Name: Mikro Disseke Fare Koroid Pleksuslarından İmmün Hücrelerin İzolasyonu ve Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Öğrenin fare koroid pleksuslarından immün hücre izolasyonu ve akış sitometrisi ile karakterizasyon yöntemini. Bu protokol beyin homeostazındaki makrofaj ve T-hücre popülasyonlarını incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Institut Pasteur Animalerie Centrale'ye ve CB-UTechS tesis üyelerine yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Institut Pasteur tarafından finansal olarak desteklenmiştir.

Tüm prosedürler, laboratuvar hayvanlarının taşınmasına ilişkin Avrupa Komisyonu yönergeleri, 86/609/EEC sayılı direktif ile aynı fikirdedir. 59 No'lu etik kurullar, CETEA/CEEA No. 089 tarafından, dap210067 ve APAFIS #32382-2021070917055505 v1 numarası altında onaylanmıştır.
1. Malzemelerin hazırlanması
<ol><li>Tüm antikorları (Malzeme Tablosu) ışığa maruz kalmaktan korunarak 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>DAPI stok çözeltisi (1 mg / mL): Tozu PBS -/- (Malzeme Tablosu), aliquot içinde yeniden askıya alın ve -20 ° C'de saklayın.</li>
	<li>DAPI çalışma çözeltisi (0,1 mg/mL): DAPI stok çözeltisini PBS-/- ile 1:10 oranında seyreltin.</li>
	<li>Manyetikle aktive edilmiş hücre ayıklama (MACS) tamponu: PBS-/- içinde 2 mM etilen diamin tetraasetik asit (EDTA) ve% 0.5 sığır serum albümini (BSA) (Malzeme Tablosu) hazırlayın.</li>
	<li>Kollajenaz IV stok çözeltisi (20 U / μL): Tozu PBS +/+ (Malzeme Tablosu), alikot içinde yeniden askıya alın ve -20 ° C'de saklayın. NOT: Kollajenaz IV, MgCl2'nin tamamen aktif olmasını gerektirir; Kollajenaz IV solüsyonunu dondurup çözmeyin.</li>
	<li>Anestezik-analjezik çözelti: 1 mL PBS-/- içinde 150 μL ketamin (150 mg/kg), 25 μl ksilazin (5 mg/kg) ve 330 μl buprecare (0.1 mg/kg) karışımı. NOT: Anestezik-analjezik solüsyonu zamansız olarak hazırlayın ve bir günden fazla tutmayın.</li>
	<li>Heparin çözeltisi (100 U/mL): Tozu PBS-/- içinde yeniden askıya alın.</li>
	<li>PBS-/- ile doldurulmuş bir dekanter Erlenmeyer'e bir tüp bağlayan infüzyon giriş sistemini hazırlayın. İnfüzyon tüpünün ekstremitesine 23 G'lik bir iğne bağlayın. İnfüzyon girişini açın ve PBS'nin tüpte kabarcık kalmayana kadar çalışmasına izin verin.</li>
	<li>Bir ışıkla donatılmış dürbün büyüteç hazırlayın.</li>
</ol>2. C57BL/6 farelerin muhafazası
<ol><li>CP miyeloid veya T hücrelerinin analizi için, her biri için dört fare kullanın ve dört CP'yi bir araya getirin (her lateral ventrikülden iki, üçüncü ventrikül ve dördüncü ventrikül CP; toplamda sekiz fare için). SP'nin havuzlanmaması, düşük bollukları nedeniyle SP'deki nadir immün popülasyonları tespit edememe riskini taşır.</li>
	<li>Herhangi bir deneyden önce farelerin en az 7 gün iklimlendirmesine izin verin. Fareleri patojensiz koşullar altında sabit sıcaklık ve nemde, 12/12 saat veya 14/10 saat açık / karanlık döngüsünde, su ve standart pelet gıda ad libitum ile tutun.</li>
</ol>3. PBS perfüzyonu ve beyin diseksiyonu
<ol><li>Her fareyi ağırlıklandırın ve intraperitoneal olarak 10 μL / g anestezik-analjezik karışım çözeltisi (adım 1.6) enjekte edin.</li>
	<li>Etkili analjezi için yaklaşık 30 dakika bekleyin (farenin rakamlarını sıkıştırarak anestezi derinliğini kontrol edin).</li>
	<li>Anestezi uygulanan fareyi sırt üstü yassı, diseksiyon desteğinin üzerine yerleştirin ve avuç içlerini diseksiyon desteğine bantlayın.</li>
	<li>Hayvanın derisini forseps ile sıkıştırarak ve makas kullanarak, kalbi açığa çıkarmak için karnı, diyaframı ve toraksı açın. NOT: Toraks açıldığında, beyin anoksik hale gelir. Perfüzyonun sonraki adımlarında kesin ve hızlı bir şekilde ilerlenmelidir.</li>
	<li>20 μL 100 U/mL heparin solüsyonunu doğrudan sol ventriküle enjekte edin.</li>
	<li>İnce makasla, kanın vücuttan dışarı akmasına izin vermek için sağ atriyumda en az 3 mm'lik bir kesi yapın.</li>
	<li>Hemen sonra, infüzyon tüpünün ekstremitesine yerleştirilen 23 G iğneyi sol ventrikülün ucundan yerleştirin.</li>
	<li>İnfüzyon sistemini maksimumda açın ve tam perfüzyon için bekleyin: 23 G'lik bir iğne kullanarak, yaklaşık 6 mL / dak'lık bir akış hızında, perfüzyon 3 dakikada tamamlanır. NOT: Karaciğer gibi organların eşit renk değişikliği, perfüzyon etkinliğini kanıtlar.</li>
	<li>İnfüzyon sistemini kapatın ve iğneyi kalp ventrikülünden çıkarın.</li>
	<li>Bandı farenin avuçlarından çıkarın. Fareyi ventral konuma getirin.</li>
	<li>Hayvanın derisini forseps ile sıkıştırmak ve makas kullanmak, başın üst kısmının derisini gözlerden kulaklara kadar çıkarın.</li>
	<li>Makas yardımıyla, kafatasını önce gözler arasında, sonra da her bir gözden maseter kaslarının hemen üstündeki omuriliğe yanal olarak kesin. Bunun için makas ekstremitesini kullanın ve beyne makasla zarar vermemek için yavaşça ilerleyin.</li>
	<li>Kafatasını forseps ile gözler arasındaki ekstremiteden sıkıştırarak açın.</li>
	<li>Omuriliği kesmek ve beyni forsepslerle çıkarmak için makas kullanın, iki noktasını beynin yan tarafına yerleştirerek eğin ve buz gibi soğuk PBS + / + ile dolu bir Petri kabına yerleştirin. CP daha sonra derhal toplanır. NOT: Perfüzyon etkinliğini doğrulamak için beynin renk değişikliğini kontrol edin.</li>
</ol>4. Koroid Pleksusun beyinden diseksiyonu
<ol><li>Beyin sırt tarafını Petri kabında yukarı ve dürbün büyüteçlerinin hedeflerinin altına yerleştirin.</li>
	<li>Beyni yerinde tutmak için forseps yardımıyla, başka bir forsepsin iki ucunu yarımküreler arasındaki orta çizgiden aşağıya yerleştirin.</li>
	<li>Kallozum ve hipokampus ile korteksi septumdan uzaklaştırmak, lateral ventrikülü ve üçüncü ventrikülün bir kısmını açığa çıkarmak için forsepsleri kullanın.</li>
	<li>Lateral SP'yi, her iki ucunda parlayan lateral ventrikülü kaplayan uzun bir örtü olarak tanımlayın. Yanal SP'yi yakalamak için ince bir forsepsin iki ucunu kullanın. hipokampusun arka kıvrımı tarafından gizlenebilecek üçgen arka kısmı toplamaya dikkat edin.</li>
	<li>Korpus kallozum ve kontralateral yarımkürenin hipokampüsü ile korteksi septumdan uzağa çekerek üçüncü ventrikülün tamamını ve karşı lateral ventrikülü açığa çıkarın.</li>
	<li>İnce forsepslerle, granüler yüzey yönüne sahip kısa bir yapı olarak tanımlanabilen üçüncü CP'yi toplayın.</li>
	<li>Diğer lateral SP'yi toplayın.</li>
	<li>Forsepsin iki ucunu beyincik ve orta beyin arasına yerleştirin. Dördüncü ventrikülü ortaya çıkarmak için beyinciği pons ve medulladan ayırın.</li>
	<li>Dördüncü SP'yi, dördüncü ventrikülü lateral sağ uçtan sol uca serebellum ve medulla arasında hizalayan granüler bir yüzey yönüne sahip uzun küresel bir yapı olarak tanımlayın. Dördüncü CP'yi ince forsepslerle toplayın. NOT: Forsepslerin silan bazlı kaplaması, forsepslerde CP'nin yapışmasını önleyebilir.</li>
	<li>Diğer yedi farenin her biri için 3.1-4.9 arasındaki adımları yineleyin. Bu arada, toplanan CP geçici olarak buz üzerine yerleştirilmiş bir tüp içinde tutulabilir.</li>
</ol>5. Akış sitometrisi analizi için numunelerin hazırlanması
<ol><li>Tüm disseke CP'yi içeren tüpü 750 μL PBS+/++ ile doldurun. NOT: Disseke SP'nin tüp içinde ince forseps ile birikmesi, küçük bir PBS +/++ hacmi getirir. CP dokusunun olası bir kaybını önlemek için mevcut hacmi 750 μL'ye kadar çıkarın ve taze 750 μL PBS + / + ile değiştirin.</li>
	<li>400 U/mL nihai konsantrasyon için 15 μL 20 U/μL Kollajenaz IV stok çözeltisi ekleyin (bkz. adım 1.5). NOT: DNAse I (150 μg / mL) aşırı hücre kümelenmesini önleyebilir.</li>
	<li>CP'yi Kollajenaz IV ile 37 °C'de hafif ajitasyon (300 RPM) altında 45 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>CP ayrışmasını tamamlamak için yaklaşık 10 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipet çekin.</li>
	<li>Kollajenaz IV aktivitesini durdurmak için CP tüpünü MACS tamponuyla 1,5 mL'ye kadar doldurun (tarif adım 1.4'e bakın). NOT: Kollajenaz IV aktivitesi düşük sıcaklıkta durdurulur ve serum albümini tarafından inhibe edilir.</li>
	<li>Hücreleri 500 x g'da, 5 dakika boyunca, 4 ° C'de santrifüj edin. Süpernatantı atın ve hücreleri 1,5 mL MACS tamponu ile yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri 500 x g'de 5 dakika boyunca, 4 ° C'de santrifüj edin. Süpernatantı atın ve hücreleri 220 μL MACS tamponunda yeniden askıya alın.</li>
	<li>10 μL'lik bir alikotu lekesiz kontrol olarak kullanılacak hücre süspansiyonundan ayırın (bir sonraki adım 5.18).</li>
	<li>DAPI-mono-boyalı kontrol olarak kullanılacak hücre süspansiyonundan 10 μL'lik bir aliquot'u ayırın (bir sonraki adım 5.12).</li>
	<li>Spesifik olmayan Fc aracılı etkileşimleri engellemek için kalan 200 μL'yi anti-fare CD16/CD32 bloke edici antikor (1:100) ile 4 °C'de 20 dakika boyunca önceden inkübe edin.</li>
	<li>Hücreleri iki adet 100 μL tüpe bölün (biri miyeloid hücre analizi, diğeri T hücreleri analizi için) (sonraki adım 5.14).</li>
	<li>DAPI-mono-boyalı kontrol için numuneyi 10 μL hücre ile alın (adım 5.9) ve MACS tamponu ile 100 μL'ye kadar doldurun (sonraki adım 5.14).</li>
	<li>Antikor mono-boyalı (adım 5.14.4) ve tamamen lekeli kontroller (adım 5.14.5) için 100 μL MACS içeren on bir yeni tüp hazırlayın ve her birine bir damla kompanzasyon boncuğu ekleyin. NOT: Kompanzasyon kontrolleri, floresan algılama lazerinin voltajının ayarlanmasına izin verecek ve diğer kanallardaki floresan boyanın potansiyel spesifik olmayan sinyal algılamasını değerlendirecektir.</li>
	<li>Numunelerin antikor inkübasyonu:<ol>
<li>Miyeloid örnek: 0,1 mg/mL DAPI (1:100) ekleyin (bkz. adım 1.3), FITC fare karşıtı CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 fare karşıtı CD11b (1:100), APC fare karşıtı CX3CR1 (1:100), BV711 fare karşıtı Ly6C (1:100), PE fare karşıtı F4/80 (1:100) ve APC-Cy7 fare karşıtı IA-IE (1:100) ekleyin.</li>
		<li>T hücreleri örneği: 0,1 mg/mL DAPI (1:100), FITC fare karşıtı CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 fare karşıtı CD11b (1:100), APC fare karşıtı TCRβ (1:100), PE fare karşıtı CD8a (1:100) ve APC-Cy7 fare karşıtı CD4 (1:50) ekleyin.</li>
		<li>DAPI-mono-boyalı kontrol (adım 5.12'den itibaren): 0.1 mg/mL DAPI (1:100) ekleyin.</li>
		<li>Antikor mono-boyalı kompanzasyon boncukları: Miyeloid ve T hücreleri örnekleri için daha önce kullanılan dokuz antikorun her birini (aynı seyreltme), ayrı ayrı (her tüp için bir tane) boncukları içeren dokuz tüpe ekleyin. NOT: Tek lekeli kompanzasyon kontrolleri, kompanzasyon adımı sırasında kullanılan floresan işaretleyicilerin her biri için pozitif floresan piklerinin belirlenmesine izin verecektir. Analizör bunları lekesiz kontrol CP hücrelerinde gözlenen negatif sinyalle karşılaştıracaktır.</li>
		<li>Antikor tüm boyalı kompanzasyon boncukları: Miyeloid boyama için kullanılan tüm antikorları bir tüpe ve T hücrelerinin boyanması için kullanılanları bir başkasına ekleyin. NOT: Tamamen lekeli kompanzasyon kontrolleri, her floresan lazer algılamanın voltajının ayarlanmasına izin verecek ve diğer kanallardaki floresan boyanın potansiyel spesifik olmayan sinyal algılamasını değerlendirecektir.</li>
		<li>Buzda 30-45 dakika kuluçkaya yatıştırın, ışığa maruz kalmaktan koruyun.</li>
	</ol></li>
	<li>1,5 mL'ye kadar olan tüm tüpleri MACS tamponuyla doldurun. Hücreleri ve kompanzasyon boncuklarını 500 x g'da, 5 dakika boyunca, 4 ° C'de santrifüj edin.</li>
	<li>Süpernatantı atın ve hücreleri yıkayın ve boncukları 1,5 mL MACS tamponunda toplayın.</li>
	<li>Hücreleri ve kompanzasyon boncuklarını 500 x g'da, 5 dakika boyunca, 4 ° C'de santrifüj edin. Süper natantı atın.</li>
	<li>Hücreleri yeniden askıya alın ve boncukları 500 μL MACS tamponunda telafi edin. MACS tamponuyla 500 μL'ye kadar lekesiz kontrolü (adım 5,8) doldurun.</li>
	<li>Her tüpü CP hücreleri ile 70 μm'lik bir süzgeçten (lekesiz CP, DAPI mono-boyalı kontrol ve miyeloid ve T hücre örnekleri) filtreleyin.</li>
</ol>6. Akış sitometrisi
NOT: Bu protokolde kullanılan akış sitometresi aşağıdaki 5 lazerle donatılmıştır: 355 nm UV lazer, 405 nm Menekşe lazer, 488 nm Mavi lazer, 561 nm Sarı-Yeşil lazer ve 637 nm Kırmızı lazer.
<ol><li>Analizler, cihaz kalitesi ve tutarlı hedef floresan yoğunlukları arasında tutarlılık sağlamak için sitometre kurulumunu, izleme (CST) arayüzünü ve CST kontrol boncuklarını kullanarak sitometre üzerinde günlük kalite kontrol kontrollerini gerçekleştirin.</li>
	<li>Akış sitometrisi deneyini ayarlamak için, iki değişkenli grafikler ve histogramlarla yeni bir deney oluşturun. Edinimi izlemek için her renk için bir ileri dağılım alanı (FSC-A) ve yan dağılım alanı (SSC-A) grafiklerinin yanı sıra histogram grafiklerinin de dahil edildiğinden emin olun.</li>
	<li>Lekesiz kontrol CP hücrelerinde FSC-A ve SSC-A parametreleri için PMT voltajını ayarlayarak hücre morfolojisini tanımlayın.</li>
	<li>Her floresan işaretleyicinin voltajlarını, lekesiz kontrol CP hücreleri üzerindeki florokromların negatif piklerini ve tüm antikorlarla boyanmış kompanzasyon boncuklarını kullanarak florokromların pozitif piklerini ayarlayarak ve dedektör sinyallerinin ölçek dışı olmamasını ve diğer kanallarda çok güçlü bir şekilde çapraz algılanmamasını sağlayarak tanımlayın.</li>
	<li>Tek renkli ücret denetimlerinin her birini çözümlemek için bir ücret matrisi oluşturun. Uygun FSC-A/SSC-A popülasyonlarına geçiş yaptıktan sonra, histogram grafiklerinde tek lekeli kontrolleri kontrol edin ve telafi kontrollerini kaydedin. Tüm tek lekeli örnekleri kaydettikten sonra, kompanzasyon matrisini hesaplayın.</li>
	<li>Hem miyeloid hem de T hücre popülasyonları için tespit edilen tüm olayları kaydedin.</li>
</ol>7. CP miyeloid hücre geçidi
<ol><li>FSC-A ve SSC-A ve hücreler için geçit (boyuta göre) seçeneğini belirleyin.</li>
	<li>FSC-A ve ileri dağılım yüksekliği (FSC-H) ile tek hücreler için bir alt kapı oluşturun.</li>
	<li>DAPI+ hücrelerini dışlamak için DAPI ve FSC-A ile canlı hücreler için bir alt kapı oluşturun.</li>
	<li>CD45 ve FSC-A ile CD45+ bağışıklık hücreleri için bir alt kapı oluşturun.</li>
	<li>CD45+ hücrelerinden bir alt kapı oluşturun ve CD11b ile F4/80 arasındaki farkı seçin, aşağıdaki iki grubu tanımlayın: CD11b+ F4/80+ ve CD11b+ F4/80- popülasyonları (sonraki adım 7.8).</li>
	<li>CD11b+ F4/80+ hücreleri için bir alt kapı oluşturun ve CX3CR1 ve IA-IE'yi seçin. CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+ BAM ve CX3CR1+ IA-IE- makrofajları olarak adlandırılan CX3CR1+ IA-IE+ BAM'ı tanımlayın.</li>
	<li>CD11b+ F4/80+ CX3CR1+ IA-IE- makrofajları için bir alt kapı oluşturun ve F4/80 ile CD11b'yi seçin. CD11bhigh F4/80intermediate ve CD11b+ F4/80high popülasyonlarını tanımlayın ve bunlar daha sonra CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- Kolmer'in epipleksus makrofajları ve CD11b+ F4/80high CX3 olarak adlandırılır CR1+ IA-IE- BAM, sırasıyla. NOT: CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- ve CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE- hücreleri, F4/80intermediate-F4/80high ve CD11bhigh-CD11b+ seviyeleri arasında biraz karışık görünüyordu.</li>
	<li>CD11b + F4/80- popülasyonundan (adım 7.5), Ly6C ve IA-IE için kapı. Hem IA-IE+ Ly6C- popülasyonunu hem de esas olarak monositlere/nötrofillere karşılık gelen IA-IE+ Ly6C+ hücrelerini seçin. NOT: IA-IE- Ly6C + hücrelerinin yüksek varlığı, muhtemelen enflamatuar bir durum olmadan hayvanların perfüzyon etkinliğindeki sorunları yansıtır; bollukları düşük olmalıdır.</li>
	<li>CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- popülasyonu için bir alt kapı oluşturun ve CD11b ve CX3CR1'i seçin, CD11bhigh CX3CR1low ve CD11b+ CX3CR1- popülasyonlarını tanımlayın.</li>
</ol>8. CP T hücreleri geçidi
<ol><li>FSC-A ve SSC-A ve hücreler için geçit (boyuta göre) seçeneğini belirleyin.</li>
	<li>FSC-A ve ileri dağılım yüksekliği (FSC-H) ile tek hücreler için bir alt kapı oluşturun.</li>
	<li>DAPI+ hücrelerini dışlamak için DAPI ve FSC-A ile canlı hücreler için bir alt kapı oluşturun.</li>
	<li>CD45 ve FSC-A ile CD45+ bağışıklık hücreleri için bir alt kapı oluşturun.</li>
	<li>CD45+ hücrelerinden bir alt kapı oluşturun ve TCRβ ile CD11b'yi seçin. CD11b+ miyeloid hücreleri hariç tutun ve TCRβ+ CD11b- T hücreleri popülasyonunu seçin.</li>
	<li>TCRβ+ CD11b- popülasyonu için bir alt kapı oluşturun ve CD4 ile CD8a'yı seçin. Hem CD8- CD4+ T hücrelerini hem de CD8+ CD4-T hücrelerini tanımlayın.</li>
</ol>

<ol><li>Morais, L. H., Schreiber, H. L., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota-brain+axis+in+behaviour+and+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).</li>
<li>Deczkowska, A., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neuro-immune+communication+in+neurodegeneration%3A+Challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting neuro-immune communication in neurodegeneration: Challenges and opportunities.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (11), 2702-2704 (2018).</li>
<li>Croese, T., Castellani, G., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+compartmentalization+for+brain+surveillance+and+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune cell compartmentalization for brain surveillance and protection.</a> Nature Immunology. 22 (9), 1083-1092 (2021).</li>
<li>Erny, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+microbiota+constantly+control+maturation+and+function+of+microglia+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Host microbiota constantly control maturation and function of microglia in the CNS.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 965-977 (2015).</li>
<li>Mrdjen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+single-cell+mapping+of+central+nervous+system+immune+cells+reveals+distinct+myeloid+subsets+in+health%2C+aging%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease.</a> Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).</li>
<li>Korin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((single-cell+characterization+of+the+brain%27s+immune+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">single-cell characterization of the brain's immune compartment.</a> Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).</li>
<li>van Hove, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+mouse+brain+macrophages+reveals+unique+transcriptional+identities+shaped+by+ontogeny+and+tissue+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment.</a> Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).</li>
<li>Ajami, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+reveals+distinct+populations+of+brain+myeloid+cells+in+mouse+neuroinflammation+and+neurodegeneration+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models.</a> Nature Neuroscience. 21 (4), 541-551 (2018).</li>
<li>Wolburg, H., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus%3A+Biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus: Biology and pathology.</a> Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).</li>
<li>Dani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+and+spatial+map+of+the+choroid+plexus+across+brain+ventricles+and+ages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages.</a> Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).</li>
<li>Falcão, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+path+from+the+choroid+plexus+to+the+subventricular+zone%3A+Go+with+the+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The path from the choroid plexus to the subventricular zone: Go with the flow.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, (2012).</li>
<li>Shipley, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+calcium+dynamics+and+immune+surveillance+at+the+choroid+plexus+blood-cerebrospinal+fluid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface.</a> Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).</li>
<li>Mazucanti, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+insulin+produced+by+the+choroids+plexis+is+regulated+by+serotonergic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Release of insulin produced by the choroids plexis is regulated by serotonergic signaling.</a> JCI Insight. 4 (23), (2019).</li>
<li>Baruch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging-induced+type+I+interferon+response+at+the+choroid+plexus+negatively+affects+brain+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function.</a> Science. 346 (6205), 89-93 (2014).</li>
<li>Deczkowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mef2C+restrains+microglial+inflammatory+response+and+is+lost+in+brain+ageing+in+an+IFN-I-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mef2C restrains microglial inflammatory response and is lost in brain ageing in an IFN-I-dependent manner.</a> Nature Communications. 8 (1), (2017).</li>
<li>Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+niche+signals+from+the+choroid+plexus+regulate+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).</li>
<li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+glymphatic+pathway+function+promotes+tau+pathology+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury.</a> Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).</li>
<li>Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system%3A+From+development+to+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: From development to aging.</a> Current Topics in Developmental Biology. 71, 1-52 (2005).</li>
<li>da Mesquita, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aspects+of+meningeal+lymphatics+in+ageing+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease.</a> Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).</li>
<li>Schwarze, E. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+%28Kolmer%27s%29+epiplexus+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The origin of (Kolmer's) epiplexus cells.</a> Histochemistry. 44 (1), 103-104 (1975).</li>
<li>Baruch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS-specific+immunity+at+the+choroid+plexus+shifts+toward+destructive+Th2+inflammation+in+brain+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CNS-specific immunity at the choroid plexus shifts toward destructive Th2 inflammation in brain aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (6), 2264-2269 (2013).</li>
<li>Kunis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-%CE%B3-dependent+activation+of+the+brain%27s+choroid+plexus+for+CNS+immune+surveillance+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">IFN-γ-dependent activation of the brain's choroid plexus for CNS immune surveillance and repair.</a> Brain. 136 (11), 3427-3440 (2013).</li>
<li>Prinz, M., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+brain+macrophages+in+the+molecular+age%3A+From+origin+to+neuropsychiatric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia and brain macrophages in the molecular age: From origin to neuropsychiatric disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 300-312 (2014).</li>
<li>Goldmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fate+and+dynamics+of+macrophages+at+central+nervous+system+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">fate and dynamics of macrophages at central nervous system interfaces.</a> Nature Immunology. 17 (7), 797-805 (2016).</li>
<li>Fung, I. T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+group+2+innate+lymphoid+cells+alleviates+aging-associated+cognitive+decline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation of group 2 innate lymphoid cells alleviates aging-associated cognitive decline.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (4), (2020).</li>
<li>Kertser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosteroid+signaling+at+the+brain-immune+interface+impedes+coping+with+severe+psychological+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress.</a> Science Advances. 5, 4111(2019).</li>
<li>Shechter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+beneficial+M2+macrophages+to+injured+spinal+cord+is+orchestrated+by+remote+brain+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus.</a> Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).</li>
<li>Yang, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+brain+and+choroid+plexus+cell+types+in+severe+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of brain and choroid plexus cell types in severe COVID-19.</a> Nature. 595 (7868), 565-571 (2021).</li>
<li>Baruch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+immune+checkpoint+blockade+reduces+pathology+and+improves+memory+in+mouse+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">PD-1 immune checkpoint blockade reduces pathology and improves memory in mouse models of Alzheimer's disease.</a> Nature Medicine. 22 (2), 135-137 (2016).</li>
<li>Baruch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+immune+tolerance+by+targeting+Foxp3%2B+regulatory+T+cells+mitigates+Alzheimer%27s+disease+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Breaking immune tolerance by targeting Foxp3+ regulatory T cells mitigates Alzheimer's disease pathology.</a> Nature Communications. 6, 7967(2015).</li>
<li>Rodríguez-Rodríguez, N., Flores-Mendoza, G., Apostolidis, S. A., Rosetti, F., Tsokos, G. C., Crispín, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-%CE%B1%2F%CE%B2+CD4+%E2%88%92+CD8+%E2%88%92+double+negative+T+cells+arise+from+CD8+%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">TCR-α/β CD4 − CD8 − double negative T cells arise from CD8 + T cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 108 (3), 851-857 (2020).</li>
<li>Schafflick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+profiling+of+CNS+border+compartment+leukocytes+reveals+that+B+cells+and+their+progenitors+reside+in+non-diseased+meninges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell profiling of CNS border compartment leukocytes reveals that B cells and their progenitors reside in non-diseased meninges.</a> Nature Neuroscience. 24 (9), 1225-1234 (2021).</li>
<li>Quintana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNGR-1%2B+dendritic+cells+are+located+in+meningeal+membrane+and+choroid+plexus+of+the+noninjured+brain%5BTitle%5D)+AND+%22GLIA%22%5BJournal%5D)">DNGR-1+ dendritic cells are located in meningeal membrane and choroid plexus of the noninjured brain.</a> GLIA. 63 (12), 2231-2248 (2015).</li>
<li>Kabashima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+for+evaluation+of+mast+cell+and+basophil+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biomarkers for evaluation of mast cell and basophil activation.</a> Immunological Reviews. 282 (1), 114-120 (2018).</li>
<li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li>
<li>Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+Immune+and+non-immune+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Microglia: Immune and non-immune functions.</a> Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).</li>
</ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Beyin homeostazı ve hastalığına immünolojik katkıları anlamayı amaçlayan çalışmalar, esas olarak beyin parankimi içinde bulunan hücrelere odaklanmış, SP gibi beyin sınırlarını ihmal etmiş, ancak yine de beyin fonksiyonuna çok önemli katkılarda bulunmuştur2,3. SP'deki bağışıklık hücresi popülasyonlarının analizi, SP'nin küçük boyutu, düşük sayıda yerleşik bağışıklık hücresi ve bu dokuya karmaşık erişim nedeniyle zordur. Toplam beyin immün hücreleri (CD45+) üzerind...

19. yüzyılın sonlarında Paul Erhlich tarafından kan-beyin bariyerinin keşfedilmesinden bu yana, beynin diğer organlardan ve kan dolaşımından neredeyse ayrı olduğu düşünülmektedir. Yine de, bu son on yılda, beyin fonksiyonlarının bağırsak mikrobiyotası ve sistemik bağışıklık hücreleri ve sinyalleri gibi çeşitli biyolojik faktörler tarafından şekillendirildiği kavramının ortaya çıkışına tanık olunmuştur1,2,3,4. Buna paralel olarak, meninksler ve koroid pleksuslar (SP) gibi diğer beyin sınırları, inert bariyer dokularından ziyade aktif immün-beyin çapraz konuşmasının arayüzleri olarak tanımlanmıştır5,6,7,8.
SP, beyin ve çevresini ayıran sınırlardan biri olan kan-beyin omurilik sıvısı bariyerini oluşturur. Beynin dört ventrikülünün her birinde, yani üçüncü, dördüncü ve her iki lateral ventrikülde bulunurlar ve hipokampusun subventriküler bölgesi ve subgranüler bölgesi gibi nörogenezde yer alan alanlara bitişiktirler3. Yapısal olarak, SP, sıkı ve yapışkan kavşaklarla birbirine bağlanan tek katmanlı bir epitel hücresi tarafından çevrelenmiş bir federe kan kılcal damarları ağından oluşur9,10. SP epitelinin başlıca fizyolojik rolleri, beyni atık metabolitlerden ve protein agregalarından temizleyen beyin omurilik sıvısının üretimini ve hormonlar ve nörotrofik faktörler de dahil olmak üzere çeşitli sinyal moleküllerinin üretimini ve kontrollü kandan beyne geçişini içerir11,12,13. SP'den salgılanan moleküller beynin aktivitesini şekillendirir, yani nörogenezi ve mikroglial fonksiyonu modüle ederek14,15,16,17,18,19, bu da SP'yi beyin homeostazı için çok önemli kılar. SP ayrıca çeşitli bağışıklık aktivitelerine katılır; patolojik olmayan koşullar altında beyin parankimindeki ana immün hücre tipi mikroglia iken, SP immün hücre popülasyonlarının çeşitliliği periferik organlardaki kadar geniştir3,7, bu da SP'de çeşitli immün regülasyon ve sinyal kanallarının iş başında olduğunu düşündürmektedir.
Endotel ve epitel hücreleri arasındaki boşluk, CP stroma, esas olarak, inflamatuar sinyallere yanıt olarak pro-inflamatuar sitokinleri ve antijen sunumuyla ilişkili molekülleri eksprese eden sınırla ilişkili makrofajlar (BAM) ile doldurulur3. Makrofajların bir başka alt tipi olan Kolmer epipleksus hücreleri, CP epitelinin apikal yüzeyinde bulunur20. CP stroma ayrıca dendritik hücreler, B hücreleri, mast hücreleri, bazofiller, nötrofiller, doğuştan gelen lenfoid hücreler ve çoğunlukla merkezi sinir sistemi antijenlerini tanıyabilen efektör hafıza T hücreleri olan T hücreleri için bir niştir7,21,22,23,24. Ek olarak, SP'deki bağışıklık hücresi popülasyonlarının bileşimi ve aktivitesi, sistemik veya beyin pertürbasyonu üzerine, örneğin yaşlanma sırasında10,14,15,21,25, mikrobiyota pertürbasyonu7, stres26 ve hastalık27,28 sırasında değişir. Özellikle, bu değişikliklerin dolaylı olarak beyin fonksiyonunu şekillendirdiği öne sürülmüştür, yani CP CD4 + T hücrelerinin Th2 inflamasyonuna doğru kayması beyin yaşlanmasında meydana gelir ve yaşlanma ile ilişkili bilişsel gerilemeyi şekillendirebilecek SP'den bağışıklık sinyalini tetikler14,15,21,25,29 . Bu nedenle, SP immün hücrelerinin özelliklerini aydınlatmak, SP epitel fizyolojisi ve sekresyonu üzerindeki düzenleyici işlevlerini daha iyi anlamak ve böylece sağlıklı ve hastalık koşulları altında beyin fonksiyonu üzerindeki dolaylı etkilerini deşifre etmek için çok önemli olacaktır.
SP, sadece birkaç bağışıklık hücresi içeren küçük yapılardır. İzolasyonları, perfüzyonun ön adımından sonra mikrodiseksiyon gerektirir; aksi takdirde kan dolaşımındaki bağışıklık hücreleri büyük kirleticiler oluşturur. Bu protokol, akım sitometrisi kullanarak SP'nin miyeloid ve T hücre alt kümelerini karakterize etmeyi amaçlamaktadır. Bu yöntem, enflamatuar olmayan koşullar altında fare SP'sini oluşturan immün hücre popülasyonlarının yaklaşık% 90'ını, immün CP heterojenliğini diseke etmek için diğer yöntemleri kullanan yakın zamanda yayınlanan çalışmalara uygun olarak tanımlar7,10,28. Bu protokol, SP immün hücre bölmesindeki değişiklikleri hastalık ve diğer deneysel paradigmalarla in vivo olarak karakterize etmek için uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>anti-fare CD16 / CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>Akış sitometrisi antikor</td></tr><tr><td>Albümin, sığır</td><td>MP Biyomedikaller</td><td>160069</td><td>Bloke edici reaktif</td></tr><tr><td>APC anti-fare CX3CR1</td><td>BioLegend</td><td>149008</td><td>Akış sitometrisi antikoru</td></tr><tr><td>APC anti-fare TCRb</td><td>BioLegend</td><td>109212</td><td>Akış sitometrisi antikoru</td></tr><tr><td>APC-Cy7 anti-fare CD4</td><td>BioLegend</td><td>100414</td><td>Akış sitometrisi antikoru</td></tr><tr><td>APC-Cy7 anti-fare IA-IE</td><td>BioLegend</td><td>107628</td><td>Akış sitometrisi antikoru</td></tr><tr><td>BD FACSymphony A5 Hücre Analiz Cihazı</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Akış sitometri analizörü</td></tr><tr><td>BV711 anti-fare Ly6C</td><td>BioLegend</td><td>128037</td><td>Akış sitometrisi antikoru</td></tr><tr><td>Kollajenaz IV</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td>Enzim için CP dokusunu ayırmak</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td>Canlı/ölü işaretleyici</td></tr><tr><td>EDTA</td><td></td><td></td><td>İyon şelatör</td></tr><tr><td>ince makas</td><td>FST</td><td>14058-11</td><td>Diseksiyon aleti</td></tr><tr><td>FITC anti-fare CD45</td><td>BioLegend</td><td>103108</td><td>Akış sitometrisi antikoru</td></tr><tr><td>Akış kontrolörü infüzyon girişi</td><td>CareFusion</td><td>RG-3-C</td><td>Kan perfüzyonu dahili</td></tr><tr><td>FlowJo yazılımı</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Analiz yazılımı</td></tr><tr><td>forseps</td><td>FST</td><td>11018-12</td><td>Diseksiyon aleti</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td>Antikoagülan</td></tr><tr><td>Imalgene</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td></td><td>Ketamin, anestezik</td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>Invitrogen</td><td>01-1111-42</td><td>Gerçekleştirmek için boncukları kontrol edin kompanzasyon</td></tr><tr><td>PBS-/-</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>Tampon</td></tr><tr><td>PBS+/+</td><td>Gibco</td><td>14040-091</td><td>Tampon</td></tr><tr><td>PE anti-fare CD8a</td><td>BioLegend</td><td>100708</td><td>Akış sitometrisi antikoru</td></tr><tr><td>PE anti-fare F4/80</td><td>BioLegend</td><td>123110</td><td>Akış sitometrisi antikoru</td></tr><tr><td>PE-Dazzle 594 anti-fare CD11b</td><td>BioLegend</td><td>101256</td><td>Akış sitometrisi antikor</td></tr><tr><td>Rompun Bayer</td><td></td><td></td><td>Ksilazin, anestezik</td></tr><tr><td>ince forseps</td><td>Dumoxel Biyoloji</td><td>11242-40</td><td>Diseksiyon aleti</td></tr><tr><td>Veteriner</td><td>Ceva</td><td></td><td>Buprenorfin, analjezik</td></tr></tbody></table>

mikro disseke fare koroid pleksuslarından İmmün hücrelerin İzolasyonu ve karakterizasyonu

Isolation and Characterization of the Immune Cells from Micro-dissected Mouse Choroid Plexuses

Beyin artık izole bir şekilde işleyen bir organ olarak kabul edilmiyor; Biriken kanıtlar, periferik bağışıklık sistemindeki değişikliklerin dolaylı olarak beyin fonksiyonlarını şekillendirebileceğini göstermektedir. Beyin ve sistemik dolaşım arasındaki arayüzde, kan-beyin omurilik sıvısı bariyerini oluşturan koroid pleksuslar (SP), periferi-beyin iletişiminin kilit bir yeri olarak vurgulanmıştır. SP, beyin omurilik sıvısını, nörotrofik faktörleri ve beyin homeostazını şekillendirebilen sinyal moleküllerini üretir. SP aynı zamanda aktif bir immünolojik niştir. Fizyolojik koşullar altında esas olarak mikroglia tarafından doldurulan beyin parankiminin aksine, SP bağışıklık hücrelerinin heterojenliği, diğer periferik organlarda bulunan çeşitliliği özetler. SP immün hücre çeşitliliği ve aktivitesi yaşlanma, stres ve hastalık ile değişir ve SP epitelinin aktivitesini modüle eder, böylece dolaylı olarak beyin fonksiyonunu şekillendirir. Bu protokolün amacı, murin SP'yi izole etmek ve onları dolduran ana bağışıklık alt kümelerinin yaklaşık% 90'ını tanımlamaktır. Bu yöntem, SP bağışıklık hücrelerini karakterize etmek ve periferi-beyin iletişimini düzenlemedeki işlevlerini anlamak için bir araçtır. Önerilen protokol, SP bağışıklık hücrelerinin sağlıkta ve çeşitli hastalık koşullarında beyin fonksiyonlarını dolaylı olarak nasıl modüle ettiğini deşifre etmeye yardımcı olabilir.

Burada sunulan akış sitometrisi analizleri, miyeloid ve T hücrelerinin ana alt kümelerini (sırasıyla Şekil 1 ve Şekil 2) ve fare başına göreceli toplam sayılarını yüksek oranda tekrarlanabilir bir şekilde (Şekil 3) başarıyla ortaya koymuştur.
Miyeloid hücrelerin akış sitometrisi analizi, SP'nin, CP'deki CD45 + bağışıklık hücrelerinin neredeyse% 80'ini temsil eden CD11b + CX3CR1<...

Bu çalışmada akım sitometrisi ve izole perfüze edilmiş farelerin beyin koroid pleksusları üzerinde iki farklı geçit stratejisi kullanılmaktadır; Bu protokol, bu beyin yapısını dolduran ana bağışıklık hücresi alt kümelerini tanımlar.

Mikro Disseke Fare Koroid Pleksuslarından İmmün Hücrelerin İzolasyonu ve Karakterizasyonu

The brain is no longer considered as an organ functioning in isolation; accumulating evidence suggests that changes in the peripheral immune system can ...

Bu protokol, fare modellerinde çeşitli bağlamlarda koroid pleksusların ve periferik bağışıklık hücrelerinin beynin düzenlenmesindeki rolü hakkındaki soruları ele almak için yararlı olabilir. Bu protokol, farelerin koroid pleksuslarındaki benzersiz bağışıklık hücresi popülasyonlarının derinlemesine nicel ve kalitatif analizine izin verir. Koroid pleksusların diseksiyonu, küçük boyutları ve şeffaf renkleri nedeniyle başlangıçta zor olabilir.Öncelikle perfüze edilmemiş hayvanlar üzerinde pratik yapmanızı öneririz. Başlamak için, beyni bir C57 siyah altı fare sırt tarafından disseke edilmiş bir Petri kabına yerleştirin ve çanağı dürbün halkalarının hedeflerinin altına yerleştirin. Forseps kullanarak beyni yerinde tutarken, başka bir forseps çiftinin iki ucunu yarımküreler arasındaki orta çizgiden aşağıya yerleştirin.Forsepsleri kullanarak, korteksi kallozum ve hipokampus ile septumdan uzağa çekin, lateral ventrikülü ve üçüncü ventrikülün bir kısmını açığa çıkarın. Lateral koroid pleksusu, lateral ventrikülü kaplayan ve her iki ucunda da parlayan uzun bir örtü olarak tanımlayın. Daha sonra iki ucu ince forseps kullanarak, lateral koroid pleksusunu toplayın.Hipokampusun arka kıvrımı tarafından gizlenmiş üçgen arka kısmı toplamaya dikkat edin. Daha sonra, korteksi korpus kallozum ve kontralateral yarımkürenin hipokampüsü ile septumdan uzağa çekerek tüm üçüncü ventrikülü ve karşı lateral ventrikülü açığa çıkarın. İnce forseps kullanarak, granüler yüzey yönüne sahip kısa bir yapı olarak tanımlanan üçüncü koroid pleksusunu toplayın.Sonra diğer lateral koroid pleksusunu toplayın. Daha sonra, forsepsin iki ucunu beyincik ve orta beyin arasına yerleştirin ve dördüncü ventrikülü ortaya çıkarmak için beyinciği pons ve medulladan ayırın. Daha sonra dördüncü koroid pleksusu, dördüncü ventrikülü lateral sağ uçtan sol uca beyincik ve medulla arasında sıralayan granüler bir yüzey yönüne sahip uzun bir küresel yapı olarak tanımlayın.İnce forseps kullanarak, dördüncü koroid pleksusunu toplayın. Toplanan tüm koroid pleksusları kollajenaz IV ile inkübe ettikten sonra, ayrışmayı tamamlamak için yaklaşık 10 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra kollajenaz IV aktivitesini durdurmak için tüpü MACS tamponu ile 1,5 mililitreye doldurun.Daha sonra, hücreleri santrifüj edin ve hücreleri 1,5 mililitre MACS tamponu ile yıkamadan önce süpernatantı atın. Uygun kompanzasyon boncuklarını ve antikor çözeltilerini ekledikten sonra, numuneleri 30 ila 45 dakika boyunca buz üzerinde inkübe ederek ışığa maruz kalmaktan koruyun. Daha sonra tüpleri 1,5 mililitre MACS tamponu ile doldurun ve hücreleri ve kompanzasyon boncuklarını santrifüj edin.Hücreleri yeniden askıya aldıktan ve boncukları 500 mikrolitre MACS tamponunda kompanzasyondan geçirdikten sonra, hücreleri 70 mikronluk bir süzgeçten süzün. Akış sitometresini ve yazılımı açtıktan sonra, boyuta göre hücreler için ileri saçılma alanı ve yan saçılma alanı ve kapıyı seçin. Ardından, ileri saçılma yüksekliğine karşı ileri dağılım alanına sahip tek hücreler için bir alt kapı oluşturun.Ardından, DAPI pozitif hücrelerini dışlamak için DAPI ve ileri dağılım alanına sahip canlı hücreler için bir alt kapı oluşturun. Daha sonra CD45 pozitif bağışıklık hücreleri için CD45 ve ileri saçılma alanı ile bir kız kapısı oluşturun. Şimdi, CD45 pozitif hücrelerden bir kız kapısı oluşturun ve CD11b pozitif F480 pozitif ve CD11b pozitif F480 negatif popülasyonlarını tanımlamak için CD11b'ye karşı F480'i seçin.Daha sonra CD11b pozitif F480 pozitif hücreler için bir alt kapı oluşturun ve hem CX3CR1 pozitif IA-IE pozitif kenarlıkla ilişkili makrofajları hem de CX3CR1 pozitif IA-IE negatif makrofajları tanımlamak için CX3CR1 ve IA-IE'yi seçin. Daha sonra, CD11b pozitif F480 pozitif CX3CR1 pozitif IA-IE negatif makrofajlar için bir alt kapı oluşturun ve CD11b yüksek F480 orta seviye CX3CR1 pozitif IA-IE negatif Kolmer epipleksus makrofajlarını ve CD11b pozitif F480 yüksek CX3CR1 pozitif IA-IE negatif sınırla ilişkili makrofajları tanımlamak için F480 ve CD11b'yi seçin. Daha sonra CD11b pozitif F480 negatif popülasyonundan, IA-IE'ye karşı Ly6C için kapı.Hem IA-IE pozitif Ly6C negatif popülasyonunu hem de esas olarak monositlere veya nötrofillere karşılık gelen IA-IE negatif Ly6C pozitif hücrelerini seçin. Son olarak, CD11b pozitif F480 negatif IA-IE pozitif Ly6C negatif popülasyonu için bir alt kapı oluşturun ve CD11b'ye karşı CX3CR1'i seçin. Daha sonra hem CD11b yüksek CX3CR1 düşük hem de CD11b pozitif CX3CR1 negatif popülasyonlarını tanımlayın.T-hücresi geçişi için, daha önce açıklandığı gibi DAPI pozitif hücrelerini hariç tuttuktan sonra, CD45 pozitif bağışıklık hücreleri için FSC-A'ya karşı CD45 pozitif bağışıklık hücreleri için bir kız kapısı oluşturun, ardından CD45 pozitif hücrelerden bir kız kapısı oluşturun ve CD11b'ye karşı TCR beta'yı seçin. Son olarak, TCR beta pozitif CD11b negatif popülasyonu için bir alt kapı oluşturun ve CD4'e karşı CD8a'yı seçin.Hem CD8 negatif hem de CD4 pozitif T hücrelerini ve CD8 pozitif CD4 negatif T hücrelerini tanımlayın. Burada gösterilen akış sitometrisi analizleri, miyeloid ve T hücrelerinin ana alt kümelerini ve fare başına göreceli toplam sayılarını yüksek oranda tekrarlanabilir bir şekilde başarıyla ortaya koymuştur. Miyeloid hücrelerin akış sitometrisi analizi, koroid pleksusun CD11b pozitif CX3CR1 pozitif F480 yüksek kenarlıkla ilişkili makrofajlar tarafından doldurulduğunu ve koroid pleksustaki CD45 pozitif immün hücrelerin% 80'ini temsil ettiğini göstermektedir.Kolmer epipleksus makrofajlarının CD11b yüksek F480 ara CX3CR1 pozitif IA-IE negatif popülasyonu da tanımlandı. CD11b pozitif F480 negatif immün hücreler arasında, Ly6C negatif IA-IE pozitif hücrelerin iki farklı popülasyonu karakterize edildi ve muhtemelen dendritik hücrelere karşılık geldi. T hücrelerinin analizi ve geçit stratejisi, CD45 pozitif CD11b negatif TCR beta pozitif hücrelerin minör popülasyonunun varlığını vurgulamıştır.Bunlar arasında, fare başına yaklaşık 30-50 CD8 negatif CD4 pozitif ve CD8 pozitif CD4 negatif T hücresi, fizyolojik koşullar altında koroid pleksusa doldurdu. Perfüzyonun kalitesini kontrol etmek önemlidir, çünkü herhangi bir kan kontaminasyonu koroid pleksusun bağışıklık kompozisyonunu bulanıklaştırabilir. Bu yöntemi, toplu veya tek hücreli RNA dizilimi gibi daha ileri analizler için seçilen hücre popülasyonlarının sıralanması takip edebilir.

isolation-characterization-immune-cells-from-micro-dissected-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, fare koroid pleksuslarından bağışıklık hücrelerini izole etme prosedürünü göstermektedir. Bu prosedür, koroid pleksuslardaki bağışıklık hücrelerinin beyin sağlığını ve çeşitli nörolojik hastalıkları nasıl etkilediğini anlamak için nöroimmünoloji araştırmalarında kullanılır.

Fare Koroid Pleksuslarından İmmün Hücrelerin İzole Edilmesi

Peyer plaklarında hücrelerin belirli altgrupları (PPs), gut-ilişkili lenfoid dokuların primer endüktif sitelerin immünolojik işlevlerini anlamak giderek artan bir ilgi var. Burada akım sitometri analizi ve immun için PP cryosections için tek hücre hazırlıkları PP hazırlamak için paralel protokolleri anahat.

Lenfositler ve mürin Peyer en Yamalar itibaren Dendritik Hücreler İzolasyon Ve immün

Mikrogliyal biyoloji başarılı bir soruşturma için bir anahtar CNS dokudan izolasyonu sırasında ex vivo mikroglialardan immunofunction korunmasıdır. Flüoresan görüntüleme, bağışıklık kimyası ve proenflamatuar stimuli lipopolisakarit (LPS) ile Pam 3 CSK 4 (PAM) ile ELISA aşağıda mikroglia aktivasyonu ile değerlendirilen gibi son derece saf ve immunofunctional hücre kültürlerinde döner çalkalama sonuçları ile mikroglia izole edilmesi.

Kemirgen Yenidoğan itibaren Korunan immunfenotipine ve İşlevselliği ile Kortikal mikrogliya İzolasyonu

Bir iletişim kuralı üzerinden fare beyni birincil microglia yalıtım için sunulmaktadır. Bu teknik nörolojik koşullar geçerli anlayışı sürdürmek yardımcı olur. Yoğunluk gradient Santrifüjü ve manyetik ayırma son derece saf bir örnek yeterli verim üretmek için birleştirilmiştir. Ayrıca, biz microglia karakterizasyonu için adımlar verilmiştir.

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Ayrıntılı olarak mikroglial işlevini anlamak için çaba olgun vivo içinde microglia özelliklerini özetlemek mikroglial kültür modellerin eksikliği tarafından engel. Bu iletişim kuralı sağlam çok ramified olgun sıçan microglia tanımlanan-orta koşullar altında yaşama korumak için tasarlanmış bir yalıtım ve kültür yaklaşım anlatılmaktadır.

Yalıtım ve dinamik bir teşvik etmek kemirgen Microglia kültürünü Morfoloji Serum-Alerjik orta Ramified

Biz yetişkin bir fare beyin yarımkürenin farklı parçalanmış bölgelerinden mikroglia izolasyoniçin bir protokol sağlamak, tam uzunlukta transkripsiyon derin tek hücreli RNA sıralama için yarı otomatik kütüphane hazırlık izledi. Bu yöntem, sağlık ve hastalık mikroglia fonksiyonel heterojenite açıklığa kavuşturmak için yardımcı olacaktır.

Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon

Bu makale, beyin, omurilik ve meninksler dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi içindeki yerleşik ve periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücrelerini incelemek için optimize edilmiş iki protokol sunmaktadır. Bu protokollerin her biri, kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında bu bölmeleri işgal eden hücrelerin işlevini ve bileşimini belirlemeye yardımcı olur.

İmmün hücrelerin Aşağı Akış Analizi için Merkezi Sinir Sistemi Dokularının ve İlişkili Meninkslerin İzole Edilmesi

Nörobilimde az çalışılmış bir doku olan koroid pleksus (SP), merkezi sinir sisteminin sağlığında ve hastalığında önemli bir rol oynar. Bu protokol, SP'yi izole etmek için bir mikrodiseksiyon tekniğini ve hücresel yapısının genel bir görünümünü elde etmek için taramalı elektron mikroskobunun kullanımını açıklar.

Fare Koroid Pleksusunun Mikrodiseksiyonu ve Tüm Montajlı Taramalı Elektron Mikroskobu Görselleştirmesi

Bugüne kadar, tüm ana merkezi sinir sisteminde yerleşik hücre tiplerinin aynı fareden eşzamanlı izolasyonu için protokoller karşılanmamış bir taleptir. Protokol, nöroinflamasyon sırasında karmaşık hücresel ağları araştırmak ve aynı anda gerekli fare sayılarını azaltmak için naif ve deneysel otoimmün ensefalomiyelit farelerinde uygulanabilir bir prosedürü göstermektedir.

Yetişkin Otoimmün Ensefalomiyelit Farelerinden Başlıca Merkezi Sinir Sisteminde Yerleşik Hücre Tiplerinin Eşzamanlı İzolasyonu

Manyetik olarak aktive edilmiş hücre sınıflandırması (MACS) kullanarak fare hipotalamusundan (veya eşdeğer küçük beyin yapılarından) mikroglial hücreleri nispeten kısa sürede izole etmek için bir protokol açıklıyoruz. MACS ile sıralanan hipotalamik mikroglia, ex vivo analiz için kullanılabilir ve in vitro testler yapmak üzere kaplanabilir.

Hipotalamik Mikroglia'nın Manyetik Olarak Aktive Edilmiş Hücre Ayıklama ile Yeni Perfüze Edilmiş Yetişkin Fare Beyninden İzolasyonu  

Beyin bozukluklarına karşı bağışıklık tepkisini araştırmak için yaygın bir yaklaşım, bağışıklık hücrelerindeki değişiklikleri analiz etmektir. Burada, murin beyin dokusu ve kafatası kemik iliğinden bağışıklık hücrelerini izole etmek için iki basit ve etkili protokol sağlanmıştır.

Fare Beyninden ve Kafatasından İmmün Hücrelerin İzole Edilmesi

Öğrenin fare koroid pleksuslarından immün hücre izolasyonu ve akış sitometrisi ile karakterizasyon yöntemini. Bu protokol beyin homeostazındaki makrofaj ve T-hücre popülasyonlarını incelemek için kullanılır.

Mikro Disseke Fare Koroid Pleksuslarından İmmün Hücrelerin İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet