Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, küçük molekül indüksiyonu kullanarak doğrudan ve münhasıran pluripotent insan embriyonik kök hücrelerinden nöronal döl türetmektir. Bu, tanımlanmış koşullar altında tutulan farklılaşmamış hücrelere rettino asit eklenerek elde edilir. Daha sonra, farklılaşma işlemi, hücrelerin nöroblast adı verilen yüzen hücresel kümeler oluşturdukları bir süspansiyon kültüründe ayrılmasıyla devam eder.

Nöroblastın nöro farklılaşma ortamında bir doku kültürü plakasına bağlanmasına izin verilirse, olgun nöronların özelliklerini geliştirirler. Sonuç olarak, rettino asit tedavisinin tedavi edilen insan embriyonik kök hücrelerinin morfolojisi ve belirteç ekspresyonu üzerindeki etkisini göstermek için immünofloresan ve dekonvolüsyon veya konfokal mikroskopi kullanılabilir. Diğer tekniklerde, hücrelerin sadece küçük bir kısmı nöronal bir fenotipi takip ederken, bizim yöntemimiz pluripotent insan embriyonik kök hücrelerinin yalnızca bir nöronal soya doğru iyi kontrollü ve verimli bir şekilde indüksiyonuna izin verir.

Stok çözeltilerini onarırken dikkat edilmesi gereken birkaç adım vardır. Çözülmeyi, matrijeli ve insan lamininini eksi 80 santigrat dereceden dört santigrat dereceye kadar yavaşlatmaya, gece boyunca dört santigrat derecede saklamaya ve kullanmadan önce ortamı her zaman 37 santigrat dereceye kadar ısıtmaya özen gösterin. Ayrıca, insan ESL ortamını hazırlarken, takviyelerin bir kısmı kullanılmadan hemen önce eklenir.

Bunlar arasında BFGF, askorbik asit, A'da aktif olan ve transfer edilen insan insülini bulunur. Ardından, plaka kaplamadan hemen önce matra jeli veya insan laminin çalışma solüsyonlarını yapın. Plakaları 37 derece SIU'da %5 karbondioksit içinde inkübe edin Jelatin önceden kaplanmış doku kültürü plakaları hazırlandıktan sonra.

Jelatin, matrigel veya laminin çalışma çözeltisi ile değiştirilebilir. Bu plakaları gece boyunca dört santigrat derecede inkübe ederek kaplayın. İnsan ES hücre kolonilerinin beş ila yedi gün büyümesine izin vererek başlayın ve ardından bölünmeye hazırlanın.

Bazıları %75'ten fazla olan kolonileri seçerFarklılaşmış insan ES hücreleri altında, genellikle yığılmış hücreler içeren tanımlanmış kenarları kolonilerle hafif opaktırlar. Farklılaşmanın başlangıcının bir göstergesi genellikle beyaz koloniler gibi görünmektedir, çoğunlukla farklılaşmış hücreler içeren genellikle açık görünmektedir. Beyaz veya berrak kolonileri seçmeyin.

Plakaları ışığa doğru tutun ve ana hatlar boyunca plakaların altındaki hafif opak kolonileri çizmek için bir işaretleyici kullanın. Çevredeki fibroblast tabakasını insan ES hücre kolonisinden ayırmak için steril bir P iki pipet ucunun kenarını kullanın. Daha sonra çevredeki fibroblast hücrelerini çıkarın ve ayrıca koloninin tüm farklılaşmış kısımlarını çıkarın.

Şimdi ayrılmış farklılaşmış hücreleri içeren eski ortamı aspire edin. Daha sonra, her kuyucuğun içinde, farklılaşmamış hücreleri BFGF'den yoksun insan E es hücre ortamı ile bir kez yıkayın ve daha sonra B-F-G-F-B-F-G-F içeren üç mililitre taze insan ESL ortamı ekleyin, kullanımdan hemen önce taze ortama eklenir. Şimdi kolonileri küçük parçalara ayırmak ve plakadan ayırmak için steril bir P iki pipet ucu kullanın.

Ayrılan koloni parçalarını ortamlarında 50 mililitrelik konik bir tüpe çekin. Bir tane daha çekin. Mililitre ortam kuyu başına durulayın.

Hücreler artık küçük moleküller kullanarak daha fazla farklılaşmaya hazırdır. Yeni kaplanmış plakaları 37 santigrat dereceye ısıtarak başlayın. Kaplama solüsyonunu plakalardan aspire edin ve her bir oyuğa koloni parçaları içeren dört mililitrelik bir ortam alikotu ekleyin, ardından plakaları sallamadan yavaşça bir inkübatöre aktarın.

Plakaları rahatsız etmeyin, böylece tohumlanmalarına izin verilir. Üç gün boyunca tohumlandıktan sonra, omik asit içeren yeni ortam yapın. Ardından, hücrelerin su altında kalması için yeterli ortam bırakarak eski ortamın çoğunu çıkarın.

Hücrelerin her birinin kurumasına asla izin verilmemelidir. Peki, BFGF ve rettino asidi ile dört mililitre taze insan ES hücre ortamı ekleyin. Ortamı her gün değiştirin ve rettino asidi ile muamele edilmiş insan ES hücre kolonilerinin büyümesine izin verin.

Yedi veya sekiz gün sonra, hücreler büyük farklılaşmış hücrelere morfolojik değişiklikler geçirmiş olacaktır. Daha sonra, bir süspansiyon kültürü yapmak için bir süspansiyon hücre kültürü yapmaya devam edin, ESL kolonilerini kendiliğinden farklılaşmış ve bir fibroblast tabakası oluşturmak üzere göç etmiş hücrelerden ayırarak başlayın. Yukarıda belirtilen tekniği steril bir pipet ucu ile kullanın, ardından yüzen ayrılmış fibroblast hücreleri içeren eski ortamı aspire edin.

Hücreleri HESC ortamıyla bir kez yıkayın ve üç mililitre HESC ortamıyla yeniden süspanse edin. Şimdi steril bir P iki pipet ucu kullanarak. Kolonileri küçük parçalar halinde kesin ve plakadan ayırın.

Ayrılmış kolonilere sahip ortamı 50 mililitrelik tek bir konik tüpe çekin. Kuyuları bir mililitre ortamla durulayın ve durulamayı havuza ekleyin. Daha sonra, havuzlanmış hücrelerin dört mililitresini, dört ila beş gün boyunca altı kuyulu ultra düşük bir bağlantı plakasının her bir oyuğuna alikot edin, plakayı bir inkübatörde tutun.

Bu süre zarfında, nöroblastı daha olgun bir nöronal fenotipe daha da ilerletmek için yüzen hücresel kümeler veya nöroblast oluşacaktır. Bunları içeren ortamı 50 mililitrelik konik bir tüpe çekin. Daha sonra hücreleri beş dakika boyunca 1.400 RPM'de santrifüjleyin.

Aspire edin, mümkün olduğunca eski ortamı tartın ve VEGF N NT three ve BDNF içeren eşit miktarda taze NSC ortamı ekleyin. Hücreleri pipetleme yoluyla bir süspansiyon halinde karıştırın, ardından oyuk başına dört mililitre süspansiyonu altıya bölün. Kuyu doku kültürü plakaları, plakaları 37 santigrat derece nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarır.

Nöroblast, Matrigel'de bir 3D kültür veya nöroblast süspansiyonuna insan laminatı için gece boyunca kültür plakalarına bağlanacaktır. Ve bir 3D matris 37 santigrat derecede polimerize olacaktır. Medyayı iki günde bir değiştirin.

İki hafta içinde, nörit taşıyan nöronal hücrelerin ve pigmentli hücrelerin geniş ağları, rettino asidinin, tanımlanmış kültür sisteminde tutulan insan ES hücrelerini, yalnızca pluripotensten yalnızca bir nöro epidermal fenotipe geçiş yapmaya teşvik etmek için yeterli hale getirdiği ortaya çıkacaktır. Farklılaşmamış insan E es hücrelerinin retinoik aside maruz kalması üzerine, koloni içindeki tüm hücreler, pluripotentlik ile ilişkili belirteç OCT dördünü eksprese etmeyi bırakan büyük farklılaşmış hücrelere morfolojik değişiklikler geçirdi. Hücreler ayrıca HNK bir, a, P iki ve TRKC gibi çeşitli nöroektoderm ilişkili belirteçleri eksprese etmeye başladı.

Bu büyük farklılaşmış hücreler çoğalmaya devam etti ve kolonilerin boyutları kendiliğinden arttı ve erken nöronal belirteç beta üç tübülini eksprese etti. Daha olgun nöronal belirteç haritası iki, hücrelerin yığıldığı koloni bölgelerinde ortaya çıkmaya başladı. Tesadüfen, nöroektodermal hücrelerin ortaya çıkmasıyla, nöronal spesifik transkripsiyon faktörü NER, dopaminerjik nöronal farklılaşmada ve çekirdeğe translokasyonlu tirozin hidroksilaz geninin aktivasyonunda rol oynar.

Ayrılmadan sonra, rettino asitle muamele edilmiş insan ES hücreleri, bazik FGF'nin çıkarılması üzerine bir süspansiyon kültüründe nöroblast oluşturdu ve nöroblastın bir doku kültürü plakasına bağlanmasına izin verdikten sonra, CNS'ye özgü geniş nörit taşıyan nöronal hücre ağları ve pigmentli hücreler, verimlilikte ciddi bir artışla ortaya çıkmaya başladı ve üç ay boyunca kültürlenebildi. Bu insan ES hücresinden türetilmiş nöronal hücreler, rettino asit tedavileri olmadan hücrelerin spontan çok soylu farklılaşmasına kıyasla beta üç tübülini eksprese etti ve birlikte eksprese edilen harita iki Bir kez ustalaştı. Bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse, yaklaşık dört hafta içinde pluripotent insan embriyonik kök hücrelerinden eşit şekilde nöronal hücrelerde nöronal progenitörler oluşturmak için kullanılabilir.

İnsan hücreleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirmeden önce hücre hatlarının patojen ve mikoplazma içermediğinden emin olmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.