İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Yaratılan Endoderm Hücrelerinin Saflaştırılması Hızlı ve Etkin Yöntem

Bu yöntemin genel amacı, insan embriyonik kök veya ES hücrelerinden üretilen endodermal hücreleri saflaştırmaktır. Bu yöntem, kök hücre alanındaki endodermal farklılaşma ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, farklılaşmamış hücrelerin çıkarılmasından sonra saf bir endoderm hücre popülasyonunun elde edilebilmesidir.

Prosedüre başlamadan önce, altı kuyucuklu hücre kültürü plakasını oyuk başına bir mililitre bazal membran matrisi ile kaplayın. Oda sıcaklığında en az 30 dakika. Daha sonra, insan ES hücrelerini hasat etmek için, ortamı steril bir cam Mera pipeti ile %80 ila %90 birleşik insan embriyonik kök hücre kültüründen aspire edin.

Ve hücreleri kuyu başına iki mililitre PBS ile yıkayın. Ölü hücreleri ve kalıntıları çıkarmak için plakayı sallayın ve salini aspire edin. Daha sonra, hücre kümelerini bir mililitre enzim içermeyen geçiş çözeltisi reaktifi ile, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte, hücreler daha küçük kümelere ayrılma belirtileri gösterene kadar nazikçe ayırın.

Yaklaşık yedi dakika sonra, kuyucuklara bir mililitre DMMF12 ortamı ekleyin. Ve kalan hücre agregalarını tek bir hücre süspansiyonuna ayırmak için bir mililitrelik pipet ucuyla birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Aynı pipeti kullanarak, hücreleri bir santrifüj tüpüne aktarın ve kuyucukları bir mililitre taze DMMF12 ortamı ile durulayın, yıkamaları tüpte toplayın.

Hücreleri döndürdükten sonra, peleti ROCK inhibitörü ile takviye edilmiş beş mililitre ES hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri sayın ve apoptozu önlemek için ROCK inhibitörü ile desteklenmiş kültür ortamında bazal membran matris kaplı plakalar üzerindeki oyuk başına 1.5: 4 kez 10 ila beşinci hücreye tohumlayın. Hücreleri yaklaşık 24 saat inkübe edin.

Ardından, her bir oyuktaki ortamı 2 mililitre ilkel çizgi indüksiyon ortamıyla değiştirmek için steril, cam bir Pasteur pipeti kullanın. 24 saat daha kültürden sonra, günlük ortam değişiklikleriyle 48 saatlik bir inkübasyon için ortamı endoderm indüksiyon ortamı ile değiştirin. Kültürün son gününde ve hücrelerin toplanmasından en az bir saat önce, kültür ortamına taze ROCK inhibitörü ekleyin.

Ardından, ortamı her bir kuyucuktan aspire etmek için steril, cam bir Pasteur pipeti kullanın ve hücreleri, az önce gösterildiği gibi enzim içermeyen geçiş çözeltisi reaktifi ile ayırın. Tek hücreli bir süspansiyon elde edildiğinde, hücreleri sayın ve santrifüjleyin. Bu noktadan itibaren, hücrelerin ölmesini önlemek için tüm ortam ve tamponların ROCK inhibitörü içerdiğinden emin olun.

Aksi takdirde, geri çekildikten sonra düzgün şekilde takılmayacaktır. Peletleri, yedinci hücrelere 1 kez 10 kez ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 100 mikrolitre PEB tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra hücrelere CXCR4 APC antikoru ekleyin.

Karıştırmak için tüpü hafifçe vurun. 4 santigrat derecede 15 dakika sonra, hücreleri bir ila iki mililitre PEB tamponunda yıkayın ve süpernatanı aspire etmek için steril, cam bir Pasteur pipeti kullanın. Peletleri 1 kere 10 ila yedinci hücrelere 80 mikrolitre PEB tamponunda yeniden süspanse edin ve hücrelere 20 mikrolitre anti-APC mikro boncuk ekleyin.

Numuneyi hafif bir fiske ile karıştırın. Daha sonra hücreleri 15 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri ROCK inhibitörü ile desteklenmiş bir ila iki mililitre PEB tamponu ile yıkayın.

Ve peleti 500 mikrolitre taze PEB tamponu artı inhibitörü içinde yeniden askıya alın. CXCR4 + hücrelerini manyetik boncuk ayırma ile izole etmek için, orta büyüklükte bir manyetik sütunu uygun boyutta bir mıknatısa yükleyin ve sütunu 500 mikrolitre PEB tamponu artı ROCK inhibitörü ile önceden durulayın. Yıkamanın tamamı kolonun üstünden boşaldığında, manyetik boncuk etiketli hücre hacminin tamamını kolona uygulayın ve akışı konik bir tüpte toplayın.

Kolonu 500 mikrolitre PEB tamponu ve ROCK inhibitörü olmak üzere üç uygulama ile yıkayın. Ardından sütunu mıknatıstan uygun bir toplama tüpüne aktarın. Ve CXCR4 + hücrelerini toplamak için bir mililitre PEB tamponu artı ROCK inhibitörünü kolondan daldırın.

İsteğe bağlı olarak, akıştan geçen numunelerin tümü ayrı ayrı toplanabilir ve akış sitometrisi ile her bir alouetteki CXCR4 + hücrelerinin yüzdesini belirlemek için her numuneden 20 mikrolitre alikot kullanılabilir. Bu prosedür, sütuna bağlanmayan hücreleri toplamak için ilk akışla tekrarlanabilir. Ardından, her iki CXCR4 + örneğini bir araya getirin ve santrifüjleyin.

Son olarak, peleti ROCK inhibitörü ile takviye edilmiş bir mililitre endoderm indüksiyon ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri bir bazal membran matris kaplı hücre kültürü kabında uygun yoğunlukta tohumlayın. Farklılaşmalarından önce, insan ES hücreleri, pluripotens belirteci SOX2'nin yüksek seviyelerini eksprese eder. Oysa kesin endoderm belirteci olan FOXA2 tespit edilmez.

Farklılaşma üzerine, ES hücreleri gen ve protein ekspresyonlarında ciddi değişikliklere uğrar. Gerçekten de, farklılaşma ortamında dört gün sonra, SOX17 ve FOXA2, kesin endoderm bağlılığının bir işareti olan eski ES hücrelerinin çoğunun çekirdeği içinde düzgün bir şekilde birlikte eksprese edilir. Bazı hücreler farklılaşma sürecine direnir ve iki işaretleyici proteinden hiçbirini eksprese etmez.

Ve aslında, pluripotentlik belirteci SOX2 ifadesini koruyun. Bu temsili deneyde, farklılaşmanın üçüncü gününde, hasat edilen ES hücrelerinin yaklaşık% 60'ı, pluripotent ve diğer istenmeyen soy hücrelerinin manyetik boncuk sıralamasından sonra% 85'in üzerine zenginleştirilen CXCR4'ü eksprese etti. Saflaştırılmış CXCR4 + hücrelerinin tohumlanmasından sonra, tohumlanan hücrelerin çoğunluğu FOXA2 eksprese eden sadece birkaç SOX2 + hücresi tespit edilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa iki saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü takiben, farklılaşma süreciyle ilgili ek soruları yanıtlamak için immün histokimya veya QPCR gibi başka testler de yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, manyetik boncuk sıralama ile endoderm hücrelerinin nasıl saflaştırılacağını iyi anlamış olmalısınız.