Tahmin ve Gen Düzenleme Elementlerin Doğrulama Retinoik Asit Kaynaklı Embriyonik sırasında Aktif Hücre Farklılaşma Kök

Bu videonun genel amacı, güçlendiriciler olarak adlandırılan geneomik düzenleyici unsurları tanımlamak ve deneysel olarak doğrulamak için entegre bir yöntem seti sağlamaktır. Bu yöntem, güçlendirici seçimi ve kullanımı, hücre farklılaşmasını kullanma veya dış uyaranlara yanıt verme dahil olmak üzere biyolojik olayların transkripsiyonu ve düzenlenmesindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Sunulan iş akışının ana avantajı, bir protokolün herhangi bir hücresel model sisteminde kolayca uyarlanabilmesi ve kullanılabilmesidir.

Prosedürün adımlarını göstereceğim. Başlamak için, önceden var olan çip sıralama analizine dayalı bir aday geliştirici seçin. İstenen çip sıralama deneyinin sonuçlarını görüntülemek için bir genom tarayıcısı kullanın ve ilgilenilen genin yakınındaki bağlanma bölgelerini belirleyin.

Seçilen genomik bölgenin 200-400 baz çifti dizisini elde etmek için Bir İlgi Bölgesi Tanımla'yı seçin ve dizileri sonraki primer tasarımı için kullanın. Standart moleküler biyoloji teknikleriyle, seçilen genomik bölgeyi bir raportör plazmit yapısına çoğaltın ve klonlayın. Arttırıcı aktiviteyi test etmek için, raportör yapılarını önce 48 kuyucuk plakasına oyuk başına 200 mikro litre% 0.1 jelatin çözeltisi ekleyerek kütle embriyonik kök hücrelere dönüştürün.

Kaplamadan önce plakaları 30 dakika inkübe edin. Transfeksiyondan bir gün önce, plaka besleyici içermeyen embriyonik kök veya ES hücreleri, 250 mikro litre ES ortamında, oyuk başına üç kez 10 ila dördüncü hücre yoğunluğunda. Transfeksiyon gününde, plazmit karışımlarını hazırlayın ve her karışımdan sekiz kuyucuk için yeterli olacak şekilde hazırlayın.

Hacmi 106 mikro litreye çıkarmak için her bir plazmit karışımına transfeksiyon kalitesi azaltılmış serum ortamı ekleyin. Daha sonra 4,5 mikro litre ES kalite transfeksiyon reaktifi ekleyin ve 15 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek dikkatlice karıştırın. Transfeksiyon karışımını oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, hücrelere transfeksiyon karışımının oyuğu başına 13 mikro litre ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Ardından, liken tedavisinden önce hücreleri gece boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Transfeksiyon verimliliği kritik bir adımdır.

Başka bir hücre türü kullanılıyorsa, bu adım optimizasyon gerektirir. Bağlama bağlı etkileri en aza indirmek için geliştirici etkinliğini test etmek için en uygun hücre türünü kullanın. Ertesi gün, ortamı aspirasyon ile dikkatlice çıkarın ve bir mikro molar tüm trans retinoik asit veya bir araç olarak DMSO içeren kuyu başına 250 mikro litre taze ortam ekleyin.

Hücreleri 24-48 saat inkübe edin. Metin protokolüne göre lizis tamponu hazırladıktan sonra, ortamı hücrelerden dikkatlice aspire edin. Hücreleri bir kez yükseltmek için 1X PBS kullanın, ardından oyuk başına 200 mikro litre 1X lizis tamponu ekleyin.

Hücreleri oda sıcaklığında iki saat çalkalayın. Daha sonra, tam hücre lizisi için, hücre lizatlarını plakada 80 santigrat derecede dondurun. Lizatları tamamen çözdükten sonra, 80 mikro litre hücre lizatını beta galaktosidaz için 96 iyi berrak plakaya ve 40 mikro litre lizatı lusiferaz ölçümü için beyaz bir plakaya aktarmak için elektronik çok kanallı bir pipet kullanın.

Beta galaktosidazı gerçekleştirmek için, bir mililitre beta gal substrat tamponunu dört miligram OMPG ile karıştırın. Daha sonra, karışıma 3.5 mikro litre beta merkaptoetanol ekleyin ve hemen 80 mikro litre hücre lizatına 100 mikro litre tampon ekleyin. Soluk sarı renk oluşana kadar reaksiyonları 37 santigrat derecede inkübe edin.

Bir plaka okuyucuda 420 nano metrede absorbansı okuyun ve verileri dışa aktarın. Lusiferaz testini gerçekleştirmek için, substrat reaktifini metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, başlamadan önce lusiferaz substrat reaktifini oda sıcaklığına ısıtın. Ardından, 40 mikro litre hücre lizatı içeren beyaz plakanın her bir oyuğuna 100 mikro litre pipetleyin.

Sinyali ölçmek için hemen ışıldayan bir sayaç makinesi kullanın. Aktiviteleri en az üç bağımsız transfeksiyon ve deneyden elde edin. Metin protokolüne göre her iki tahlil için de hesaplamalar yapın.

RTCPR ile eRNA tespiti için primerleri tasarlamak için, herhangi bir açıklamalı gen transkriptinden en az 1,5 ila iki kilo baz uzakta olan bir genomik bölge seçin. Genin göreceli yönünü tanımlayın ve duyu ve anti-anlam transkriptlerinin konumunu belirleyin. Arttırıcı RNA nicelemesi için primerler tasarlamak için, transkripsiyon faktörü bağlanma bölgesinin merkezinden 200-1.000 baz çifti bölgesini seçin.

Gen eksi iplikçikte bulunuyorsa, pozitif iplikçikin 200-300 baz çiftini kopyalayın ve ters kompleman dizisini elde etmek için diziyi dönüştürün. Ardından, sonraki astar tasarımı için bu sırayı kullanın. Ürün Boyutu Aralığını 80-150 baz çifti arasında ayarlayın.

eRNA transkripsiyonunu ölçmek için, metin protokolüne göre tedavi edilen hücrelerden toplam RNA'yı izole ettikten sonra, standart bir prosedür kullanarak RTCPR ile ters kopyalanmış eRNA'yı tespit edin. Normalizasyon için tedaviye bağımlı olmayan bir mRNA'yı ölçün. Burada gösterildiği gibi, retinoik asit ile muamele edilen ES hücrelerinden elde edilen RXR çip dizilimi verilerinin biyoinformatik analizi, RXR işgal edilen bölgeler altındaki nükleer reseptör yarı bölgesinin zenginleşmesini ortaya çıkardı.

Bir biyoinformatik algoritması kullanılarak, yarı site için motif arama sonuçları, RXR çip sıralama verilerine geri eşlendi. Bu analiz, kanonik nükleer reseptör bağlanma bölgeleriyle örtüşen çip zirvelerini tanımladı. IGV'deki sitelerin görselleştirilmesi, Hoxa1'e yakın transkripsiyon faktörlerinin zenginleştiğini gösterdi.

Daha önce karakterize edilmiş bir RAR RXR hedefi. Yeni bir RA hedef zinciri olan PRMT8 için cezalandırıcı bir arttırıcı da tanımlandı. Tanımlanan arttırıcı bölgeler TK lusiferaz raportör vektörüne klonlandı ve ES hücreleri bu yapılarla transfekte edildi.

Lusiferaz aktivitesi RA'nın yokluğunda ve varlığında ölçüldü. RA yanıt elemanını veya RARE'yi içeren yapılar, RA tedavisi üzerine artmış lusiferaz sinyal yoğunluğu gösterirken, RARE içermeyen yapı indüklenmedi. Hoxa1 RAR RXR'ye bağlı arttırıcının duyu ve anti-sens eRNA ekspresyonunun genin mRNA ekspresyonu ile ilişkili olup olmadığını belirlemek için, Hoxa1 eRNA seviyesi de ölçüldü. Sonuçlar, arttırıcı aktivitenin kısa süreli RA tedavisi ile indüklendiğini doğruladı.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu iş yükü, açıklanan geliştirici tuzağı deneyi ve geliştirici nicelemesi gerçekleştirilerek birkaç gün içinde yapılabilir, geliştirici aktivitesi için güçlü işlevsel kanıtlar sağlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, cezalandırıcı arttırıcıları nasıl tanımlayacağınızı ve karakterize edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bir güçlendirici tanımlandıktan ve doğrulandıktan sonra, hangi genin doğrulanmış güçlendirici tarafından düzenlendiği gibi ek önemli soruları yanıtlamak için kromozomal doğrulama yakalama veya CCC gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.