yönden başlayarak kafatasını kavramak için yuvarlak uçlu forsepsleri kullanın ve bir tarafta kaudal lateral yöne doğru soyun. Diğer tarafın çatlayarak açılması için bu prosedürü tekrarlayın.Ve beyni ortaya çıkarmak için kafatası kapağının dorsal yarısını çıkarın. Sağlam beyni, önceden soğutulmuş NMDG HEPES aCSF'nin kabına nazikçe çıkarın. Ve beynin yaklaşık bir dakika boyunca eşit şekilde soğumasına izin verin.Şimdi, beyni beherden filtre kağıdı ile kaplı Petri kabına aktarmak için büyük bir spatula kullanın. Beyni, tercih edilen dilimleme açısına ve istenen beyin ilgi bölgesine göre kesin ve monte edin. Kullanım sırasında uzun süreli oksijen yoksunluğunu önlemek için hızlı çalışın.Daha sonra, beyin bloğunu yapışkan yapıştırıcı kullanarak numune tutucuya yapıştırın. Beyin bloğunu tamamen içeri çekmek için numune tutucunun iç parçasını geri çekin. Daha sonra erimiş agarozu, beyin bloğu tamamen agarozla kaplanana kadar doğrudan tutucuya dökün.Daha sonra, önceden soğutulmuş aksesuar soğutma bloğunu, agaroz katılaşana kadar numune tutucunun etrafına on saniye boyunca sıkıştırın. Numune tutucuyu dilimleme makinesindeki yuvaya yerleştirin ve doğru hizalamayı doğrulayın. Bunu takiben, rezervuarı 250 mililitrelik beherden kalan önceden soğutulmuş oksijenli NMDG HEPES aCSF ile doldurun ve yeterli oksijenasyonu sağlamak için kabarcık taşını dilimleme süresi boyunca rezervuara yerleştirin.Ardından, agaroz gömülü beyin örneğini ilerletmeye başlamak için mikrometreyi ayarlayın. Dilimleyiciyi başlatın ve ilerleme hızını ve salınım frekansını ampirik olarak istenen seviyeye ayarlayın. İlgilenilen beyin bölgesi tamamen kesilene kadar dokuyu 300 mikrometrelik artışlarla ilerletmeye ve dilimlemeye devam edin.Dilimleme işlemi için toplam süre 15 dakikadan az olmalıdır. İlk NMDG kurtarma işlemi için. Kesit alma prosedürünün tamamlanmasının ardından, tüm dilimleri bir kesme plastik mera pipeti kullanarak toplayın ve bunları 150 mililitre NMDG HEPES aCSF ile doldurulmuş 34 derecelik bir geri kazanım odasına aktarın.Akut beyin dilimi kurtarma adımının zamanlaması, morfolojik koruma ile her bir nöronun elektrofizyolojik özelliklerinin fonksiyonel olarak geri kazanılması arasında bir denge kurabilmek için çok önemlidir. Optimal sodyum spike-in programını belirledikten sonra, fare yaşına göre, belirtilen zamanlarda belirtilen hacimlerde sodyum spike-in çözeltisi ekleyerek Step Y sodyum spike-in prosedürünü gerçekleştirin. Hızlı karıştırmayı kolaylaştırmak için sodyum spike-in çözeltisini doğrudan ilk geri kazanım odasının fıskiye bacasına ekleyin.Çeşitli farklı yaş aralıkları ile sağlanan sodyum spike-in programı gerçekten iyi bir başlangıç noktasıdır. Ancak kendi özel deneysel tasarımınız için optimize edilmeli ve kullanılmalıdır. Daha sonra, tüm dilimleri oda sıcaklığında tutulan HEPES aCSF uzun süreli bekletme odasına aktarın.Yama kelepçesi kayıt deneylerinden önce dilimlerin HEPES tutma odasında bir saat daha toparlanmasına izin verin. Burada, nöronların morfolojik korunmasının değerlendirilmesi için üç aylık bir fareden alınan çeşitli beyin bölgelerinden ve akut dilimlerden elde edilen temsili IR DIC görüntüleri gösterilmektedir. Burada gösterilen sonuçlar, koruyucu bir geri kazanım adımı olmadan kontrol NMDG koruyucu kesme yönteminin kullanılmasından elde edilmiştir.Oysa bu sonuçlar optimize edilmiş NMDG koruyucu geri kazanım yönteminden alınmıştır. Genel olarak, optimize edilmiş NMDG koruyucu geri kazanım yöntemi ile gelişmiş nöronal koruma gözlenir. Kademeli sodyum spike-in prosedürü ile optimize edilmiş NMDG koruyucu geri kazanım yöntemi, orijinal NMDG koruyucu geri kazanım yöntemi ile karşılaştırıldı.GigaOhm conta oluşumu ve yama kelepçesi kaydı için ortalama süre, NMDG koruyucu geri kazanım adımı ile birlikte kademeli sodyum spike-in prosedürü uygulandığında önemli ölçüde ve önemli ölçüde azaldı. Bu beyin dilimi yöntemiyle elde edilen gelişmiş nöron koruması, lokal sinaptik bağlantıyı araştırmak için çok elektrotlu yama kelepçesi elektrofizyolojisi dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere zorlu deneysel uygulamaları kolaylaştırır. Burada gösterildiği gibi, nöroşirürjiden elde edilen yetişkin insan ex vevo neokortikal beyin dilimleri kullanılarak.Bilim adamları, yama kelepçesi kayıtları için uygun beyin dilimleri hazırlamak için tarif ettiğimiz yeni sodyum spike-in prosedürü de dahil olmak üzere optimize edilmiş NMDG Koruyucu kurtarma yöntemimizin nasıl uygulanacağı hakkında bu videoyu izleyerek iyi bir anlayışa sahip olmalıdır. Bu nedenle, bu protokole hakim olduktan sonra, beyin dilimi prosedürünü her gün bir saatten daha kısa bir sürede tamamlamak mümkün olmalıdır. Ve yüksek kaliteli tekrarlanabilir beyin dilimleri vermeli ve hemen hemen her yaştan hayvan için işe yarayacaktır.Dolayısıyla bu prosedür, bu yöntem, elektrofizyoloji, canlı optik görüntüleme ve optogenetik, reseptör kaçakçılığı testleri ve beyin hücresi tiplerinin işlevini keşfetmek için diğer fonksiyonel testler gibi teknikleri kullanarak beyin fonksiyonu hakkındaki soruları ele almak için uygun beyin dilimlerinin hazırlanmasına yardımcı olabilir. Bu nedenle, bu teknik aynı zamanda yararlıdır, çünkü araştırmacıların, yetişkin hayvanlardan beyin dilimlerinde yama kelepçe kaydı için geleneksel olarak uygun olmayan beyin bölgeleri de dahil olmak üzere farklı beyin bölgelerini işlevsel olarak inceleyebilmelerine yardımcı olacaktır.

preparation-acute-brain-slices-using-an-optimized-n-methyl-d

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videoda, N-Metil-D-glukamin (NMDG) bazlı koruyucu kurtarma yöntemi kullanarak beyin dilimleri elde etmek için bir protokol açıklanmaktadır. Diseke edilmiş bir beyin, kesit sırasında nöronal hücre ölümünü ve hasarını en aza indirmek için NMDG ve HEPES ile bir aCSF'de inkübe edilir. Hücresel aktiviteleri eski haline getirmek için bölümün aCSF'de iyileşmesine izin...

NMDG Tabanlı Koruyucu Kurtarma Yöntemi Kullanılarak Beyin Bölümlerinin Hazırlanması

Fare modellerinin hipokampusunda dendritik arborizasyonun görselleştirilmesi ve ölçülmesi için iki yöntem açıklıyoruz: gerçek zamanlı ve genişletilmiş alan derinliği görüntüleme. İlk yöntem, karmaşık topografik izlemeye ve dallanma derecesinin ölçülmesine izin verirken, ikincisi dendritik ağacın hızlı bir şekilde görselleştirilmesine izin verir.

Farelerde Hipokampal Bölgesi Dentate Gyrus dendritik arborization Değerlendirilmesi

Bu iletişim kuralı oksijen seviyesini geri dönüşümlü arabellek küçük bir hacim ve etkinlik bağımlı sinaptik plastisite batık akut Hipokampal dilimler halinde kayıt metodolojik açıdan istikrar açıklar.

Sinaptik plastisite akut Hipokampal dilimleri bir küçük hacimli geri dönüşüm-, perfüzyon- ve batma-tipi oda sistemi içinde tutulan kayıt

Microglia, yerleşik bağışıklık hücreleri beynin, çabuk morfolojik değişiklikler ile çevrenin değişiklikler cevap. Bu protokol iki fotonlu mikroskobu serotonin veya ATP doğru mikroglial süreçlerinde fareler dilim akut beyin cazibe çalışmak için nasıl kullanılacağını açıklar.

Mikroglial süreçleri cazibe ATP veya Serotonin akut beyin dilimleri içinde doğru iki fotonlu görüntüleme

Bu doku hipoksik hasarı azaltmak için buz gibi NMDG-aCSF ile transkardiyal perfüzyon ve dilim kesme yararlanır yetişkin ve yaşlanma fare hipokampi akut dilim hazırlanması için bir protokoldür. Elde edilen dilimler saatlerce sağlıklı kalır ve uzun süreli yama kıskaçları ve alan kayıtları için uygundur.

Yetişkin ve Yaşlanan Farelerden Hipokampal Dilimlerde Hipoksinin En Aza Indirilmesi

Bu makale, farelerde yatay hipokampal beyin dilimleri elde etmek için sistematik bir protokolü tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu metodolojinin amacı, dentat girus ile ilgili nörolojik süreçleri değerlendirmek için perforant yol ve yosunlu lif yolu gibi hipokampal lif yollarının bütünlüğünü korumaktır.

Fare Beyninin Yatay Hipokampal Dilimleri

Farelerin dorsal-ara hipokampusundan akut dilimler hazırlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu transversal preparatı, kayıtların kalitesi ve kaydedilen nöronların morfolojik özelliklerinin korunması açısından koronal dilimleme ile karşılaştırıyoruz.

Yetişkin Farelerin Dentat Girusunda Tüm Hücre Kaydı ve Nöronal Rekonstrüksiyon için Dorsal Hipokampustan Akut Dilimlerin Hazırlanması

Murine hipokampustaki dendritik dikenleri görüntülemek ve analiz etmek için Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBEM) uygulanır.

Dendritik Dikenlerin Çalışması için Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBEM)

Burada, tekrarlanan hafif travmatik beyin hasarının (r-mTBI) hipokampustaki sinaptik plastisite üzerindeki etkilerini incelemek için uyanık bir kapalı kafa travması modelinin nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir. Model, hastalarda r-mTBI'nın önemli özelliklerini çoğaltır ve in vitro elektrofizyoloji ile birlikte kullanılır.

Hafif Travmatik Beyin Hasarının Uyanık Kapalı Kafa Travması Modelini Kullanarak Sinaptik Plastisitedeki Değişikliklerin Değerlendirilmesi

Bu çalışma, akut hiperglisemisi olan C57BL/6 farelerinde orta serebral arter oklüzyonu/reperfüzyonu (MCAO/R) kullanılarak hemorajik dönüşümün (HT) yüksek oranda tekrarlanabilir bir hayvan modelinin oluşturulması için bir protokol sunmaktadır.

Geçici Fokal İskemi ile Kombine Akut Hipergliseminin Neden Olduğu Hemorajik Dönüşümün Bir Fare Modeli

Keşfedin NMDG koruyucu kurtarma yöntemiyle akut beyin dilimleri hazırlamayı. Bu teknik, yetişkin hayvanlardan sağlıklı dilimler elde ederek elektrofizyolojik deneyler için yüksek nöron korunumu sağlar.

En iyi duruma getirilmiş bir Nkullanarak akut beyin dilimleri hazırlanması-metil-D-glucamine koruyucu kurtarma yöntemi

Daha fazla video keşfet