En iyi duruma getirilmiş bir Nkullanarak akut beyin dilimleri hazırlanması-metil-D-glucamine koruyucu kurtarma yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, yama kelepçesi elektrofizyolojisi deneyleri için uygun olan olgun yetişkin hayvanlardan sağlıklı beyin dilimleri hazırlamaktır. Bu nedenle, beyin dilimi hazırlığı için bu optimize edilmiş NMDG Koruyucu Kurtarma Yöntemi, araştırmacıların birçok farklı beyin bölgesinde ve hemen hemen her yaştaki hayvanlar için beyin hücresi tiplerinin içsel ve sinaptik özelliklerini keşfetmelerine olanak tanır. Bu nedenle, bu özel tekniğin ana avantajı, önceki metodolojilere kıyasla daha yüksek derecede nöronal korumaya sahip beyin dilimleri hazırlamaya izin

Ve ayrıca bu beyin dilimleri yama kelepçesi kaydı için daha uygundur. Bu yöntem yetişkin fare beyin dokusu için optimize edilmiştir. Nöroşirürjik olarak rezeke edilmiş insan beyin dokusu dahil olmak üzere çeşitli diğer türler için kullanılabilir.

Bu prosedüre başlamak için, dilimleme istasyonunu doku dilimleyici makinesi ve cerrahi aletlerle kurun. Hızlı yapışkan yapıştırıcı kullanarak bıçak koluna bir zirkonyum seramik enjektör bıçağı takın. Ardından numune tutucuyu yerleştirin ve bıçağın ön kenarını numune tutucu kenarıyla hizalayın.

Bıçağın metali sıyırmamasını sağlamak için küçük bir boşluk bırakın. 250 mililitrelik bir kabı 200 mililitre NMDG HEPES aCSF ile doldurun. Ve 10 dakikadan fazla sürekli karbojenasyon ile buz üzerinde önceden soğutun.

Ardından, 150 mililitre NMDG HEPES aCSF ile doldurarak ilk beyin dilimi kurtarma odasını kurun. Ve odayı 32 ila 34 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin. Bir beyin dilimi tutma odası kurmak için, rezervuarı 450 mililitre HEPES aCSF ile doldurun ve kullanılana kadar sabit karbojenasyon altında oda sıcaklığına ısınmasına izin verin.

Daha sonra, 50 mililitrelik konik bir şişenin açık ucunu kullanarak önceden hazırlanmış tabaktan %2'lik bir agaroz bloğunu keserek doku gömmek için erimiş agaroz hazırlayın. Konik şişeyi gevşek bir şekilde kapatın, ardından agaroz erimeye başlayana kadar 10 ila 30 saniye mikrodalgada pişirin. Aşırı ısıtmayın.

Erimiş agarozu 1,5 mililitrelik tüplere dökün. Kuvvetli bir çalkalama ile 42 santigrat dereceye ayarlanmış bir termomikser kullanarak agarozu erimiş halde tutun. Ve erimiş agarozun erken katılaşmadığından dikkatlice emin olun.

Bu sırada buz üzerinde dilimleyici için aksesuar soğutma bloğunu önceden soğutun. Bu prosedürde, kafatasını ortaya çıkarmak için başın derisi üzerinde bir kesik yapın. Ardından, takkenin üzerindeki deriyi kesmek için ince süper kesilmiş makas kullanın.

Ve kafatasının kaudal ventral tabanının her iki tarafında yanal olarak küçük kesiler yapın. Kafatasının kaudal dorsal yönünden başlayarak, dorsal orta hatta rostral yönde hareket ederek ek sığ kesimler yapın. Altta yatan beyne zarar vermemeye özen gösterin.

Bundan sonra, koku alma ampulleri seviyesinde orta hatta dik olarak son bir T kesimi yapın. Daha sonra, rostral medial yönden başlayarak kafatasını kavramak için yuvarlak uçlu forsepsleri kullanın ve bir tarafta kaudal lateral yöne doğru soyun. Diğer tarafın çatlayarak açılması için bu prosedürü tekrarlayın.

Ve beyni ortaya çıkarmak için kafatası kapağının dorsal yarısını çıkarın. Sağlam beyni, önceden soğutulmuş NMDG HEPES aCSF'nin kabına nazikçe çıkarın. Ve beynin yaklaşık bir dakika boyunca eşit şekilde soğumasına izin verin.

Şimdi, beyni beherden filtre kağıdı ile kaplı Petri kabına aktarmak için büyük bir spatula kullanın. Beyni, tercih edilen dilimleme açısına ve istenen beyin ilgi bölgesine göre kesin ve monte edin. Kullanım sırasında uzun süreli oksijen yoksunluğunu önlemek için hızlı çalışın.

Daha sonra, beyin bloğunu yapışkan yapıştırıcı kullanarak numune tutucuya yapıştırın. Beyin bloğunu tamamen içeri çekmek için numune tutucunun iç parçasını geri çekin. Daha sonra erimiş agarozu, beyin bloğu tamamen agarozla kaplanana kadar doğrudan tutucuya dökün.

Daha sonra, önceden soğutulmuş aksesuar soğutma bloğunu, agaroz katılaşana kadar numune tutucunun etrafına on saniye boyunca sıkıştırın. Numune tutucuyu dilimleme makinesindeki yuvaya yerleştirin ve doğru hizalamayı doğrulayın. Bunu takiben, rezervuarı 250 mililitrelik beherden kalan önceden soğutulmuş oksijenli NMDG HEPES aCSF ile doldurun ve yeterli oksijenasyonu sağlamak için kabarcık taşını dilimleme süresi boyunca rezervuara yerleştirin.

Ardından, agaroz gömülü beyin örneğini ilerletmeye başlamak için mikrometreyi ayarlayın. Dilimleyiciyi başlatın ve ilerleme hızını ve salınım frekansını ampirik olarak istenen seviyeye ayarlayın. İlgilenilen beyin bölgesi tamamen kesilene kadar dokuyu 300 mikrometrelik artışlarla ilerletmeye ve dilimlemeye devam edin.

Dilimleme işlemi için toplam süre 15 dakikadan az olmalıdır. İlk NMDG kurtarma işlemi için. Kesit alma prosedürünün tamamlanmasının ardından, tüm dilimleri bir kesme plastik mera pipeti kullanarak toplayın ve bunları 150 mililitre NMDG HEPES aCSF ile doldurulmuş 34 derecelik bir geri kazanım odasına aktarın.

Akut beyin dilimi kurtarma adımının zamanlaması, morfolojik koruma ile her bir nöronun elektrofizyolojik özelliklerinin fonksiyonel olarak geri kazanılması arasında bir denge kurabilmek için çok önemlidir. Optimal sodyum spike-in programını belirledikten sonra, fare yaşına göre, belirtilen zamanlarda belirtilen hacimlerde sodyum spike-in çözeltisi ekleyerek Step Y sodyum spike-in prosedürünü gerçekleştirin. Hızlı karıştırmayı kolaylaştırmak için sodyum spike-in çözeltisini doğrudan ilk geri kazanım odasının fıskiye bacasına ekleyin.

Çeşitli farklı yaş aralıkları ile sağlanan sodyum spike-in programı gerçekten iyi bir başlangıç noktasıdır. Ancak kendi özel deneysel tasarımınız için optimize edilmeli ve kullanılmalıdır. Daha sonra, tüm dilimleri oda sıcaklığında tutulan HEPES aCSF uzun süreli bekletme odasına aktarın.

Yama kelepçesi kayıt deneylerinden önce dilimlerin HEPES tutma odasında bir saat daha toparlanmasına izin verin. Burada, nöronların morfolojik korunmasının değerlendirilmesi için üç aylık bir fareden alınan çeşitli beyin bölgelerinden ve akut dilimlerden elde edilen temsili IR DIC görüntüleri gösterilmektedir. Burada gösterilen sonuçlar, koruyucu bir geri kazanım adımı olmadan kontrol NMDG koruyucu kesme yönteminin kullanılmasından elde edilmiştir.

Oysa bu sonuçlar optimize edilmiş NMDG koruyucu geri kazanım yönteminden alınmıştır. Genel olarak, optimize edilmiş NMDG koruyucu geri kazanım yöntemi ile gelişmiş nöronal koruma gözlenir. Kademeli sodyum spike-in prosedürü ile optimize edilmiş NMDG koruyucu geri kazanım yöntemi, orijinal NMDG koruyucu geri kazanım yöntemi ile karşılaştırıldı.

GigaOhm conta oluşumu ve yama kelepçesi kaydı için ortalama süre, NMDG koruyucu geri kazanım adımı ile birlikte kademeli sodyum spike-in prosedürü uygulandığında önemli ölçüde ve önemli ölçüde azaldı. Bu beyin dilimi yöntemiyle elde edilen gelişmiş nöron koruması, lokal sinaptik bağlantıyı araştırmak için çok elektrotlu yama kelepçesi elektrofizyolojisi dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere zorlu deneysel uygulamaları kolaylaştırır. Burada gösterildiği gibi, nöroşirürjiden elde edilen yetişkin insan ex vevo neokortikal beyin dilimleri kullanılarak.

Bilim adamları, yama kelepçesi kayıtları için uygun beyin dilimleri hazırlamak için tarif ettiğimiz yeni sodyum spike-in prosedürü de dahil olmak üzere optimize edilmiş NMDG Koruyucu kurtarma yöntemimizin nasıl uygulanacağı hakkında bu videoyu izleyerek iyi bir anlayışa sahip olmalıdır. Bu nedenle, bu protokole hakim olduktan sonra, beyin dilimi prosedürünü her gün bir saatten daha kısa bir sürede tamamlamak mümkün olmalıdır. Ve yüksek kaliteli tekrarlanabilir beyin dilimleri vermeli ve hemen hemen her yaştan hayvan için işe yarayacaktır.

Dolayısıyla bu prosedür, bu yöntem, elektrofizyoloji, canlı optik görüntüleme ve optogenetik, reseptör kaçakçılığı testleri ve beyin hücresi tiplerinin işlevini keşfetmek için diğer fonksiyonel testler gibi teknikleri kullanarak beyin fonksiyonu hakkındaki soruları ele almak için uygun beyin dilimlerinin hazırlanmasına yardımcı olabilir. Bu nedenle, bu teknik aynı zamanda yararlıdır, çünkü araştırmacıların, yetişkin hayvanlardan beyin dilimlerinde yama kelepçe kaydı için geleneksel olarak uygun olmayan beyin bölgeleri de dahil olmak üzere farklı beyin bölgelerini işlevsel olarak inceleyebilmelerine yardımcı olacaktır.