Yüksek işlem hacmi, yüksek-içerik, sıvı tabanlı C. elegans Pathosystem

Bu yöntem, konak patojen etkileşimi ve ilaç keşfinde, çeşitli virülans faktörlerinin önemi ve küçük moleküllerin oluşumla iyileşme yeteneği gibi soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, küçük hacimlerle sıvı bir formatta gerçekleşmesidir. Başlamak için, bir BSL 2 biyogüvenlik kabini içinde çalışırken, P.aeruginosa'yı donmuş bir stoktan bir LB Agar plakasına çizin.

Plakayı 37 ° C'de 16 ila 24 saat inkübe edin, ardından plakayı bir haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın. Tahlil plakalarını kurmadan iki gün önce, üç ila beş mililitre steril LB suyunu aşılamak için plakadan tek bir koloni kullanın. Kültürü 37 santigrat derecede 12 ila 16 saat inkübe edin.

Yavaş öldürme veya SK ortamını metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, 350 mililitre p. Aeruginosa ile taze gece LB kültüründen, her 10 santimetrelik SK plakasını tohumlayın. Bakterileri eşit şekilde yaymak için steril bir bakteri yayıcı kullanın ve plakaların biyogüvenlik kabininde kurumasını bekleyin.

Ardından, plakaları 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Birden fazla RNAi bakteri suşunu, 24 kuyu derinliğinde bir kuyu plakasının tek bir oyuğunda paralel olarak test etmek için, önceden hazırlanmış RNAi içeren bakterilerin her bir klonundan tek bir koloniyi dört mililitre karbenisilin takviyeli LB'ye aşılayın. Plakaları, 16 saat boyunca 37 santigrat derece ve 950 rpm'de çok kuyulu plakalar için optimize edilmiş bir çalkalama inkübatörüne yerleştirin, ardından bakterileri 5 dakika boyunca 2.000 g'da santrifüjleme ile toplayın. Plakayı ters çevirerek ve kuvvetlice sallayarak süpernatanı boşaltın.

100 mikrolitre S Bazal kullanarak RNAi bakterilerini yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse edilen bakterileri, IPTG ve karbenisilin ile desteklenmiş çok kuyulu bir NGM plakasının uygun sayıda kuyucuğuna pipetleyin ve plakanın kurumasını bekleyin. L1 solucanlarını metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, RNAi veya OP50 süper gıda ile tohumlanmış 10 santimetrelik plaka başına yaklaşık 5.000 solucan pipetleyerek temel deneyler için plakalar hazırlayın.

Bir RNAi ekranı için kurulum yapmak için, RNAi ile tohumlanmış 24 oyuklu bir plakada oyuk başına yaklaşık 300 solucan pipetleyin. Kullanılan suş sıcaklık açısından steril ise, solucanları yaklaşık 16 saat boyunca 15 santigrat derecede inkübe edin ve daha sonra gelişimi tamamlamak ve embriyogenezi önlemek için 44 saat boyunca 25 santigrat dereceye aktarın. Bir sıvı öldürme testi yapmak için, P.aeruginosa'yı bir SK plakasından çıkarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın ve bakterileri yaklaşık 5 mililitre S. Bazal'da yeniden süspanse edin.

Bir spektrofotometre kullanarak bakteri süspansiyonunun OD 600'ünü ölçer. 09'a eşit bir OD 600'de S.Bazal'da 24 mililitre seyreltilmiş P.Aeruginosa stoğu hazırlayın, ardından 21 mililitre sıvı SK ortamı ekleyin ve çok kanallı bir pipet kullanarak, 384 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 45 mikrolitre bakteri ve ortam aktarın. Solucanları kaynağından 50 mililitrelik konik bir tüpe yıkayın ve yerçekimi kuvveti altında yerleşmelerine izin verin.

Süpernatanı 5 mililitreye aspire edin, ardından solucanları yeniden süspanse etmek için toplam 50 mililitre S.Basal kullanın ve yıkamayı iki kez daha tekrarlayın. Bir solucan sıralayıcı kullanarak, metin protokolüne göre 384 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna yaklaşık 22 solucan sıralayın, ardından plakayı kapatmak için gaz geçirgen bir film kullanın ve 24 ila 48 saat boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin. İstenilen zamanda, 384 kuyulu plakayı toplam 5 kez yıkamak için bir mikroplaka yıkayıcı ve S.Basal kullanın.

Yapılması en kolay hatalardan biri, solucanlar tamamen yerleşmeden önce 384 kuyulu plakayı aspire etmektir. Solucanların tamamen yerleşip yerleşmediğini doğru bir şekilde görmek pratik gerektirir. Son yıkamadan sonra, süpernatanı 20 mikrolitreye kadar aspire edin.

Ardından, 0.7 mikromolar nihai konsantrasyon için oyuk başına 50 mikrolitre 98 mikromolar nükleik asit boyası ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında 12 ila 16 saat inkübe edin. İstenen inkübasyon süresinden sonra, plakaları en az üç kez yıkamak için mikroplaka yıkayıcıyı kullanın.

Bir veri toplama için, hem iletilen ışığı hem de floresansı görüntülemek için bir spektrofotometre veya otomatik bir mikroskop kullanın. Kuyucuk başına 300 solucan içeren 24 oyuklu bir plakanın oyuğuna bir mililitre S Basal ekleyin. Plakayı sallayarak solucanları nazikçe çalkalayın, ardından solucanları boş, steril 24 derin kuyulu bir plakaya aktarın.

Solucanların yerçekimi ile yaklaşık beş dakika yerleşmesine izin verin. Süpernatanı aspire edin, oyuk başına yaklaşık bir mililitre bırakın, ardından her oyuğa 7 mililitre S Bazal ekleyin. Yıkamayı iki kez daha tekrarlayın ve son yıkamadan sonra yaklaşık 400 mikrolitre süpernatan hariç hepsini aspire edin.

Açlıktan ölmemek için bakterileri 384 oyuklu plakaya pipetledikten sonra, solucan sıralayıcının yeniden örnekleyici işlevini kullanarak 384 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 22 solucan sıralayın. Son olarak, sıralamayı takiben, küçük moleküller veya deneye özel diğer malzemeleri ekleyin. Bu grafikte gösterildiği gibi, bu videoda özetlenen adımlar izlendiğinde, C.elegans'ın zamana bağlı bir ölümü yalnızca P.aeruginosa'nın varlığında gözlemlenecektir.

Buna karşılık, temel bakteriyel besin takviyelerinin yokluğunda, çok az veya hiç öldürme gözlenmeyecektir. Burada gösterildiği gibi, P.aeruginosa'nın 37 santigrat derecede ve daha sonra 25 santigrat derecede iki aşamalı inkübasyonu, geleneksel yavaş öldürme deneyleri için kritik olan ve başlangıçta sıvı öldürmede uygulanan, bu tahlilde vazgeçilebilir. Protokol, 0025'e eşit bir OD 600 kadar düşük bir seviyeden çok çeşitli başlangıç bakteri konsantrasyonlarını tolere eder ve zamanlama değişse de yine de zamana ve konsantrasyona bağlı öldürme sergiler.

Ek olarak, istatistiksel olarak anlamlı veriler elde etmek için genellikle dört kuyu kadar az yeterlidir. İşlemenin faydasına bir örnek, sinyal-gürültü oranı yüksek olduğunda burada gösterilmiştir, bu örnekte olduğu gibi, analiz basittir ve pozitif ve negatif koşullar arasında ayrım yapmak önemsizdir. Bu durumlarda, zayıf isabetler bile kolayca tespit edilebilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, sıralama dahil değil, 384 oyuklu plaka başına yaklaşık 60 ila 75 dakikalık el zamanında gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, tüm bileşenleri medyanıza eklemeyi unutmamak çok önemlidir, aksi takdirde virülans tehlikeye girer. Bu test, konak patojen araştırmalarında ilaç keşfine tüm organizma fenotipine dayalı taramanın uygulanmasını basitleştirir.

Bu videoyu izledikten sonra, sıvı bazlı C elegans patogenez testlerinin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedür, P.Aeruginosa için E.Faecalis gibi diğer patojenlerle ikame edilerek değiştirilebilir ve diğer bakteriyel enfeksiyonlar için tedavi arayışını kolaylaştırır. P.Aeruginosa veya E.Faecalis gibi bulaşıcı bakterilerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Bu prosedür uygulanırken her zaman uygun eğitim, iyi kişisel koruyucu ekipman ve uygun teknik gibi uygun önlemler alınmalıdır.