Name: Yüksek işlem hacmi, yüksek-içerik, sıvı tabanlı C. elegans Pathosystem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Keşfedin, C. elegans ve P. aeruginosa kullanarak sıvı tabanlı yüksek içerikli tarama ile konak-patojen etkileşimlerini ve ilaç keşfini. Bu yöntem, virülans faktörlerini ve küçük molekülleri değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada kanser önleme ve Texas Araştırma Enstitüsü (CPRIT) ödül RR150044, Welch Vakfı araştırma hibe C-1930 ve ulusal kurumları, sağlık K22 NVK için layık AI110552 tarafından desteklenmiştir. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.

Dikkat: P. aeruginosa ve E. faecalistir seviye 2 patojenler ve yanlışlıkla enfeksiyonu önlemek için ve yüzeylere kontaminasyonu en aza indirmek için uygun güvenlik önlemleri alınmalıdır. Tüm medya ve patojenler ile temas gelen malzemeleri sterilize atılır ve/veya gerekir. Daha fazla yönergeleri CDC yayından Biyogüvenlik təhlillər ve Biyomedikal Laboratuvarı (BMBL), 5 edition mevcuttur.
1. hazırlık ve P. aeruginosa Bakımı
<ol><li>Çizgi P. aeruginosa LB (Lysogeny et suyu) agar plaka üzerine donmuş bir stoktan. 16-24 h 37 ° C'de kuluçkaya Not: P. aeruginosa deneyler bir BSL-2 biyolojik Emanet kısırlık sağlamak için kabine içinde gerçekleştirin. Patojen bulaşma veya bulaşma olasılığını en aza indirmek için uygun güvenlik önlemleri kullanın.</li>
	<li>Bu plaka 4 ° C'ye aktarma Bu plaka 4 ° C'de muhafaza ve kültürleri bir hafta kadar aşılamak için kullanılan. Bir hafta sonra arındırılmasına ve plaka atmak ve yeni bir LB çizgi tabak hazırla. Not: P. aeruginosa virülans sonra uzun süreli depolama azaltır.</li>
	<li>İki gün önce tahlil tabak kadar ayarlama P. aeruginosa bir koloni 1. 1'yapılan plaka ile 3-5 mL steril LB suyu aşılamak. 12-16 h 37 ° C'de kuluçkaya. Not: 16 h daha uzun kuluçkaya değil. Zengin sıvı kültürlerde, P. aeruginosa PA14 lyse başlar.</li>
	<li>Yavaş öldürmek medya ile steril 10 cm tabak hazırlamak (3 g NaCl, 3.5 g pepton, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, fosfat tampon 25 mL (litre başına miktar: 132 mL K2HPO4 (1 M) ve KH2PO4 (1 M) 868 mL) ve agar 18 g/L). Not: tabak önceden hazırlayın. 3 hafta kadar 4 ° C'de hava geçirmez bir kap içinde depolanma</li>
	<li>Her 10 cm yavaş öldürmek plaka (SK plaka) P. aeruginosa 350 μL taze gecede LB kültür ile tohum. Steril bir bakteri yayıcı kullanarak, bakteri eşit medya yüzeyi boyunca yayılmış ve BSL-2 biyolojik güvenli kabine içinde kurumasını sağlar.</li>
	<li>Plakalar için 24 h 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
</ol>2. RNAi bakteri hazırlanması
<ol><li>Çizgi dışarı veya PIN-devret RNAi içeren bakterilerin donmuş stoktan uygun antibiyotik (carbenicillin, 100 µg/mL) ve 15 µg/mL Ahringer ve Vidal kitaplıkları için tetrasiklin içeren LB ağar kaplamalar üzerine istenilen suşların. Not: nonpathogenic bakterilerin ile çalışırken kullanın ya bir BSL-2 A / B biyolojik Emanet kabine veya BSL-1 laminar akış hood kısırlık kültürlerin sağlamak ve Kütüphane çapraz bulaşma olasılığını en aza indirmek için.</li>
	<li>Kaplamalar, 37 ° C'de 24 h için kuluçkaya</li>
	<li>Plakayı 4 ° c ilâ iki hafta için saklayın.<ol>
<li>İki hafta sonra tabakları atmak ve eski yerine koymak onları ile taze yapılmış plakalar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Birden çok RNAi suşları paralel olarak ayrı ayrı bir koloni her klon üzerinden 4 mL de bir 24-şey derin-şey plaka, tek bir carbenicillin takıma lb veya steril tüp bebek aşı sınayın. Not: Tetrasiklin RNAi verimliliğini azaltmak için rapor edildi. Bu ortam kullanmayın.</li>
	<li>Multiwell plakalar için en iyi duruma getirilmiş bir sallayarak kuluçka makinesi 24-şey derin kuyu tabak yerleştirin ve 950 rpm'de sallayarak süre için 16 h 37 ° C'de kuluçkaya. Not: Geleneksel sallayarak kuluçka makinesi kullanarak multiwell plakaları Tekdüzen bakteriyel büyüme elde etmek zordur. Titreyen kuluçka makinesi en az 750 rpm sırayla düzgün büyümeye kültürler için sallamak gerekir. Özel bir shaker yokluğunda, bireysel bir tüp her kültürde büyümeye mümkündür. Kültürler istenirse daha sonra aralıklarla 24-şey plaka içine aktarılabilir.</li>
	<li>Bakteri 2.000 x g az 5 dakika boyunca centrifuging toplamak.</li>
	<li>Süpernatant plaka ters çevirme ve şiddetle sallayarak dikkatle boşaltmak. Bazal S (5.85 g NaCl, 1 g K2HPO4, 6 gr KH2PO4 Ultrasaf Su 1 L çözünmüş ve otoklav tarafından sterilize), 100 µL RNAi bakteri resuspend.</li>
	<li>Resuspended bakteri wells multiwell NGM plaka uygun bir dizi halinde pipet (Yuvarlak solucanlar büyüme medya, 3 g NaCl, 2.5 g pepton, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, fosfat tampon 25 mL (litre başına miktar: 132 mL K2HPO4 (1 M) ve KH2PO4 (1 M) 868 mL) ve su litre başına 18 g agar) IPTG (1 mM son konsantrasyonu) ve carbenicillin (100 μg/mL nihai toplama) ile desteklenmiştir.<ol>
<li>6-şey plaka, iyi bir 24-şey plaka başına 1 mL veya 96-şey plaka kuyu başına 150 µL kuyu başına 3,5 mL NGM medya kullanın.</li>
		<li>100 μL/iyi bakterilerin 6-şey plaka için kullanın; 24-kuyu 50 μL/iyi; ya da 20 μL/96-şey plaka için iyi. Kurumasını sağlar. Not: Kurutma normalde hızlı, tek kurutma tanıtmak için steril akışı mahallede gerçekleştirilir. Tek tip kurutma çok önemlidir. Kurtlardan burrowing agar çatlaklar teşvik gibi aşırı kurutma, kaçının. Bu kayıp ve potansiyel sıvı işleme sistemleri tıkanma solucan yol açar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hazırlanan tabak hemen kullanın veya onları ilâ iki hafta daha sonra kullanmak için 4 ° C'de depolayın. Not: tabak kurumasını önlemek için onlar plastik parafin film ile mühürlenmiş veya nemli kağıt havlu ile sıkı kapalı bir kapta yerleştirilir.</li>
</ol>3. bakım ve C. elegans hazırlanması
Not: deneyler işlemini başlatmadan önce gravid, Yetişkin hermaphroditic solucanlar eşitlenmiş bir nüfusa aşağıdaki gibi oluşturun.
<ol><li>Yıkama gravid yetişkinlerden (Yani, birden fazla embriyo erbezi içinde görünür ile) 4-6 10 cm NGM tabak tabak, yavaşça dönen ve 15 mL konik tüp içine dökme S bazal 4 mL ekleyerek 15 mL konik tüp içine.</li>
	<li>30 saniye için 1000 x g de Santrifüjü yoluyla solucanlar cips.</li>
	<li>Solucan Pelet bozmaya değil dikkat çekici Aspire edin süpernatant.</li>
	<li>Solucan çamaşır suyu çözüm 3,5 mL ekleyin (son konsantrasyonu 0.5M NaOH, steril su % 1 Sodyum hipoklorit) solucan Pelet ve mix 1 dakikadır ters çevirme tarafından.</li>
	<li>Kısaca girdap ve 30 saniye için 1000 x g, santrifüj.</li>
	<li>Aspire edin veya solucan Pelet bozmamaya dikkat çekici süpernatant, dikkatle boşaltmak.</li>
	<li>3,5 mL taze solucan çamaşır suyu çözeltisi solucan Pelet ekleyin.</li>
	<li>Çamaşır suyu çözüm de solucan kuvvetle karıştırın. Düzenli olarak (yaklaşık 10 saniyede bir) solucanlar diseksiyon mikroskop altında kontrol edin. Solucan cuticles kırmak, yumurta bırakmadan dikkat et. Yetişkin bu solucanların en çözünmüş (~ %95) olmuştur sonra çamaşır suyu ile sindirim durdurmak için bazal S 15 ml seyreltik. Not: Yumurta kabukları yetişkin doku bleach daha dayanıklı olmakla birlikte, uzun süreli pozlama sırasında çözülmüş. Yumurta dağılmasına önlemek için çamaşır suyu çözüm 7 dakika daha uzun süre solucan yumurta maruz bırakmayın. Yumurta kabukları aşırı bozuksa, embriyo ölür.</li>
	<li>30 saniye boyunca embriyo 1000 x g de cips ve Aspire edin veya embriyo Pelet kaldırmadan süpernatant dikkatle boşaltmak.</li>
	<li>Solucanlar kalan çamaşır suyu çözüm sulandırmak için S 15 mL nihai bir birime bazal resuspend.</li>
	<li>Çamaşır adımları (3,9-3.10) üç kez daha 4 ardışık yıkar toplam için yineleyin.</li>
	<li>Dördüncü yıkama sonra süpernatant Aspire edin ve 5 veya 6 mL steril S bazal 15 mL konik tüp içine kadar ekleyin. ~ 50 solucanlar µL başına bir konsantrasyon için embriyo resuspend için hedeftir. Not: S bazal yumurta Pelet boyutu üzerine bağlıdır; büyük Pelet daha fazla S bazal gereklidir.</li>
	<li>Konik tüp gecede bir masa üstü rotator oda sıcaklığında veya 15 ° C'de 48 h kuluçkaya Larvalar yumurtadan ama larva geliştirme besin yoksunluğu nedeniyle (L1 diapause) L1 aşamada tutuklayacağım.</li>
	<li>Embriyoların çoğu yumurtadan sahip ve geliştirme L1 aşamasında tutuklanan doğrulamak için diseksiyon mikroskop altında incelemek.</li>
	<li>Solucan hazırlık 20 µL alarak ve ile S bazal, 80 µL sulandrarak solucan sayısı belirler. Seyreltilmiş solucan çözüm doğrudan boş NGM plaka üzerine 10 µL pipet. Tekrarlayın 2 kez daha.<ol>
<li>Her yerde larva sayısı ve belirlemek. Bu ortalama 2 solucanlar solucan hazırlık µL başına yaklaşık sayısı elde bölün. Solucan preps sonra yayılma plakaları için veya deneyler için kullanılabilir. Not: 4-5 gün sonra Aç larva ölmeye başlayacak; Hazırlık bu noktada atmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zorlanma yayma için L1 solucanlar (5000-6000) 3-4 10 cm NGM plakalar üzerine uygun sayıda benekli ile pipet konsantre OP50 E. coli- "superfood" (E. coli OP50 benekli 25 X konsantrasyonu (Yani, 1 L gecede OP50, LB içinde yetiştirilen kültür girilen 25 X OP50 superfood 40 mL); Bu konsantre bakteriyel süspansiyon 2 mL her 10 cm NGM tabağa lekeli).</li>
	<li>Levha deneyler için hazırlamak için ("Temel Protokolü" kullanım 3.17.1 Kur, için belgili tanımlık "kurmak RNAi ekran" kullanım merdiven 3.17.2 - 3.17.4 uygun olarak için) aşağıdakilerden birini yapın:<ol>
<li>Pipet ~ 5.000 solucanlar/10 cm plaka numaralı seribaşı RNAi veya OP50 superfood ile.</li>
		<li>Pipet ~ 500 solucanlar/iyi bir 6-şey plaka numaralı seribaşı RNAi ile.</li>
		<li>Pipet ~ 300 solucanlar/iyi bir 24-şey tabak içinde RNAi ile seçilir.</li>
		<li>Pipet ~ 100 solucanlar/iyi bir 96-şey tabak içinde RNAi ile seçilir. Not: Nasıl RNAi seribaşı yönergeleri için hazırlık RNAi bakteri 2,7-2,9 adımda başvurun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solucanlar verimli bir tür kullanılıyorsa, solucanlar 25 ° c ~ 44-48 h. kullanım için uygun yaş nüfus ulaştığında bu solucanları mümkün olduğunca çabuk kuluçkaya. Bu solucanlar içinde tahlil sırasında kuluçkalık yumurta etkisini en aza indirir.</li>
	<li>Eğer kullanılan zorlanma sıcaklık steril (Örneğin, fer-15(b26); FEM-1(hc17) veya glp-4(bn2)), solucanlar 15 ° c ~ 16 h için kuluçkaya ve geliştirme tamamlamak ve embriyo önlemek 44 h için 25 ° c aktarın.</li>
</ol>4. sıvı tahlil Kur (temel Protokolü) öldürmek
Not: Bu bir bakteriyel zorlanma ve solucanlar bir kaynak için bir protokoldür.
<ol><li>Bir hücre kazıyıcı kullanarak, P. aeruginosa bir SK plaka kaldırmak ve içinde resuspend ~ S bazal 5 mL. Gerekirse büyütmek. Spektrofotometre (OD600) kullanarak bakteriyel süspansiyon optik yoğunluğunu ölçmek</li>
	<li>P. aeruginosa , OD600 ≈ 0.09 S bazal (3 X son konsantrasyonu) içinde seyreltilmiş hisse senedi 24 mL hazırlayın. 4.6.2 son içeriği iyi ücret için görmek ve buna göre bakteriyel seyreltme hacmi ölçek.</li>
	<li>21 mL sıvı yavaş öldürmek medya (3 g NaCl, pepton/m CaCl2 ve MgSO4 ' e 1 mM son bir konsantrasyon ile takıma 3.5 g) ekleyin. Bir çok kanallı pipet kullanarak, bakteri ve medya 45 µL 384-şey plaka her şey için transfer.</li>
	<li>50 mL konik tüp içine kaynaklarını (yani, adım 3.17.1) dan solucanlara yıkama ve solucanlar yerçekimi kuvveti altında yerleşmek izin. 5 ml süpernatant Aspire edin. Toplam 50 mL S bazal resuspend.</li>
	<li>Adım 4.4 iki kez tekrarlayın.</li>
	<li>Bir solucan sıralayıcısı kullanarak, yaklaşık 22 solucanlar 384-şey plaka her kuyuya sıralamak. Not: Kurulum her solucan ~1.1 µL sıvı içinde bırakır. 22 solucanlar 25 µL, toplam tahlil cilt 70 µL/iyi getirmek için miktar olacaktır.<ol>
<li>70-in her şey son kompozisyon oluşur µL. 45 µL bu birimin bakteriyel aracı olarak eklenir (24 µL S bazal ve 21 µL SK 0,03 OD600 bakteri takıma CaCl2 ve MgSO4ile). Diğer 25 µL 22 kurtlarla eklenir.</li>
		<li>Sıralayıcı kullandıysanız ( Tablo malzemelerigörmek) işte kullanılamaz, solucanlar bir son konsantrasyon 1 solucan/µL S bazal içinde ve pipetted 25 µL/iyi bir çok kanallı pipet kullanarak seyreltilmiş. Ancak, sonuçlar artan değişkenlik sergileyebilirler. Alternatif olarak, bu Leung ve meslektaşları19tarafından açıklandığı gibi peristaltik Sıvı Sabunluk, kullanmak mümkündür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solucanlar 384-şey plaka sıralanmış sonra gaz geçirgen bir film ile plaka mühür ve plakaları için 24-48 h 25 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>İstediğiniz saatte Mikroplaka yıkayıcı 5 kez toplam 384-şey plaka ile S bazal yıkamak için kullanın.<ol>
<li>Sonra ikinci yıkama, medya çoğunu Aspire, bırakarak ~ 20 µL. şiddetle sallamayın plakaları herhangi bir enkaz kuyu dibinden gevşetmek için en az 30 saniye Mikroplaka vortexer kullanarak).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Son yıkama aspiratı süpernatant aşağı 20 µL. Ekle 50 µL 0,98 µM nükleik asit leke sonra ( Tablo malzemelerigörmek) / 384-şey plaka, 0.7 µM son bir konsantrasyon, iyi.</li>
	<li>12-16 saat için oda sıcaklığında kuluçkaya. Bu boya sadece ölü solucanlar leke. İstenen kuluçka dönemi sonra (3 yıkar en az) Mikroplaka yıkayıcı kullanarak herhangi bir aşırı kaldırmak için yıkama plakalar leke.</li>
	<li>Veri toplama için iletilen ışık ve floresan (531 nm uyarma ve 593 emisyon) görüntü için bir spektrofotometre veya otomatik bir mikroskop kullanın.<ol>
<li>Düşük büyütme objektif görüntünün yakalanması için tüm iyi kullanın.</li>
		<li>Alternatif olarak, akış vermimetry kullanın. Bu teknik bir büyük nesne akış sitometresi floresans organizmanın bütün (Yani, C. elegans) akış sitometresi için güçlü benzer bir moda ve boyutu ölçüm bir solucan fluorimeter olarak kullanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Otomatik görüntü analiz yazılımı (örneğin, CellProfiler, MatLab <a href="http://cellprofiler.org/">http://cellprofiler.org/</a>üzerinde bir ücretsiz görüntü analiz stüdyosu) kullanmak iyi tarafsız bir biçimde başına floresan ve toplam solucan alanları hesaplamak için. Not: Bu sayının kesir ölüm her şey için temsil eder. De olsaydı o zaman kesir ölüm 0,35 veya % 35 oluşur 7 20 dışarı solucanlar, toplam lekeli.<ol>
<li>İlk kullanımdan önce otomatik görüntü işleme boru hattı el ile Puanlama tarafından doğrulanması gerekir. Bu görsel olarak görüntüleri teftiş ve kesirler ölü solucanlar her biri için kayıt tarafından elde edilen puanlar otomatik boru hattı sonuçları karşılaştırarak yapılır. Doğrulama işlemi otomatik görüntü işleme parametrelerini doğru olduğundan ve verilerin doğru şekilde temsil sağlar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. uyum için eleme birden çok C. elegans suşları veya nakavtlar (RNAi ekran kurulumu)
Not: Bu bir 24-şey plaka kurulum için açıklanan bir RNAi ekran olduğunu.
<ol><li>S bazal 24-şey plaka kuyu başına 1 mL ekleyin (bkz. Adım 3.17.3). Yavaşça plaka sallayarak solucanlar kışkırtmak, sonra solucanlar bir boş, steril 24 derin-şey plaka için transfer. Solucanlar kütleçekimsel (~ 5 dakika) yerleşmek izin verir.</li>
	<li>Yaklaşık 1 mL bırakarak süpernatant Aspire edin. S bazal 7 mL her şey için ekleyin.</li>
	<li>Adımları 5.1-5.2 en az 2 kez daha yineleyin. Son yıkama sonra yaklaşık 400 µL bırakarak süpernatant Aspire edin.</li>
	<li>Solucan sıralayıcısı Örnekleyicinin işlevini kullanarak, 22 24-şey plaka solucan süspansiyon 384-şey plaka (384-şey plaka bir 24-şey plaka verimi 8-12 kuyu her de) her kuyuya solucanlar sıralayın.<ol>
<li>Açlık önlemek için bakteri 384-şey kalıplara (yalnızca OP50 gibi gıda olarak hizmet veren bir zorlanma veya patojenik bir yük) sıralama öncesinde pipet. Not: Aşağıdaki adımları 2.3-2.5 veya 6.4-6.5 ve besin kaynağı bakteri seyreltilmiş ve P. aeruginosagelince aynı düzeni izleyerek eklendi patojenler eklenebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solucanlar 384-şey plaka sıralanmış sonra küçük moleküller veya diğer özel deney malzemeleri ekleyin.</li>
</ol>6. uyum E. faecalistir için
Not: Sadece P. aeruginosa tahlil ile arasındaki farklar açıklanmıştır.
<ol><li>E. faecalistir taze kaynağı BHI (beyin kalp infüzyon) agar plaka üzerine donmuş bir stoktan bakteri çizgiler ve 16-24 h 37 ° C'de için kuluçka hazırlayın Not: E. faecalistir deneyler bir BSL-2 biyolojik Emanet kısırlık sağlamak için kabine içinde gerçekleştirin. Patojen bulaşma veya bulaşma olasılığını en aza indirmek için uygun güvenlik önlemleri kullanın.</li>
	<li>Tabaklar 4 ° C'de bir hafta kadar saklanabilir. Bu sürenin sonunda, taze bir plaka ile değiştirin.</li>
	<li>Solucanlar, sıralama önce gece 3-5 mL aşılamak bir tek koloni ile steril BHI E. faecalistir. 12-16 saat ajitasyon ile 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Bakteri wells gelince P. aeruginosa (3 x bakteri bazal S, OD600≈0.09) ekleyin. Not: E. faecalistiriçin son iyi kompozisyon ise: E. faecalistir (OD600≈0.03), BHI = % 10 v/v, S bazal oluşan kalan güç ile. Unutmayın s bazal 25 µL solucanlar ile teslim edilecektir. Not: E. faecalistir floresan leke absorbe kalın biyofilmler bulanık görüntüleri neden üretir. Geniş çamaşır bu biyofilm kaldırmak için yetersiz olabilir. Bu durumda, solucanlar bir çok kanallı pipet kullanarak boş bir levha için transfer edilebilir. Aktarımı gerçekleştirmek için ara 20 S bazal için %0,1 (v/v) ara 20 S bazal son bir konsantrasyon eklenebilir. Bu biyofilm solucanlara giderilmesinde yardımcı olur.</li>
</ol>

<ol><li>Falagas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandrug-resistant+Klebsiella+pneumoniae%2C+Pseudomonas+aeruginosa+and+Acinetobacter+baumannii+infections%3A+Characteristics+and+outcome+in+a+series+of+28+patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 32 (5), 450-454 (2008).</li>
<li>Hsueh, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandrug-resistant+Acinetobacter+baumannii+causing+nosocomial+infections+in+a+university+hospital%2C+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 8 (8), 827-832 (2002).</li>
<li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+among+hospitalised+patients%3A+clinical+features%2C+risk-factors+and+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalised patients: clinical features, risk-factors and outcomes.</a> Clinical Microbiology and Infection. 12 (1), 63-68 (2006).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Draft+genome+sequences+of+pandrug-resistant+Serratia+marcescens+clinical+isolates+harboring+blaNDM-1%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announcements%22%5BJournal%5D)">Draft genome sequences of pandrug-resistant Serratia marcescens clinical isolates harboring blaNDM-1.</a> Genome Announcements. 5 (3), (2017).</li>
<li>Utari, P. D., Quax, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+reveals+novel+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans reveals novel Pseudomonas aeruginosa virulence mechanism.</a> Trends in Microbiology. 21 (7), 315-316 (2013).</li>
<li>Conery, A. L., Larkins-Ford, J., Ausubel, F. M., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+for+novel+anti-infectives+using+a+C.+elegans+pathogenesis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening for novel anti-infectives using a C. elegans pathogenesis model.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 6 (1), 25-37 (2014).</li>
<li>Kirienko, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+disrupts+Caenorhabditis+elegans+iron+homeostasis%2C+causing+a+hypoxic+response+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa disrupts Caenorhabditis elegans iron homeostasis, causing a hypoxic response and death.</a> Cell Host & Microbe. 13 (4), 406-416 (2013).</li>
<li>Kirienko, D. R., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-content%2C+phenotypic+screen+identifies+fluorouridine+as+an+inhibitor+of+pyoverdine+biosynthesis+and+pseudomonas+aeruginosa+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">A high-content, phenotypic screen identifies fluorouridine as an inhibitor of pyoverdine biosynthesis and pseudomonas aeruginosa virulence.</a> mSphere. 1 (4), (2016).</li>
<li>Manning, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+content+microscopy+assay+to+determine+drug+activity+against+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A high content microscopy assay to determine drug activity against intracellular Mycobacterium tuberculosis.</a> Methods. 127, 3-11 (2017).</li>
<li>Marwaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acylated+derivatives+of+sulfamethoxazole+and+sulfafurazole+inhibit+intracellular+growth+of+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">N-acylated derivatives of sulfamethoxazole and sulfafurazole inhibit intracellular growth of Chlamydia trachomatis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (5), 2968-2971 (2014).</li>
<li>Kota, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+high-content+imaging+and+chemical+genetics+to+probe+host+cellular+pathways+critical+for+Yersinia+pestis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection.</a> PLoS One. 8 (1), e55167(2013).</li>
<li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cell+infection+caused+by+Listeria+monocytogenes+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion.</a> Journal of Biotechnology. 154 (1), 76-83 (2011).</li>
<li>Jayamani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Francisella+tularensis-Caenorhabditis+elegans+pathosystem+for+the+evaluation+of+therapeutic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (9), (2017).</li>
<li>Moy, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screen+for+novel+antimicrobials+using+a+whole+animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 527-533 (2009).</li>
<li>Rajamuthiah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+automated+platform+for+drug+discovery+against+multi-drug+resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus.</a> PLoS One. 9 (2), e89189(2014).</li>
<li>Breger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+chemical+compounds+identified+using+a+C.+elegans+pathogenicity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), e18(2007).</li>
<li>Garvis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+semi-automated+liquid+screen+reveals+a+specialized+role+for+the+chemotaxis+gene+cheB2+in+Pseudomonas+aeruginosa+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence.</a> PLoS Pathogens. 5 (8), e1000540(2009).</li>
<li>Zhou, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+novel+screening+model+for+assessing+the+bioactivity+of+extracts+against+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+using+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75 (9), 1746-1751 (2011).</li>
<li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visual Experiments. (51), (2011).</li>
<li>Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+confers+resistance+to+siderophore-mediated+killing+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1821-1826 (2015).</li>
<li>Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+PA14+pathogenesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).</li>
<li>Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine%2C+a+siderophore+from+Pseudomonas+aeruginosa%2C+translocates+into+C.+elegans%2C+removes+iron%2C+and+activates+a+distinct+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response.</a> Virulence. , 1-41 (2018).</li>
<li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+C.+elegans+daf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921(2003).</li>
<li>Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bZIP+transcription+factor+zip-2+mediates+an+early+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 2153-2158 (2010).</li>
<li>Tjahjono, E., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+mitochondrial+surveillance+pathway+is+required+for+defense+against+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Genetics. 13 (6), e1006876(2017).</li>
<li>Moy, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (27), 10414-10419 (2006).</li>
<li>Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((daf-16+protects+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+during+food+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journals+of+Gerontology.+Series+A%2C+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation.</a> The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).</li>
<li>Beanan, M. J., Strome, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+germ-line+proliferation+mutation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans.</a> Development. 116 (3), 755-766 (1992).</li>
</ol>

Yazarlar onlar ifşa etmek yok çatışmalarını var bildirin.

Bu tahlil (veya benzer deneyleri P. aeruginosa veya E. faecalistiriçin diğer patojenleri nerede yerine) amaçlı ilaç keşfi de dahil olmak üzere, çeşitli için yararlı olur. Virülans faktörleri, konak savunma yolları, aydınlatma belirlenmesi ve düzenleyici makine ana bilgisayar-patojen etkileşimde yer alan ilgili belirleme gibi temel biyolojik soru ele almak için yararlıdır.
P. aeruginosa sıvı öldürme tahlil sağlam olsa da, nerede dikkat başarısızlık olasılığını en aza ...

Şimdi neredeyse bir yüzyıl önce liderliğindeki bir dönüm noktası an kamu sağlığı için kimlik ve etkili, geniş spektrumlu antibiyotikler, yaygın inanç bu bulaşıcı olduğu yere hastalığı belası geçmiş olurdu. Kısa birkaç on yıl içinde bu iyimserlik, küçülmek patojen bu bir kez mucizevi tedaviler sınırlı direnç mekanizmaları geliştirilen sonra patojen başladı. Bir süre için ilaç bulma çabaları ve patojenler arasındaki silahlanma yarışı dengeli görünüyordu. Ancak, antimicrobials suistimal son zamanlarda Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescensve P. aeruginosa1pan-ilaca dirençli suşların ortaya çıkması içinde sonuçlandı, 2,3,4.
P. aeruginosa ciddi yanıklar, immün veya kistik fibrozis var olan hastalar için ciddi bir tehdit olan bir fırsatçı, gram negatif, birden çok ana bilgisayar patojen var. Bu da giderek şiddetli Nozokomiyal Enfeksiyonlar, özellikle antimikrobiyal direnç www.cdc.gov/devam eden onun edinimi nedeniyle bir etken olarak tanımlanmaktadır. Bu tehdide yönelik olarak başlamak için iyi belgelenmiş C. elegans-P. aeruginosa enfeksiyon sistem5kullandık. Laboratuarımızın ana bilgisayar6öldürmek için yetenek patojenin sınırlamak roman bileşikler tanımlamak için bir sıvı tabanlı, yüksek üretilen iş, yüksek-içerik filtreleme platform geliştirmek için bu sistemi kaldıraçlı. Çoğu intriguingly konularda, bu bileşiklerin antimicrobials7 ve virülans inhibitörleri8de dahil olmak üzere en az üç genel kategoride için ait gibi görünüyor. C. elegans diğer yüksek içerikli ilaç keşif deneyleri bildirilmiştir Mycobacterium tuberculosum, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Listeria Monositogenez, FRANCISELLA tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, için ve Enterococcus faecalistir, diğerleri arasında9,10,11,12,13,14,15,16. Bu tür deneyleri hem ev sahibi ve patojen, kimyasal bir ekran ve sayısı ötesinde tanımlama yeteneği ile karşılaştırıldığında bioavailability olasılığı arttı toksik olabilir yanlış pozitif sayısı sınırlama gibi birkaç iyi tanınan avantajlara sahip Sadece sınırlayıcı mikrobiyal büyüme, anti-virulents, bağışıklık uyarıcı molekülleri veya aksi takdirde lehine eski ev sahibi-patojen etkileşimin denge tilt bileşikleri gibi. Ayrıca, bu ekranlar keşfetti bileşikler kez memeli konaklarda etkilidir.
En az iki başka deneyleri17,18 C. elegans yüksek üretilen iş ekranları sıvı içinde yürütmek kullanılabilir fazlalaştı. Ancak, bu deneyleri herbiri sıvı içinde gerçekleştirilecek yavaş-öldürme olarak, bilinen prototip kolonizasyon bağırsak tahlil sağlar bir değişiklik olduğunu üretilen işi artırmak ve bileşikleri daha kolay taranması izin. Dikkatli karakterizasyonu kesin bakteriyel virülans mekanizmalarının bu deneyleri ve bizim sıvı tabanlı ekran7arasında farklı olduğunu göstermiştir. Bu yana virülans her iki tür memeli sistemlerinde gözlenir, hangi virülans belirleyici tahlil seçim öncesinde deneyci'nın çıkarları için en uygun dikkate almak önemlidir.
Burada biz sıvı tabanlı en iyi duruma getirilmiş bir sürümünü göstermek C. elegans-P. aeruginosa tahlil. Biz de gram-pozitif bakteri patojen karşılamak için bizim sıvı tabanlı tahlil yöntemi uyarlaması rapor Enterococcus faecalistir. P. aeruginosagibi E. faecalistir giderek antimikrobiyal direnç yolları1büyüyen bir silah ile bir ciddi nozokomiyal tehdit olarak tanımlanır. E. faecalistir ile yüksek-den geçerek taranması için önceki bir yöntemi14bulunmaktadır ancak preinfection yordamı olmak zordur ve ekipman COPAS FlowSort gibi bulaşıcı olasılığını artırır patojen ile gerektirir. Bizim protokol güvenlik profili artırma yükleyemeyebileceğini gereksinimini ortadan kaldırır. Son olarak, biz hangi tarafından bu deneyleri birini RNAi, kurulması, içinde bir rol ana faktörleri için Kullanıcı aramak için izin veya direnç, enfeksiyon besleme ile kombine edilebilir bir araç raporu.

<table><tbody><tr><td>COPAS FP BioSorter</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td>Büyük nesne akış sitometresi/solucan sıralayıcısı</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EL406 Yıkayıcı Dispenseri</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 Derin Kuyu RB Blok</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CS15124</td><td></td></tr><tr><td>384 Kuyulu plaka</td><td>Greiner Bio-One</td><td>MPG-781091</td><td></td></tr><tr><td>Nematod Büyüme Ortamı (NGM)</td><td></td><td></td><td>Litre başına miktar: 18 gram agar, 3 gram NaCl, 2.5 gram Pepton, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Fosfat tamponu ve 973 mL mili-Q su</td></tr><tr><td>Yavaş Öldürme (SK) plakaları</td><td></td><td></td><td>Litre başına miktar: 18 gram agar, 3 gram NaCl, 3.5 gram Pepton, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Fosfat tamponu ve 973 mL mili-Q su</td></tr><tr><td>Yavaş Öldürme (SK) ortamı</td><td></td><td></td><td>Litre başına miktar:&nbsp; 3 gram NaCl, 3.5 gram Pepton, 1 mL CaCl<alt>2 </alt>(1 M), 1 mL MgSO<alt>4</alt> (1 M), 25 mL Fosfat tamponu ve 973 mL mili-Q su</td></tr><tr><td>Lizojeni Suyu (LB)</td><td>USBiolojik Yaşam Bilimleri</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>Brian Kalp İnfüzyon suyu (BHI)</td><td>Araştırma Ürünleri International Corp</td><td>50-488-526</td><td></td></tr><tr><td>Solucan Ağartıcı Çözeltisi</td><td></td><td></td><td>100 mL başına miktar: 10 mL 5 M NaOH çözeltisi, 20 mL% 5 Sodyum Hipoklorit Çözeltisi ve 70 mL steril su</td></tr><tr><td>Litre başına S Bazal</td><td></td><td></td><td>Miktarı: 5.85 gram NaCl, 6 gram KH2PO 4, 1 gram K < alt > 2 HPO4, ve 1 Litre mili-Q su</td></tr><tr><td>Agar</td><td>USBiolojik Yaşam Bilimleri</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>USBiolojik Yaşam Bilimleri</td><td>S5000</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>USBiolojik Yaşam Bilimleri</td><td>P3300</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>USBiolojik Yaşam Bilimleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Litre başına fosfat tampon</td><td></td><td></td><td>miktarı: 132 mL K2HPO4 (1M) ve 868 mL KH2PO4 (1M)</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Acros Organics</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO<>sub4</td><td>USBiolojik Yaşam Bilimleri</td><td>P5100</td><td></td></tr><tr><td>%5 Sodyum Hipoklorit Çözeltisi</td><td>BICCA</td><td>7495.5-32</td><td></td></tr><tr><td>NaOH çözeltisi</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Nefes Almayı</td><td>Kolaylaştıran Çeşitlendirilmiş Biyoteknoloji</td><td>BEM-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Turuncu Nükleik Asit Lekesi</td><td>Fisher</td><td>Scientific S11368</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Bakteriyel Suşlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P. aeruginosa (PA14)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. faecalis(OG1RF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli süper gıda (OP50)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli RNAi eksprese eden bakteriler (HT115)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Solucan Suşları </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glp-4(bn2) (Beanan ve Strome, 1992, PMID: 1289064)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PINK-1::GFP muhabiri (Kang vd., 2018, PMID: 29532717)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

yüksek işlem hacmi, yüksek-içerik, sıvı tabanlı c. elegans pathosystem

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Belirlenen yeni uyuşturucular sayısı tarafından geleneksel, vitro ekranları kaybeder, bu yaklaşım başarı çoklu ilaç direnci mücadele etmek yeni bir silah için arama azaltmak. Bu araştırmacılar sadece yeni ilaçlar bulmak gerekir mi ama aynı zamanda onları bulmak için yeni yollar geliştirmek zorundayız sonuca neden olmuştur. Arasında en umut verici aday yöntemleri bütün organizma, vivo içinde bu kullanım yüksek üretilen iş, fenotipik dökümanları deneyleri ve Caenorhabditis elegans arasında değişen Danio rerioiçin ev sahipliği yaptı. Bu ana bilgisayarlar ana bilgisayar ve/veya biounavailable toksik bileşikler genellikle ilk ekranında, pahalı takip önce yukarıya bırakılır dramatik indirimleri yanlış pozitif hits içinde dahil olmak üzere birkaç güçlü avantajlara sahip.
İşte nasıl bizim tahlil iyi belgelenmiş C. elegansana bilgisayar varyasyon sorguya çekmek için kullanılan göstermektedir —Pseudomonas aeruginosa sıvı öldürme pathosystem. Biz de dışarı iyi çalışan bu tekniğin çeşitli uzantıları göstermek. Örneğin, plaka biçimleri sorgu ana faktörler bu konak-patojen etkileşim içinde yüksek-den geçerek genetik ekranlar RNAi 24 - veya 96-da kullanarak gerçekleştirmek edebiliyoruz. Bu tahlil kullanarak, tüm genom ekranlar dramatik potansiyel ezelî belgili tanımlık lüzum için zahmetli biyokimyasal arıtma yaklaşımlar uyuşturucu hedefler belirleme görevini basitleştirebilirsiniz sadece birkaç ay içinde tamamlanabilir.
Biz de gram-pozitif bakteri Enterococcus faecalistir Ayagin Gram-negatif patojen P. aeruginosaiçin yerine koyar bizim Yöntem bir varyasyon rapor. Çok P. aeruginosaiçin olduğu gibi E. faecalistir öldürerek zamana bağımlı. Aksine önceki C. elegans—E. faecalistir deneyleri, bizim tahlil E. faecalistir preinfection gerektirmez, onun Emanet profil iyileştirilmesi ve sıvı işleme aygıtları kirletici şansını azaltır. Tahlil ~ %95 ölüm oranları 96 h sonrası enfeksiyon gösterilen son derece sağlamdır.

Tahlil performansı için önemli parametreler
Bu tahlil temel biyoloji uygun bir anlayış tahlil en iyi duruma getirme ve sorun giderme için gereklidir. Bu amaçla, ilk birkaç anahtar gazetelere P. aeruginosapatogenezinde mekanizmaları elucidating havale-sıvı7,20dakika sonra öldürme aracılı. Yukarıda özetlenen adımları (bkz. Şekil 1</st...

Burada bir uyarlanabilir, tüm ana bilgisayar, ana bilgisayar-patojen etkileşimleri çalışma ve ilaç keşfi için kullanılması için kullanılması gereken yüksek içerik tarama aracı bir protokol açıklayın.

Yüksek işlem hacmi, yüksek-içerik, sıvı tabanlı C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Bu yöntem, konak patojen etkileşimi ve ilaç keşfinde, çeşitli virülans faktörlerinin önemi ve küçük moleküllerin oluşumla iyileşme yeteneği gibi soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, küçük hacimlerle sıvı bir formatta gerçekleşmesidir. Başlamak için, bir BSL 2 biyogüvenlik kabini içinde çalışırken, P.aeruginosa'yı donmuş bir stoktan bir LB Agar plakasına çizin.Plakayı 37 ° C'de 16 ila 24 saat inkübe edin, ardından plakayı bir haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın. Tahlil plakalarını kurmadan iki gün önce, üç ila beş mililitre steril LB suyunu aşılamak için plakadan tek bir koloni kullanın. Kültürü 37 santigrat derecede 12 ila 16 saat inkübe edin.Yavaş öldürme veya SK ortamını metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, 350 mililitre p. Aeruginosa ile taze gece LB kültüründen, her 10 santimetrelik SK plakasını tohumlayın. Bakterileri eşit şekilde yaymak için steril bir bakteri yayıcı kullanın ve plakaların biyogüvenlik kabininde kurumasını bekleyin.Ardından, plakaları 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Birden fazla RNAi bakteri suşunu, 24 kuyu derinliğinde bir kuyu plakasının tek bir oyuğunda paralel olarak test etmek için, önceden hazırlanmış RNAi içeren bakterilerin her bir klonundan tek bir koloniyi dört mililitre karbenisilin takviyeli LB'ye aşılayın. Plakaları, 16 saat boyunca 37 santigrat derece ve 950 rpm'de çok kuyulu plakalar için optimize edilmiş bir çalkalama inkübatörüne yerleştirin, ardından bakterileri 5 dakika boyunca 2.000 g'da santrifüjleme ile toplayın. Plakayı ters çevirerek ve kuvvetlice sallayarak süpernatanı boşaltın.100 mikrolitre S Bazal kullanarak RNAi bakterilerini yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse edilen bakterileri, IPTG ve karbenisilin ile desteklenmiş çok kuyulu bir NGM plakasının uygun sayıda kuyucuğuna pipetleyin ve plakanın kurumasını bekleyin. L1 solucanlarını metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, RNAi veya OP50 süper gıda ile tohumlanmış 10 santimetrelik plaka başına yaklaşık 5.000 solucan pipetleyerek temel deneyler için plakalar hazırlayın.Bir RNAi ekranı için kurulum yapmak için, RNAi ile tohumlanmış 24 oyuklu bir plakada oyuk başına yaklaşık 300 solucan pipetleyin. Kullanılan suş sıcaklık açısından steril ise, solucanları yaklaşık 16 saat boyunca 15 santigrat derecede inkübe edin ve daha sonra gelişimi tamamlamak ve embriyogenezi önlemek için 44 saat boyunca 25 santigrat dereceye aktarın. Bir sıvı öldürme testi yapmak için, P.aeruginosa'yı bir SK plakasından çıkarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın ve bakterileri yaklaşık 5 mililitre S. Bazal'da yeniden süspanse edin.Bir spektrofotometre kullanarak bakteri süspansiyonunun OD 600'ünü ölçer. 09'a eşit bir OD 600'de S.Bazal'da 24 mililitre seyreltilmiş P.Aeruginosa stoğu hazırlayın, ardından 21 mililitre sıvı SK ortamı ekleyin ve çok kanallı bir pipet kullanarak, 384 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 45 mikrolitre bakteri ve ortam aktarın. Solucanları kaynağından 50 mililitrelik konik bir tüpe yıkayın ve yerçekimi kuvveti altında yerleşmelerine izin verin.Süpernatanı 5 mililitreye aspire edin, ardından solucanları yeniden süspanse etmek için toplam 50 mililitre S.Basal kullanın ve yıkamayı iki kez daha tekrarlayın. Bir solucan sıralayıcı kullanarak, metin protokolüne göre 384 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna yaklaşık 22 solucan sıralayın, ardından plakayı kapatmak için gaz geçirgen bir film kullanın ve 24 ila 48 saat boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin. İstenilen zamanda, 384 kuyulu plakayı toplam 5 kez yıkamak için bir mikroplaka yıkayıcı ve S.Basal kullanın.Yapılması en kolay hatalardan biri, solucanlar tamamen yerleşmeden önce 384 kuyulu plakayı aspire etmektir. Solucanların tamamen yerleşip yerleşmediğini doğru bir şekilde görmek pratik gerektirir. Son yıkamadan sonra, süpernatanı 20 mikrolitreye kadar aspire edin.Ardından, 0.7 mikromolar nihai konsantrasyon için oyuk başına 50 mikrolitre 98 mikromolar nükleik asit boyası ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında 12 ila 16 saat inkübe edin. İstenen inkübasyon süresinden sonra, plakaları en az üç kez yıkamak için mikroplaka yıkayıcıyı kullanın.Bir veri toplama için, hem iletilen ışığı hem de floresansı görüntülemek için bir spektrofotometre veya otomatik bir mikroskop kullanın. Kuyucuk başına 300 solucan içeren 24 oyuklu bir plakanın oyuğuna bir mililitre S Basal ekleyin. Plakayı sallayarak solucanları nazikçe çalkalayın, ardından solucanları boş, steril 24 derin kuyulu bir plakaya aktarın.Solucanların yerçekimi ile yaklaşık beş dakika yerleşmesine izin verin. Süpernatanı aspire edin, oyuk başına yaklaşık bir mililitre bırakın, ardından her oyuğa 7 mililitre S Bazal ekleyin. Yıkamayı iki kez daha tekrarlayın ve son yıkamadan sonra yaklaşık 400 mikrolitre süpernatan hariç hepsini aspire edin.Açlıktan ölmemek için bakterileri 384 oyuklu plakaya pipetledikten sonra, solucan sıralayıcının yeniden örnekleyici işlevini kullanarak 384 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 22 solucan sıralayın. Son olarak, sıralamayı takiben, küçük moleküller veya deneye özel diğer malzemeleri ekleyin. Bu grafikte gösterildiği gibi, bu videoda özetlenen adımlar izlendiğinde, C.elegans'ın zamana bağlı bir ölümü yalnızca P.aeruginosa'nın varlığında gözlemlenecektir.Buna karşılık, temel bakteriyel besin takviyelerinin yokluğunda, çok az veya hiç öldürme gözlenmeyecektir. Burada gösterildiği gibi, P.aeruginosa'nın 37 santigrat derecede ve daha sonra 25 santigrat derecede iki aşamalı inkübasyonu, geleneksel yavaş öldürme deneyleri için kritik olan ve başlangıçta sıvı öldürmede uygulanan, bu tahlilde vazgeçilebilir. Protokol, 0025'e eşit bir OD 600 kadar düşük bir seviyeden çok çeşitli başlangıç bakteri konsantrasyonlarını tolere eder ve zamanlama değişse de yine de zamana ve konsantrasyona bağlı öldürme sergiler.Ek olarak, istatistiksel olarak anlamlı veriler elde etmek için genellikle dört kuyu kadar az yeterlidir. İşlemenin faydasına bir örnek, sinyal-gürültü oranı yüksek olduğunda burada gösterilmiştir, bu örnekte olduğu gibi, analiz basittir ve pozitif ve negatif koşullar arasında ayrım yapmak önemsizdir. Bu durumlarda, zayıf isabetler bile kolayca tespit edilebilir.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, sıralama dahil değil, 384 oyuklu plaka başına yaklaşık 60 ila 75 dakikalık el zamanında gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, tüm bileşenleri medyanıza eklemeyi unutmamak çok önemlidir, aksi takdirde virülans tehlikeye girer. Bu test, konak patojen araştırmalarında ilaç keşfine tüm organizma fenotipine dayalı taramanın uygulanmasını basitleştirir.Bu videoyu izledikten sonra, sıvı bazlı C elegans patogenez testlerinin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedür, P.Aeruginosa için E.Faecalis gibi diğer patojenlerle ikame edilerek değiştirilebilir ve diğer bakteriyel enfeksiyonlar için tedavi arayışını kolaylaştırır. P.Aeruginosa veya E.Faecalis gibi bulaşıcı bakterilerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın.Bu prosedür uygulanırken her zaman uygun eğitim, iyi kişisel koruyucu ekipman ve uygun teknik gibi uygun önlemler alınmalıdır.

a-high-throughput-high-content-liquid-based-c-elegans-pathosystem

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Sıvı tabanlı kültür ve dağıtımı için bir...

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

Nicel ve Otomatik Yüksek throughput Genom çapında RNAi Ekranlar C. elegans</em

Araştırmacılar, solucanların algıladığı ve tepki verdiği bir elektrik alanı uygulayarak C. elegans'ta isteğe bağlı hareketi tetikleyebilir. Bu videoda elektrotaktik davranış tanıtılır ve mikroakışkan bir cihazda yapılan örnek bir protokol gösterilir.

Elektrotaksi Deneyi: C. elegans'ta Hareketi Gözlemlemek İçin Bir Yöntem

Kaynak: Anderson, Q. L. ve diğerleri. Yüksek verimli, Yüksek içerikli, Sıvı bazlı bir C. elegans Patosystem. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, konakçı-patojen etkileşimleri sırasında gen yıkımlarını incelemek için Caenorhabditis elegans kullanan yüksek verimli bir tarama yöntemini göstermektedir. Patojen kaynaklı solucan öldürmenin etkilerini değerlendirmek için devrilme solucanlarının hazırlanması ve bunların tahlil plakalarına aktarılması prosedürünü özetlemektedir.

C. elegans Knockdown'ların Taranması için Çok Kuyulu Sıvı Bazlı Bir Test

Kaynak: Anderson, Q. L., ve diğerleri. Yüksek verimli, Yüksek içerikli, Sıvı bazlı bir C. elegans Patosystem. J. Vis. Uzm. (2018)Video, genetiği değiştirilmiş C. elegans larvalarının bir mikroplakada patojenik bakterilere maruz bırakıldığı sıvı bazlı bir testi göstermektedir. Ortama salgılanan bakteriyel toksinler, konakçı stresine ve ölümüne neden olur. Bir floresan boya, ölü solucanları boyayarak, genetik duyarlılığı veya direnci değerlendirmek için görüntülemeye dayalı ölüm oranının...

C. elegans Larvalarında Patojenik Bakteri Kaynaklı Mortalitenin Değerlendirilmesi

Biz solucan amylopathies yönlerini incelemek için yöntemler...

Bir<em&gt; Caenorhabditis elegans</emAmylopathy Çalışmaları&gt; Model Sistemi

Germ hattı toksisitesini değerlendirmek için kullanılan nematod Caenorhabditis elegans'ta yüksek verimli bir kimyasal testin ayrıntılı adımlarını açıklıyoruz. Bu tahlilde, kimyasal maruziyeti takiben germ hattı fonksiyonunun bozulması, anöploid embriyolara özgü bir floresan raportör kullanılarak izlenir.

Nematod kullanma Germline Kimyasal zehirlilik Kapsamlı Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Bu çalışma, embriyogenezin 80-100 C.'de eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesine olanak tanıyan yarı-yüksek iş letme protokolünü açıklamaktadır. Ayrıca, veri çözümlemesi kolaylaştırmak için görüntü işleme ve görselleştirme araçları dahildir. Bu yöntemlerin özel muhabir suşları ile birleşimi embriyogenezin ayrıntılı olarak izlenmesini sağlar.

C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

Burada, Caenorhabditis elegans'taki test bileşiklerinin poliglutamin agregasyonu, nöronal ölüm ve kemoavoidans davranışı dahil olmak üzere nöroprotektif aktivitelerini ve çoklu fenotiplerin örnek bir entegrasyonunu değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz.

Poliglutamin aracılı nörotoksisiteye karşı biyoaktif bileşiklerin keşfedilmesi için bir model sistem olarak Caenorhabditis elegans

Bu protokol, tüm embriyonik sonrası gelişim boyunca mikroakışkan tabanlı C. elegans hızlandırılmış görüntülemeyi tanımlar.

Tüm larva aşamalarında yüksek çözünürlüklü C. elegans görüntüleme

Burada, geniş alan mikroskobu görüntülerinde tek tek solucanların otomatik segmentasyonu için geliştirdiğimiz bir derin öğrenme sistemi olan SegElegans'ın daha sonra ImageJ gibi görüntü analiz yazılımlarında kullanılmak üzere etkin bir şekilde kullanılmasına ilişkin talimatlar sunuyoruz. Sistemi hem çevrimiçi hem de çevrimdışı kullanmanın yollarını sunuyoruz.

SegElegans Kullanarak C. elegans Floresan Görüntülerinin Otomatik Analizi

Keşfedin, C. elegans ve P. aeruginosa kullanarak sıvı tabanlı yüksek içerikli tarama ile konak-patojen etkileşimlerini ve ilaç keşfini. Bu yöntem, virülans faktörlerini ve küçük molekülleri değerlendirir.

Yüksek işlem hacmi, yüksek-içerik, sıvı tabanlı C. elegans Pathosystem

Daha fazla video keşfet