Name: İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Yaratılan Endoderm Hücrelerinin Saflaştırılması Hızlı ve Etkin Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Keşfedin, insan embriyonik kök hücrelerinden endoderm hücrelerini manyetik boncuk ayırma ile saflaştırma yöntemini. Bu teknik, saf hücre popülasyonu elde ederek kök hücre araştırmalarını ve rejeneratif tıp uygulamalarını geliştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jasmin Kresse usta teknik yardım minnetle kabul edilmektedir.

Kesin endoderm doğru İnsan ESC 1. Farklılaşma <ol><li> 37 ° C&#39;de bir kuluçka insan embriyonik kök hücreleri (ESCs) yetiştirmek ve% 5 CO2. </li><li> Coat bazal membran matris 1 ml yeni 6 oyuklu hücre kültürü plakasının ve oda sıcaklığında en az 30 dakika süre ile kültür eşya inkübe edin. Belirli ayrıntılar için ilgili üreticinin talimatlarına çevirmek lütfen. </li><li> Kültürlü insan EKH (örneğin, 4X) düşük büyütme kullanılarak mikroskop altında% 80 -90% confluency ulaşmış emin olun. steril cam Pasteur pipetiyle orta kapalı emerek boşluklardan gelen orta aspire. Fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi ile bir kez hücreler yıkanır. Bunun için, usulca her kuyuya 2 ml PBS eklemek plaka sallamak ve ölü hücreleri ve hücre enkaz kaldırmak için çözüm emmek. </li><li> hücre kümeleri nazik ayrışması için enzim içermeyen pasajlama çözüm reaktif 1 ml ekleyin. 37 ° C, bir hücreleri inkübed% 5 CO 2 hücreleri küçük kümeler halinde bozulma net işaretler göstermek kadar. NOT: İnkübasyon süresi kullanılan reaktif bağlıdır. malzemeler bölümünde belirtilen enzim içermeyen pasajlama çözümü için, kuluçka süresi yaklaşık 7 dk. </li><li> 1 mi DMEM / F-12 ortamı ilave edin ve pipetleme ve 1 ml pipet ucu kullanarak aşağı tek bir hücre içine kalan hücre birikintisinin yok. yüzey hücreleri temizleme ve bir santrifüjleme tüp hücreleri aktarmak için kullanın. Tüm hücreler almak için, DMEM / F-12 ortamı, 1 ml her bir yıkama ve santrifüj tüpüne orta ekleyin. </li><li> g x 300, 5 dakika boyunca hücreler santrifüj. Süpernatant aspire ve 10 uM, Rho-kinaz (rock) inhibitörü içeren 5 ml ES hücre kültürü ortamında tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> hemasitometre kullanarak mikroskop altında hücrelerin sayısı ve 150.000 tohum - kullanılan ES hücre hattı bağlı, 6-kuyu başına ya da başka bir plaka taslağına 400.000 hücreleri. Kullanım cul37 ° C ve% 5 CO2 seviyesinde apoptozu ve kültür, bir kuluçka makinesi içinde hücreleri önlemek için orta ihtiva eden 10 uM ROCK inhibitörü Ture. </li><li> Yaklaşık 24 saat steril cam Pasteur pipet ile orta aspirat tohumlama ve ilkel çizgi indüksiyon orta 2 ml ekleyin sonra. NOT: Bu ortam Gelişmiş RPMI-1640 ortamı içinde% 1 glutamin,% 0.2 FCS, 5 uM CHIR-99.021 ve 50 ng / ml, aktivin A&#39;nın nihai konsantrasyonlar içerir. Genel olarak, 6 oyuklu plakalar içinde kültivasyonu için ortam 2 ml kullanın. </li><li> 48 saat tohumlama sonra, indüksiyon orta endoderm için orta yerine. Günlük bir değiştirilen ortam içinde bir 48 saat daha, bu ortam içinde hücrelerin kültive edilmesi. NOT: Bu ortam Gelişmiş RPMI-1640 ortamı içinde% 1 glutamin,% 0.2 FCS ve 50 ng / ml aktivin A ihtiva etmektedir. Kesin endoderm doğru kararlıyız Hücreler yüzey işaretleyici CXCR4 ifade eder. CXCR4&#39;ün boyama DE-işlenen hücrelerin sayısını belirlemek için kullanılabilir. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Sitometrisi Analizi CXCR4 + Kesin Endoderm Hücrelerinin boyanması <ol><li> hasat öncesi son 24 saatte, ancak en az 1 saat süre ile hücre kültür ortamına 10 uM ROCK önleyici. </li><li> Kat yani bazal membran matrisi ile yeniden oluşturma, kullanılacak hücre kültürü ürünleri, immünofloresan boyama qPCR analiz veya oda slaytlar 12 oyuklu plakalar. Oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca plakaları veya slaytlar inkübe edin. </li><li> boyama ve / veya sıralama için kullanılan farklılaşmış hücrelerin kuyulardan steril cam Pasteur pipet ile orta aspire. </li><li> hücre kümeleri nazik ayrışması için enzim içermeyen pasajlama çözüm reaktif 1 ml ekleyin. Hücreler küçük kümeler halinde bozulma net belirtileri göstermeye kadar CO 2 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri ve% 5. NOT: İnkübasyon süresi kullanılan reaktif bağlıdır. Bakır Aynalar belirtilen enzim içermeyen pasajı çözümü içinals bölümü, kuluçka süresi yaklaşık 7 dk. </li><li> 1 ml DMEM / F-12 orta ekleyin ve yukarı pipetleme ve 1 ml ucunu kullanarak aşağı tek hücre içine hücre agrega kalan bozabilir. yüzey hücreleri temizleme ve bir santrifüjleme tüp hücreleri aktarmak için kullanın. Tüm hücreler almak için, / FCS O W, DMEM / F-12 ortamı, 1 ml her bir yıkama ve santrifüj tüpüne orta ekleyin. </li><li> hemasitometre kullanarak mikroskop altında hücreleri saymak. 6 yuvalı plaka üç kuyu hücre farklılaşmasının üç gün sonra 10-15 x 10 6 hücre ile sonuçlanmalıdır. g x 300, 5 dakika boyunca hücreler santrifüj. Not: Elde edilen hücreler tam sayısı ayırımında kullanılan pluripotent hücre hattına bağlıdır. </li><li> Süpernatant aspire ve 10 uM ROCK inhibitörü içeren PEB tampon içinde tekrar süspansiyon hücreleri. 10&#39;a kadar 7 hücreleri, bu tampon 100 ul kullanın. staini gününde 10 uM ROCK inhibitörü eklemeng. (PEB tamponu + UR olarak anılacaktır) tüm alt uygulamalar için bu tampon kullanın. NOT: PEB tamponu,% 0.5 BSA ve PBS içinde 2 mM EDTA içermektedir. daha fazla hücre lekeli isteniyorsa, buna göre tampon seviyesini ayarlamak. </li><li> Bu kabaca 1:10 seyreltme temsil 100 ul 10 7 hücre başına bir CXCR4-APC antikoru 10 ul ekleyin. NOT: Bir APC bağlı antikor kullanımı zorunlu değildir. Bunun yerine kullanılan mikro-bağlı ikame edilebilir. daha fazla hücre lekeli gerekiyorsa buna göre antikor seviyesini ayarlamak. </li><li> hafifçe parmak boru çevirerek karıştırın ve 15 dakika boyunca bir buzdolabında 4 ° C&#39;de inkübe edin. 1-2 ml PEB tamponu ile tekrar süspansiyon hücreleri. g x 300, 5 dakika boyunca hücreler santrifüj. </li><li> Steril cam Pasteur pipetle süpernatant aspire ve 10 7 hücre başına 80 ul PEB hücre pelletini ve 20 ul anti-APC mikroboncukları ekleyin. NOT: </sdaha fazla hücre lekeli isteniyorsa trong&gt;, buna göre mikro boncuk ses seviyesini ayarlamak. </li><li> hafifçe parmak boru çevirerek karıştırın ve 15 dakika boyunca bir buzdolabında 4 ° C&#39;de inkübe edin. 1-2 ml PEB tamponu + RI ile hücreleri tekrar süspansiyon. g x 300, 5 dakika boyunca hücreler santrifüj. tampon aspire. 500 ul PEB tamponu + RI içinde süspanse. </li></ol> CXCR4&#39;ün + Hücreleri 3. Manyetik Ayırma <ol><li> üretim talimatlarına göre bir manyetik alan içinde orta büyüklükte bir manyetik sütun yerleştirin. 500 ul PEB tamponu + RI ile sütun ön durulayın. sütun tüm hücre süspansiyonu uygulayın. kolona bağlanacağı şekilde tüm hücreler akışı toplamak. Emin CXCR4 + hücreler optimum alımı için sütunları rahatsız etmemek olun. </li><li> sütun 500 ul PEB tamponu + RI ile üç kez yıkayın. üzerinden ilk akışını toplamak ve Adım 3.1 toplanan hücreler ile birleştirmek. manyetik alan manyetik sütun çıkarın ve koyunUygun toplama tüpü. kolona 1 mi PEB tamponu + RI ekleyin. Hücreler sıkıca sütuna pistonu bastırın Zehir için. </li><li> İsteğe bağlı: ayrı ayrı örnekler üzerinden tüm akışını toplamak ve akım sitometri kullanarak CXCR4 + hücrelerin sayısını analiz etmek 20 ul her kullanın. Onların sayısı her yıkama adımda düşüş gerekir. NOT: En az 2 x 10 4 canlı, kapı hücreler güvenilir sonuçlar için sayılmalıdır. </li><li> Tekrarlayın Adım 3.1 numune boyunca toplanan akışı ve yeni bir sütun kullanarak adım 3.2 numune boyunca ilk akışı ile 3.1-3.3 adımları tekrarlayın. Do not önceki sütun yeniden kullanın. piston havası kullanılarak bloke sütunun içine bastırılır. </li><li> hemasitometre kullanarak mikroskop altında hücreleri saymak. 6 x 10 6 hücre farklılaşma kadar etkinliğine bağlı olarak, ilk kriteri ve işlem 10 7 hücreleri kullanıldığında, ikinci bir kolon kullanılarak bir 1 x 10 6 hücre olabilir. </li&gt; <li> 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücreleri Santrifüj. Süpernatant aspire ve steril bir cam Pasteur pipetle ve ek 10 uM ROCK inhibitörü ile Adım 1.9 1 ml endoderm indüksiyon ortamı hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> hemasitometre kullanarak mikroskop altında hücreleri saymak. Uygun bir yoğunlukta hücreler Tohum, yani ~ 12 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu başına 4 x 10 5 hücre (app. 3.6 cm2 yüzey) ya da ~ 8 oyuklu odacık sürgünün oyuk başına 1.5 x 10 5 hücre. </li></ol> 4. İsteğe bağlı: Arıtılmış Kesin Endoderm Nüfus Analizi <ol><li> immünofloresan boyama kabaca 24 saat kesin endoderm (DE) ve / veya Pluripotency işaretleyici proteinleri% 4 formaldehit ve leke tohumlama sonra Adım 3.7 saflaştırılmış hücreleri düzeltmek. Not: Genellikle kullanılan DE belirteçler FOXA2 ve SOX17 arasında, yaygın olarak kullanılan pluripotense belirteçleri OCT3 / 4, Nanog ve Sox2 6, 8 bulunur. </li><li> foR RT-qPCR analizi, doğrudan ya da 24 saat sonra tohumlama saflaştırılmış hücreler hasat Toplam RNA çıkarmak ve çıkarılan toplam RNA örneklerinden cDNA ters transkribe. DE ve pluripotense işaretçi genler 6, 8 ekspresyonunu analiz etmek için RT-qPCR reaksiyon (kopyaların) cinsinden kalıp olarak 10 ng cDNA kullanın. Not: Genellikle kullanılan marker genleri Aşama 4.1&#39;de bahsedilmektedir. Döngü koşulları eğrisi analizi eriterek, ardından 95 ° C&#39;de 5 dakika ve 95 ° C&#39;de 15 saniye 40 döngü, 60 ° C&#39;de 1 dakika, bulunmaktadır. </li></ol>

<ol><li>Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Highly+Purified+Cardiomyocytes+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Small+Molecule-modulated+Differentiation+and+Subsequent+Glucose+Starvation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
<li>Sgodda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+hepatic+differentiation+strategies+for+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Improved hepatic differentiation strategies for human induced pluripotent stem cells.</a> Curr Mol Med. 13 (5), 842-855 (2013).</li>
<li>Naujok, O., Burns, C., Jones, P. M., Lenzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-producing+surrogate+beta-cells+from+embryonic+stem+cells%3A+are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Insulin-producing surrogate beta-cells from embryonic stem cells: are we there yet.</a> Mol Ther. 19 (10), 1759-1768 (2011).</li>
<li>Katsirntaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+sublineage+specification+of+pluripotent+stem+cells%3A+effect+of+dexamethasone+plus+cAMP-elevating+agents+and+keratinocyte+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar sublineage specification of pluripotent stem cells: effect of dexamethasone plus cAMP-elevating agents and keratinocyte growth factor.</a> Tissue Eng Part A. 21 (3-4), 669-682 (2015).</li>
<li>Abranches, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+embryonic+stem+cells+in+vitro%3A+a+road+map+to+neurogenesis+in+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of embryonic stem cells in vitro: a road map to neurogenesis in the embryo.</a> PLoS One. 4 (7), e6286(2009).</li>
<li>Naujok, O., Diekmann, U., Lenzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+definitive+endoderm+from+human+embryonic+stem+cells+is+initially+independent+from+activin+A+but+requires+canonical+Wnt-signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">The generation of definitive endoderm from human embryonic stem cells is initially independent from activin A but requires canonical Wnt-signaling.</a> Stem Cell Rev. 10 (4), 480-493 (2014).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).</li>
<li>Diekmann, U., Lenzen, S., Naujok, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reliable+and+efficient+protocol+for+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+into+the+definitive+endoderm+based+on+dispersed+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">A reliable and efficient protocol for human pluripotent stem cell differentiation into the definitive endoderm based on dispersed single cells.</a> Stem Cells Dev. 24 (2), 190-204 (2015).</li>
<li>Kim, P. T., Ong, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+definitive+endoderm+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Results+Probl+Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Differentiation of definitive endoderm from mouse embryonic stem cells.</a> Results Probl Cell Differ. 55, 303-319 (2012).</li>
<li>Katoh, M., Katoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomic+analyses+of+CXCR4%3A+transcriptional+regulation+of+CXCR4+based+on+TGFbeta%2C+Nodal%2C+Activin+signaling+and+POU5F1%2C+FOXA2%2C+FOXC2%2C+FOXH1%2C+SOX17%2C+and+GFI1+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomic analyses of CXCR4: transcriptional regulation of CXCR4 based on TGFbeta, Nodal, Activin signaling and POU5F1, FOXA2, FOXC2, FOXH1, SOX17, and GFI1 transcription factors.</a> Int J Oncol. 36 (2), 415-420 (2010).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+signaling+through+TGFbeta+family+members+and+WNT+regulates+patterning+and+pancreatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Development. 138 (5), 861-871 (2011).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+functional+islets+capable+of+treating+pre-existing+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice.</a> Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).</li>
<li>Bruin, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+and+function+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+in+macroencapsulation+devices+following+transplant+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice.</a> Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).</li>
<li>Fu, W., Wang, S. J., Zhou, G. D., Liu, W., Cao, Y., Zhang, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+undifferentiated+cells+during+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Residual undifferentiated cells during differentiation of induced pluripotent stem cells in vitro and in vivo.</a> Stem Cells Dev. 21 (4), 521-529 (2012).</li>
<li>Hentze, H., Soong, P. L., Wang, S. T., Phillips, B. W., Putti, T. C., Dunn, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratoma+formation+by+human+embryonic+stem+cells%3A+evaluation+of+essential+parameters+for+future+safety+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies.</a> Stem Cell Res. 2 (3), 198-210 (2009).</li>
<li>Herberts, C. A., Kwa, M. S., Hermsen, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+in+the+development+of+stem+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Risk factors in the development of stem cell therapy.</a> J Transl Med. 9, 29(2011).</li>
<li>Naujok, O., Kaldrack, J., Taivankhuu, T., Jörns, A., Lenzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+removal+of+undifferentiated+embryonic+stem+cells+from+differentiation+cultures+through+HSV1+thymidine+kinase+and+ganciclovir+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Selective removal of undifferentiated embryonic stem cells from differentiation cultures through HSV1 thymidine kinase and ganciclovir treatment.</a> Stem Cell Rev. 6 (3), 450-461 (2010).</li>
<li>Pan, Y., Ouyang, Z., Wong, W. H., Baker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+FACS+approach+isolates+hESC+derived+endoderm+using+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new FACS approach isolates hESC derived endoderm using transcription factors.</a> PLoS One. 6 (3), 17536(2011).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Şu anda kullanılan farklılaşma protokolleri nadiren% 100 farklılaşmış hücrelerin neden. hala ele alınması gereken nedenlerden dolayı bazı hücreler farklılaşma sürecini karşı. kullanılan farklılaşma protokolünün verimlilik ve ESC eğilimi bağlı kalan pluripotent hücrelerin belirli bir sayıda yaygın, hatta kesin endoderm içine farklılaşma sonra gözlenir hattı. Bunlar artık hücreler gibi transkriptomik, proteomik ve miRNA ifade analizi olarak aşağı farklılaşmaları veya daha fazla analiz bozabilir. Kalıntı pluripotent hücrel...

embriyonik kök hücrelerin (ESCs) halinde pluripotent kök hücreleri, insan vücudunun hemen hemen herhangi bir hücre türü ayırt etmek yeteneğine sahiptir. Bu nedenle, in vitro farklılaşma protokolleri, kardiyomiyositlerde 1, hepatositler 2, beta hücreleri 3 akciğer epitelyal 4 ya da nöronal hücrelerin 5 gibi çok sayıda yetişkin hücre türleri oluşturmak için de kullanılabilir. Bu ESCS çeşitli dejeneratif hastalıkların 3 potansiyel tedavisi için değerli bir araç sağlar. Akciğer, karaciğer ve pankreas yetişkin dokularda doğru EKH in vitro farklılaşma kesin endoderm (DE) 6 andıran hücreleri içine bir sözde Gastrulasyon gerektirir. Bahsedilen somatik hücre tiplerinin üzerinden aşağı doğru farklılaşma önemli ölçüde daha az etkili olduğu için, optimal bir endoderm farklılaşma 7 oran-sınırlayıcı olarak kabul edilir. endoderm soy doğru kararlıyız Hücreler cha geçmesigen ekspresyon profili Karakteristik değişir. Pluripotensin ana düzenleyici genler aşağı düzenlenir gibi 9. CXCR4 Smad2 tarafından Transaktive bilinmektedir FOXA2, SOX17, HNF1B GATA aile üyeleri ve CXCR4 yüksek 6 yukarı düzenlenen bir yüzey reseptörü, 8, diğer transkripsiyon faktörleri salınımı / 3, bağlı, destekleyici bölgesi 10&#39;da spesifik bağlanma sitelerine düğüm / TGF-β sinyalizasyon ve SOX17 aşağı doğru. Böylece raporları 6, 8, 11-13, bir dizi kullanılan çok uygun bir belirtecidir. Bu sentezleme değişiklikler ESCs ilk ilkel bir çizgi-benzeri hücre popülasyonunun özelliklerini kazanmak ve daha sonra endoderm tohumu tabaka 6 olarak tamamlama olan bir sözde-Gastrulasyon etkinliği yansıtmaktadır. Birkaç hücre farklılaşma sürecine karşı veya diğer istenmeyen soyları 14 doğru ayırt edilebilir Ancak, farklılaşma protokolleri nadiren% 100 etkilidir. Bu hücreler, negatif ha olabilirnce ileri farklılaşma. Ayrıca, artık farklılaşmamış hücreler daha sonra transplantasyon deneyler için büyük riskler barındıran ve teratom 15-17 sebebiyet verebilir. Erken yüzey işaretleyici CXCR4 DE 18 doğru işlenen hücrelerin saflaştırılması için de kullanılabilir, bu istenmeyen hücreleri çıkarmak için. Burada, DE farklılaşma kültürlerinden CXCR4 + hücreleri pozitif seçim için bir yöntem tarif eder. Bunun için, yüzey işaretleyici CXCR4 daha sonra da manyetik mikro boncuklar bağlanan bir antikor ile bağlıdır. FACS sıralama sırasında zorlu koşullarda farklı olarak, manyetik olarak etiketlenmiş DE-benzeri hücreler, daha sonra kolayca hafif bir saflaştırma yöntemi kullanılarak bir tezgah üstü bir biçimde saflaştırılabilir. Bu protokol, DE farklılaşma sürecine karşı hücre popülasyonlarının çıkarılması için basit bir yöntem sağlar.

<table><tbody><tr><td>Hues8 insan embriyonik kök hücre hattı</td><td>Harvard Kök hücre ve rejeneratif biyoloji</td><td></td> Bölümü <td>Endoderm üretimi için uygun hücre hattı</td></tr><tr><td>Hes3 insan embriyonik kök hücre hattı</td><td>ES Cell International</td><td></td><td>Endoderm üretimi için uygun ve sağlam hücre hattı</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5850</td><td>ESC kültür ortamı</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biowest</td><td>S1860</td><td></td></tr><tr><td>Gelişmiş RPMI 1640</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>CD184 (CXCR4)-APC, insan</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-357</td><td></td></tr><tr><td>anti-APC MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>OctoMACS Ayırıcı</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>manyetik alan</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td>ROCK inhibitörü</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14</td><td></td></tr><tr><td>Nazik Hücre Ayrışması Reaktifi</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>7174</td><td>Enzim içermez pasaj çözümü, alternatif: Tripsin/EDTA</td></tr><tr><td>Matrigel*</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>bazal membran matrisi * -80 °C'de alikotlarda çözün ve saklayın; C, tedarikçi kılavuzunda belirtildiği gibi. Kullandıktan sonra buz üzerinde çözdürün, 25 ml buz gibi nakavt DMEM/F-12. 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 1 ml ekleyin ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Matrijeli çıkarın ve hemen kullanın. </td></tr><tr><td>MS Sütunları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>30-042-201</td><td></td></tr><tr><td>MACS Ayırıcı</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>İnsan FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>İnsan FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsan GSC FW gaggagaaagtgggggtctggtt</td><td>Hayat Teknolojiler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsan GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOX17 TaqMan tahlili</td> İnsan <td>Hs00751752_s1</td><td></td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td></tr><tr><td>SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsan SOX7 REV7 REV tgcgcggccggtacttgtag</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsan POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsan POU5F1 REV ctgcagtgtgggtttcgggca</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsan Nanog FW ccgagggcagacatcatcc</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsan Nanog REV ccatccactgccacatcttct</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsan TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsan TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsan TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsan TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g Yaşam</td><td>Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsan G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsan G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t </td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-17320</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FOXA2</td><td>MerckMillipore</td><td>07-633</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX17</td><td>R& D Sistemleri</td><td>AF1924</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan embriyonik kök hücreleri yaratılan endoderm hücrelerinin saflaştırılması hızlı ve etkin yöntem

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

embriyonik kök hücrelerin (ESCs) halinde pluripotent kök hücrelerin farklılaşması yetenekleri hücre yenileme terapisi için potansiyel bir terapötik uygulama sağlar. Terminal olarak farklılaşmış hücre türleri., Çeşitli dejeneratif hastalıkların tedavisinde kullanılan, akciğer, karaciğer ve pankreas dokularında karşı bu hücrelerin in vitro farklılaşma, bir birinci basamak olarak kesin endodermal hücrelerinin üretilmesini gerektirir edilebilir. Bu adım, oran-sınırlayıcı insülin üreten beta hücrelerinin hepatositlere ya da diğer endoderm türetilmiş hücre türleri terminal olgun hücre tipleri yönünde daha fazla türev içindir. endoderm soy doğru kararlıyız Hücreler çok böyle FOXA2, SOX17, HNF1B GATA aile üyeleri ve yüzey reseptörü CXCR4 olarak transkripsiyon faktörlerinin çok sayıda ifade eder. Ancak, farklılaşma protokolleri nadiren% 100 etkilidir. Burada, farklılaşma sonra CXCR4 + hücre popülasyonunun saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadırManyetik mikroboncuklarm kullanarak DE içine. Bu saflaştırma ek istenmeyen soy hücreleri ortadan kaldırır. yumuşak bir saflaştırma yöntemi, hızlı ve güvenilir olduğu ve aşağı doğru uygulamalar ve farklılaşmaları geliştirmek için kullanılabilir.

farklılaşma üzerine EKH gen ve protein ekspresyonu köklü değişim geçirirler. 1 başarılı endoderm farklılaşmasını kontrol etmek için kullanılabilecek tipik marker genleri tasvir etmektedir. Bir gen ekspresyon analizi için ana hedeflerdir GSC, FOXA2 ve SOX17 bulunmaktadır. Farklılaşmamış EKH karşılaştırıldığında göreceli gen ekspresyon analizi, özellikle FOXA2 ve SOX17&gt; 2.000 kat artmıştır....

Burada, alt uygulamalar ve diğer farklılıklar iyileştirilmesi için kesin endoderm doğru kararlı farklılaştırılmış insan embriyonik kök hücrelerinin saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır.

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Yaratılan Endoderm Hücrelerinin Saflaştırılması Hızlı ve Etkin Yöntem

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Bu yöntemin genel amacı, insan embriyonik kök hücrelerinden (ES hücreleri) türetilen endodermal hücreleri saflaştırmaktır. Bu yöntem, kök hücre alanında endodermal farklılaşma ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, farklılaşmamış hücrelerin uzaklaştırılmasının ardından saf bir endoderm hücre popülasyonu elde edilebilmesidir.Prosedüre başlamadan önce, altı kuyucuklu hücre kültür plakalarının her bir kuyucuğunu bir mililitre bazal membran matriksi ile kaplayın. Oda sıcaklığında en az 30 dakika bekletin. Ardından, insan ES hücrelerini toplamak için, %80 ila %90 konfluens düzeyindeki bir insan embriyonik kök hücre kültüründeki besiyerini steril bir cam Pasture pipeti ile aspire edin.Ardından, her kuyucuktaki hücreleri iki mililitre PBS ile yıkayın. Ölü hücreleri ve kalıntıları uzaklaştırmak için plakayı sallayın ve salini aspire edin. Daha sonra, hücreler daha küçük kümelere ayrılma belirtileri gösterene kadar, 37 °C ve %5 karbondioksit altında, bir mililitre enzim içermeyen pasajlama çözeltisi reaktifi ile hücre kümelerini nazikçe ayrıştırın.Yaklaşık yedi dakika sonra, kuyucuklara bir mililitre DMMF12 medyumu ekleyin. Kalan hücre agregatlarını tek hücreli bir süspansiyona dönüştürerek ayırmak için bir mililitrelik pipet ucuyla birkaç kez yukarı-aşağı pipetleme yapın. Aynı pipeti kullanarak hücreleri bir santrifüj tüpüne aktarın ve kuyucukları bir mililitre taze DMMF12 medyumu ile durulayarak yıkama sıvılarını tüpte toplayın.Hücreler santrifüjle çöktürüldükten sonra, peleti ROCK inhibitörü ile takviye edilmiş beş mililitre ES hücre kültür ortamında yeniden süspande edin. Hücreleri sayın ve apoptozu önlemek için ROCK inhibitörü ile takviye edilmiş kültür ortamında, bazal membran matrisi ile kaplanmış plakaların her kuyucuğuna 1,5-4 × 10⁵ hücre ekleyin. Hücreleri yaklaşık 24 saat boyunca inkübe edin.Ardından, her kuyucuktaki besiyerini 2 mililitre primitif çizgi indüksiyon besiyeri ile değiştirmek için steril, cam bir Pasteur pipeti kullanın. 24 saatlik ek kültürleme süresinden sonra, besiyerini günlük besiyeri değişimleri ile 48 saatlik bir inkübasyon için endoderm indüksiyon besiyeri ile değiştirin. Kültürün son gününde ve hücreleri hasat etmeden en az bir saat önce, kültür besiyerine taze ROCK inhibitörü ekleyin.Ardından, her bir kuyucuktaki besiyerini aspire etmek için steril, cam bir Pasteur pipeti kullanın ve hücreleri, az önce gösterildiği gibi enzim içermeyen pasajlama çözeltisi reaktifi ile disosiye edin. Tek hücre süspansiyonu elde edildiğinde, hücreleri sayın ve santrifüjleyin. Hücrelerin ölmesini önlemek için bu noktadan itibaren tüm besiyeri ve tamponların ROCK inhibitörü içerdiğinden emin olun.Aksi takdirde, geri çekildikten sonra düzgün bir şekilde tutunmayacaklardır. Peleti, 1 × 10⁷ hücre başına ROCK inhibitörü eklenmiş 100 µL PEB tamponu içinde yeniden süspande edin. Ardından hücrelere CXCR4 APC antikoru ekleyin.Karıştırmak için tüpe hafifçe vurun. 4 °C'de 15 dakika bekledikten sonra, hücreleri bir ila iki mililitre PEB tamponu ile yıkayın ve süpernatantı aspire etmek için steril, cam bir Pasteur pipeti kullanın. Peleti, 1 × 10⁷ hücre başına 80 µL PEB tamponu ile yeniden süspanse edin ve hücrelere 20 µL anti-APC mikroboncuk ekleyin.Numuneyi hafifçe vurarak karıştırın. Ardından hücreleri 4 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri ROCK inhibitörü eklenmiş 1-2 mL PEB tamponu ile yıkayın.Ardından peleti, 500 µL taze PEB tamponu artı inhibitör içerisinde yeniden süspande edin. CXCR4+ hücreleri manyetik boncuk ayrıştırması ile izole etmek için, orta boy bir manyetik kolonu uygun boyuttaki bir mıknatısa yerleştirin ve kolonu 500 µL PEB tamponu artı ROCK inhibitörü ile ön yıkamadan geçirin. Yıkama sıvısının tamamı kolonun üst kısmından süzüldüğünde, manyetik boncuklarla işaretlenmiş hücre hacminin tamamını kolona uygulayın ve süzüntüyü konik bir tüp içerisinde toplayın.Kolonu, 500 µL PEB tamponu ve ROCK inhibitörü ile üç kez yıkayın. Ardından kolonu mıknatıstan uygun bir toplama tüpüne aktarın. CXCR4+ hücreleri toplamak için kolonun içinden 1 mL PEB tamponu ve ROCK inhibitörü geçirin.İsteğe bağlı olarak, tüm akış örnekleri ayrı ayrı toplanabilir ve her örnekten alınan 20 µL'lik alikotlar, akış sitometrisi ile her alikottaki CXCR4+ hücrelerin yüzdesini belirlemek için kullanılabilir. Kolona bağlanmayan hücreleri toplamak için bu işlem ilk akışla tekrarlanabilir. Ardından, her iki alikot CXCR4+ örneği birleştirilip santrifüj edilir.Son olarak, peleti ROCK inhibitörü ile desteklenmiş bir mililitre endoderm indüksiyon ortamında yeniden süspande edin ve hücreleri uygun yoğunlukta, bazal membran matriksi ile kaplanmış bir hücre kültürü kabına ekimleyin. Diferansiyasyon öncesinde, insan ES hücreleri yüksek düzeyde plüripotens markörü SOX2 eksprese eder. Buna karşın, definitif endoderm markörü FOXA2 tespit edilmez.Diferansiyasyon üzerine, ES hücreleri gen ve protein ekspresyonlarında köklü değişikliklere uğrar. Nitekim, diferansiyasyon ortamında dört gün geçirdikten sonra, eski ES hücrelerinin çoğunun çekirdeklerinde SOX17 ve FOXA2 uniform olarak birlikte eksprese edilir ki bu durum, definitif endoderm taahhüdünün karakteristik bir özelliğidir. Bazı hücreler, iki marker proteinin hiçbirini eksprese etmeyerek diferansiyasyon sürecine direnç gösterir.Ve aslında, pluripotensi belirteçleri olan SOX2 ekspresyonlarını korurlar. Bu temsili deneyde, diferansiyasyonun üçüncü gününde, toplanan ES hücrelerinin yaklaşık %60'ı CXCR4 eksprese etmiştir; pluripotent ve diğer istenmeyen lineage hücrelerinin manyetik boncukla ayıklanmasının ardından bu saflık %85'in üzerine çıkarılmıştır. Purifiye edilmiş CXCR4+ hücrelerin ekilmesinden sonra, yalnızca birkaç SOX2+ hücre tespit edilmiş, ekilen hücrelerin çoğunluğu ise FOXA2 eksprese etmiştir.Bu teknik bir kez kavrandığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde iki saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından, farklılaşma süreci hakkında ek soruları yanıtlamak için immünohistokimya veya QPCR gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, manyetik boncuk ayıklama ile endoderm hücrelerinin nasıl saflaştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

a-quick-efficient-method-for-purification-endoderm-cells-generated

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Insan embriyonik kök hücrelerin kendi kendini yenilemek ve vücudun tüm hücre tipleri içine ayırt yeteneği ve geliştirme ve hastalık temel sorulara yanıt için bir araştırma aracı olarak hem tıbbi uygulamalar için çok ümit vericidir. Burada, embriyoların iç hücre kütlesinden immunosurgical izolasyonu ile insan embriyonik kök hücrelerin derivasyon için bir özlü, adım adım protokolü sağlar.

Immunosurgery İnsan Embriyonik Kök Hücreleri türetilmesi

Bu makale, insan embriyonik kök hücre popülasyonlarının insan hepatik endoderm üretimi üzerinde durulacaktır.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Popülasyonlar Hepatosit gibi Hücreleri Sağlam Nesil

Geçiş kültürlere besleyici-özgür koşullarda devam eden çabalarına rağmen, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve türetme ve kültürü fare embriyonik besleyiciler (MEFS) ile işbirliği kültürler büyük oranda bağımlı kalır. Burada, biz hızla öncesi deneylere hESC kültürlerden besleyiciler kaldırmak için yeni bir metodoloji göstermektedir.

Yüksek Yoğunluklu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürleri gelen Rapid Fibroblast Kaldırma

Monoklonal antikorlar TG30 (CD9) ve GCTM-2'nin floresan aktif hücre sıralama (FACS) yoluyla hücre yüzeyi antijenlerinin kombine tespiti için pozitif seçim kullanılarak canlı insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC) tanımlanması ve zenginleştirilmesi ve ayrıca hESC'lerin karışık hücre popülasyonundan arındırılması için negatif seçimin kullanılmasını açıklıyoruz.

Monoklonal Antikorlar TG30 ve GCTM-2 Kullanılarak Hücre Yüzey Antijenlerinin Tespiti ile İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Zenginleştirilmesi ve Temizlenmesi

Bu protokol verimli hava yolu epitel hücreleri olgun fare embriyonik kök hücre kaynaklı kesin endoderm yönlendirir. Bu farklılaşma tekniği tanımlanmış bir serum içermeyen kültür ortamında, akciğer soy özellikleri doğrudan 3 boyutlu hücresizleştirilmiş akciğer iskeleleri kullanır.

Decellularized Akciğer Yapı iskeleleri kullanarak ESC türetilmiş Fare Havayolu Epitel Hücreleri Üretimi

Insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) farklılaştırmak ve farklı doku kalıpları içine kendini organize içsel yeteneği var; Bu mekansal çevre geçişlerini sunulmasını gerektirir rağmen. Biz hPSC farklılaşma desenleri kontrol etmek için biyokimyasal ve mekanik geçişlerini oluşturmak için basit ve sağlam bir yöntem olarak şablon micropatterning sunuyoruz.

Farklılaşma Fates Mekansal Organizasyonu Probing İnsan pluripotent kök hücrelerin Stencil micropatterning

Burada sunulan insan embriyonik kök hücrelerinin tek hücreli kültür ve nöral progenitor hücrelere sonraki farklılaşma için bir protokoldür. Protokol basit, sağlam, ölçeklenebilir ve ilaç tarama ve rejeneratif tıp uygulamaları için uygundur.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Tek Hücre Kültürünü Kullanarak Etkin Nöral Farklılaşma

Bu makalede, hESC farklılaşması sırasında Activin A ve CHIR99021'in kesin endoderm (DE) olarak sürekli olarak takviye edilmesiyle insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC' ler) fonksiyonel hepatosit benzeri hücrelere (HLC) farklılaştırılması için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Yönlendirilmiş Hepatosit Benzeri Hücre İndüksiyonu İçin Etkili Bir Yöntem

Besleyici hücrelerde kültürlenen insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC'ler) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC'ler) enzimatik veya mekanik geçişiyle ilişkili sınırlamalardan kaçınmak için, EDTA aracılı yapışma bozukluğu kullanılarak insan sünnet derisi fibroblastlarının besleyici hücre tabakasında tutulan hESC veya hiPSC kolonilerinin toplanması için hızlı, etkili, uygun maliyetli, yüksek verimli bir yöntem oluşturduk.

İnsan pluripotent kök hücrelerinin besleyici hücreler üzerinde etilendiamintetraasetik asit aracılı yapışma ile hızlı, uygun maliyetli, enzimsiz geçişi

Mevcut protokol, hafif sitotoksisiteye sahip CD3-/CD45+CD56+ hücrelerinin, hem 3D hem de 2D kültür koşulları altında insan genişlemiş potansiyel kök hücrelerinden (hEPSC'ler) nasıl ayırt edileceğini göstermektedir. Bu, karmaşık mikro çevrenin tahrip edilmeden rutin fenotipik doğrulamaya izin verir.

İnsan Genişletilmiş Potansiyel Kök Hücrelerden Doğal Öldürücü Hücrelerin Üretilmesi

Bu protokol, hızlı ve tekrarlanabilir endodermal hepatik organoidlerin (eHEPO'lar) oluşumunu tanımlar. Bu protokol ile eHEPO'lar 2 hafta içinde üretilebilmekte ve farklılaşma ve işlevselliklerini kaybetmeden uzun vadede (1 yıldan fazla) genişleyebilmektedir.

Fonksiyonel Endodermal Hepatik Organoidlerin Üretimi

Keşfedin, insan embriyonik kök hücrelerinden endoderm hücrelerini manyetik boncuk ayırma ile saflaştırma yöntemini. Bu teknik, saf hücre popülasyonu elde ederek kök hücre araştırmalarını ve rejeneratif tıp uygulamalarını geliştirir.

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Yaratılan Endoderm Hücrelerinin Saflaştırılması Hızlı ve Etkin Yöntem

Daha fazla video keşfet